番木瓜环斑病毒CP基因dsRNA原核表达载体的快速构建

重点介绍了一种快速构建dsRNA原核表达载体的方法。以番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因（PRSV-CP）3＇端-279 bp保守区段为基础,通过OZ-LIC法构建861 bp,432 bp和279 bp 3种不同长度的发卡结构,再通过XhoⅠ和ClaⅠ双酶切,将其连接到pSP73原核表达载体上,构建成PRSV-CP基因dsR...     

源于马铃薯Y病毒CP基因的dsRNA原核表达及提取

以马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)为基础构建了含PVY CP基因3’端253bp反向重复片段的双链RNA(dsRNA)原核表达载体,并转化大肠杆菌HT115(DE3),经IPTG诱导产生dsRNA,用LiCl沉淀法提取,获得了高质量的dsRNA。     

高效靶向降解烟草花叶病毒核酸的dsRNA筛选与大量制备

[目的]筛选高效靶向降解烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)的dsRNA,实现其大量制备,并探究其作用机制.[方法]以TMV编码的CP、MP、RdRP功能基因为靶序列,体外转录合成相应的dsRNA,浸润本氏烟(Nicotiana benthamiana),24 h后接种TMV,于接毒后2、3...     

小西葫芦黄花叶病毒dsRNA的原核表达及其对ZYMV的防治效果

【目的】小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)是危害西瓜最为普遍的病毒,在西瓜上利用外源喷施病毒基因dsRNA的方法实现对ZYMV的预防和治疗。【方法】首先以实验室已有的ZYMV病毒序列为依据,针对其不同的基因片段,利用NCBI数据库找出与其相似的序列。随后利用软件DNAMAN8对序列进行多重比对分析,找出其保守区域,根据分析结果选择长度介于200—350 bp的ZYMV 3′UTR、6K2、HC-Pro、P3、NIb 5个基因片段,同时选择长度为190 bp的GUS基因片段作为对照。PCR扩增得到这6个片段后,利用同源重组的方法将它们插入到含有双T7启动子的L4440载体中,并利用RNAⅢ酶缺陷型大肠杆菌HT115建立原核表达系统生产dsRNA,采用超声波破碎的方法释放dsRNA,利用TE(10 mmol·L^-1 Tris-HCl和1 mmol·L^-1 EDTA)缓冲液溶解dsRNA,最后比较和分析IPTG使用浓度、诱导时间以及超声波破碎时间对dsRNA表达和释放的影响。在西瓜植株上采用喷施...     

猪CR YAB基因原核表达载体的构建及表达条件的优化

将猪CRYAB基因cDNA连接到原核表达载体pRSET A中,构建重组表达质粒pRSET A-CRYAB,经酶切和测序鉴定后,转入表达宿主大肠杆菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表明,如期获得了重组蛋白的表达,其主要以包涵体的形式存在,且最佳条件为诱导温度25℃,时间15h,IPTG浓度为0.2 mmol/L.     

犬传染性肝炎病毒Hexon基因原核表达条件的优化与表达蛋白的活性

[目的]为了提高犬传染性肝炎Hexon蛋白基因在大肠杆菌中的表达量,研究Hexon基因蛋白的最佳表达条件和表达蛋白的活性.[方法]在大肠杆菌菌株BL21(DE3)培养过程中,选择诱导剂(IPTG)的最佳加入时间、诱导剂(IFTG)浓度、诱导时间以及不同温度条件观察对Hexon融合蛋白表达的影响,以确定最佳表达条件,并用Westem-blot检测重组蛋白的生物活性.[结果]大肠杆菌BL21(DE3)在37℃培养2.25h后,添加终浓度为2.0 mmol/L的IPTG,27℃培养8 h,Hexon重组蛋白表达量最高(1.67mg/mL),所表达的重组蛋白能与犬传染性肝炎阳性血清相结合.[结论]在高浓度IPTG诱导和冷培养条件下,Hexon蛋白基因的表达量最高,表达出的重组蛋白具有很好的反应原性,为进一步研究六邻体蛋白的作用机理及亚单位疫苗的研究提供了实验基础.     

卡拉库尔羊TNF-α基因原核表达载体的构建及表达条件优化

利用反转录PCR (RT-PCR)技术扩增卡拉库尔羊肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因,连接到pET-28b载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),在不同的IPTG浓度、时间、温度条件下诱导TNF-α的表达.结果表明,原核表达栽体pET-28b-TNF-α构建成功,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,优化的诱导表达条件为诱导温度37℃、诱导时间4h、IPTG浓度1.0 mmol/L.     

草鱼MyoD基因原核表达研究

采用PCR方法对草鱼MyoD基因开放阅读框进行了改造扩增,构建了草鱼MyoD基因的原核表达载体pBV 220-M yoD,并进行了初步的原核表达研究。结果表明,构建的原核表达载体pBV 220-M yoD含有草鱼My-oD基因完整的开放阅读框;该原核表达载体表达产物的相对分子质量为34 ku,其表达产物占全菌蛋白的10.8%,表达量较低。     

广西眼镜蛇神经毒素的原核表达

利用拼接PCR法从广西眼镜蛇基因组DNA中获得CT成熟肽序列,序列分析显示,广西眼镜蛇与其他地区眼镜蛇的CT基因成熟肽序列具有较高的同源性,同时成功构建了pET30 a(+)-CT原核表达载体;研究结果表明,利用拼接PCR的方法能有效拼接两个外显子序列,广西眼镜蛇CT基因具有较高的保守性,CT基因可在大肠杆菌中表达。     

拟南芥AtCpNifS克隆及其原核表达

从哥伦比亚生态型拟南芥(Arabidopsis thaliana ecotype Columbia)中克隆了AtCpNifS的完整CDS序列。通过测序和序列比对分析,确认了克隆序列的完整性和正确性。在此基础上,构建了该基因的原核表达载体(BL21-pET28-AtCpNifS),并从该质粒中成功分离了表达蛋白(AtCpNifS)。     

番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白基因dsRNA载体的构建及其表达

将中国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)外壳蛋白基因(coat protein CP)同源的部分片段双链RNA重组至植物表达载体pBIN19,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404导入本氏烟(Nicotiana benthamiana).PcR筛选表明,目的片段已整合至转基因植株的基因组DNA中,引起与其同源的基因发生沉默,从而可抑制病毒复制,达到抗该病毒的目的,为防治这类病毒病害提供了新的可能.     

草莓植株中病毒dsRNA的分离和鉴定

 【目的】病毒核酸分离是病毒基因组解析的基础，本研究旨在建立草莓病毒的dsRNA分离方法，获得草莓主要病毒的部分基因组序列。【方法】采用改进的dsRNA分离方法，对草莓病毒指示植物和栽培品种中的病毒dsRNA进行分离，通过琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR来鉴定。【结果】不同草莓品种中病毒dsRNA的含量不同，试管苗叶片中dsRNA含量高于露地苗幼叶，而露地苗幼叶中dsRNA含量明显高于完全成熟叶。dsRNA对DNase Ⅰ具有很强的耐性；当酶解缓冲液中含0.5 mol·L-1 NaCl时，dsRNA对RNase A具有较强的耐性。利用DNA凝胶回收试剂盒，能够有效回收凝胶中的dsRNA片段。应用RT-PCR技术，从凝胶回收的dsRNA及DNase Ⅰ/RNase A两酶酶解处理后的dsRNA中分别扩增出草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒的特异片段。【结论】建立了从草莓植株中分离和鉴定病毒dsRNA的完整技术体系，为草莓病毒中国分离物的基因组解析奠定了重要基础。     

双链RNA技术与植物病毒研究

 90%以上的植物病毒基因组是RNA。含RNA基因组的病毒会产生特异的双链RNA（dsRNA）。从受到病毒侵染的植物组织中提取病毒相关的dsRNA，进行病毒的检测和分类，诊断植物病毒病，探索生物防治植物病毒病的新途径，是植物病毒研究的重要内容。本文就双链RNA技术在植物病毒研究中的应用做一综述。     

用植物病毒载体表达小球状病毒抗原蛋白的研究

将引起人类腹泻主要病原物小球状病毒(Small round structured virus;SRSV)编码抗原蛋白基因的全长序列1605bp,导入来自三叶草黄脉病毒(Clover yellow vein virus;ClYVV)侵染性全长cDNA克隆的侵染性植物病毒表达载体pClYVV/CP/W基因组的NIb/CP基因之间,构建了重组病毒克隆pClYVV-NV1.6。用上述重组病毒克隆接种蚕豆植物,表现了与野生型ClYVV相同的症状。从发病叶中提取总RNA,用反转录PCR(RT-PCR)对上述重组病毒克隆的转录进行了检测,结果表明,外源基因在F4子代病毒基因组中仍然稳定存在。从发病叶中提取总蛋白,用酶联免疫吸附分析(Enzyme-linked immunosorbent assay;ELISA)及蛋白质杂交(Western blotting;WB)对上述重组病毒克隆表达的目的基因产物抗原蛋白进行了测定,结果表明,重组病毒克隆pClYVV-NV1.6之目的基因产物的表达量随寄主植物发病后时间的推移而变化,最大表达是在寄主植物发病后第9天,最大表达量为每克鲜叶可表达160.00μg,这一研究结果为用植物生产抗SRSV口服疫苗提供了有力的基础。     

马铃薯不同级别脱毒种薯病毒再侵染情况及产量变化

通过对大西洋原原种、一级原种、二级原种、一级种薯和二级种薯的生产试验及其PVX、PVY、PVS、PLRV病毒的DAS-ELISA检测,结果表明,从原原种到一级种薯的生产过程中,产量随着脱毒种薯代数的增加而升高,其中以二级原种生产一级种薯的增产幅度最显著;除原原种不带以上4种病毒外,一级原种、二级原种分别带3%、13.3%的PVS病毒,一级种薯带PLRV和PVS病毒,带毒率分别是5.8%、21%,二级种薯带PVY、PVS、PLRV病毒,带毒率分别是8.9%、30%、13%.     

马铃薯类病毒与马铃薯Y病毒的互作及其对马铃薯产量的影响

分别在温室和田间条件下利用人工接种的方法研究了PSTV和PVY在克新4号品种上的相互作用。试验结果表明:在温室条件下PSTV和PVY的复合接种能在克新4号上产生条型坏死症状,而在田间未出现明显症状。PSTV与PVY混合接种或PSTV接种一周后再接PVY会促进PVY增殖,植株内PVY的浓度显著高于单独接种PVY,但PVY侵染后再接PSTV对PVY的浓度无显著影响。PSTV和PVY的互作对PSTV的浓度无显著影响。PSTV与PVY复合侵染的3个接种类型都明显地降低平均单株产量和商品薯率,产量损失最大的处理为PSTV与PVY混合接种,可导致克新4号减产45.4%。