哺乳动物生殖细胞的性别决定

生殖细胞从未成熟阶段发育到成熟阶段有2个主要的细胞命运决定:进行减数分裂时间的决定和分化为精子还是卵子的决定,这2个决定是密切偶联的。主要阐述了哺乳动物生殖细胞性别决定的分子机制以及减数分裂在生殖细胞性别决定中的作用机制。     

鱼类原始生殖细胞与鱼类性别分化的关系

在鱼类的性别分化中,原始生殖细胞在雌雄二性中的增殖方式不同,而且在部分鱼类中原始生殖细胞的缺失能导致其发育为单一雄性表型。在此过程中,生殖细胞的特有基因vasa的剪接变体的二态性分布与鱼类原始生殖细胞的分化关系密切。     

拟南芥减数分裂重组发生的遗传学研究

减数分裂是有性生殖物种世代交替的转折点,而减数分裂过程中发生的遗传重组则是遗传变异的源泉,并为有性生物的进化提供了推动力。现已发现许多基因在重组过程中起重要作用。由于重组蛋白的高度保守性,反向遗传学为研究植物重组蛋白的性质及作用提供了充分的证据。本文就近年来对模式植物拟南芥减数分裂中的DNA双链断裂形成与修复以及同源染色体重组交换等重要事件及其相关基因的功能进行了概述,尤其对ZMM家族蛋白在遗传重组中的作用进行了重点介绍。     

诱导多能干细胞体外定向分化为雄性生殖细胞研究进展

诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS）是借助基因导入技术将某些转录因子导入人或动物的体细胞,使体细胞重编程而得到的多能性细胞。iPS细胞来源丰富,研究表明利用不同的载体诱导系统或不同的转录因子组合,多种体细胞都可被重编程为iPS细胞,如成纤维细胞、肝细胞、角质细胞及脐带血细胞等。作为干细胞中新的一员,iPS细胞在克隆形态、基因表达模式、表面标志物、拟胚体形成、畸胎瘤及嵌合体形成（小鼠）、分化能力等方面与胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESC）非常相似。与胚胎干细胞一样,在特定的诱导条件下,iPS细胞在体外可被诱导分化为多种细胞,如心肌细胞、血细胞、生殖细胞等,进一步拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离,iPS细胞也成为细胞治疗及组织器官再生最有前景的种子细胞,在细胞替代性治疗、发病机理研究及新药筛选方面具有潜在价值。雄性不育不仅影响人类正常健康生活,对畜牧业的发展也极为不利。国内外的研究成果表明,给予适当的诱导物及诱导条件,人和小鼠的iPS细胞体外可被诱导分化为原始生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）、精子细胞及其前体细胞。这些研究不仅避免了胚胎干细胞研究领域存在的取材困难、免疫排斥和伦理道德等问题,还为揭示雄性生殖细胞的发育机制及研究雄性不育提供了较好的研究平台。由人iPS细胞诱导得到的雄性配子可为患者提供自身的雄性配子产生后代,避免了免疫排斥问题,为未来治疗雄性不育带来曙光。iPS细胞体外诱导分化技术对现代畜牧业发展也具有巨大的潜在应用价值,可进行转基因动物的生产。现从不同的诱导剂、不同的培养条件及iPS细胞体外诱导分化优势等方面,对iPS细胞体外定向诱导分化为雄性生殖细胞的研究进展及应用前景进行综述和展望。     

牛原始生殖细胞的分离与培养

从4～15周龄的牛胎儿生殖嵴中分离得到牛原始生殖细胞,以STO(一种建系的小鼠胎儿成纤维细胞)及MEF(小鼠胎儿成纤维细胞)为饲养层抑制分化培养,其中1个细胞系传至4代。研究发现,STO较MEF更有利于牛类EG细胞的分离与培养,体长小于5cm的胎儿适合牛EG细胞分离与克隆。同时观察到这些细胞在体外进行自发性分化,可形成上皮样细胞、神经样细胞和成纤维样细胞。     

栝楼性别的分化与鉴定研究进展

栝楼是常用的大宗药用植物,其性别分化一直是研究的重点。本文对栝楼雌、雄性别分化的组织形态鉴别、生理生化鉴别、性别相关基因的分子标记鉴别等进行综述,并对今后栝楼性别研究的发展趋势进行了展望,最后提出了相关建议。     

减数分裂重组的分子遗传机制研究进展及在作物育种中的应用

减数分裂是真核生物有性生殖产生染色体数目减半的单倍体配子所必需的生命过程。重组是减数分裂的核心事件之一，既增加了同源染色体间遗传信息的交换，又保证了其在减数分裂后期Ⅰ的正确分离。因此，减数分裂重组不仅增加了后代遗传多样性，还是作物遗传育种的基础。通过提高重组频率或改变其分布可以加速农作物育种进程，而降低或抑制重组可以固定杂种优势。近年来对植物减数分裂重组的分子遗传机制的研究取得了很大进展，包括重组的遗传和表观遗传调控机制，重组的遗传操控技术、固定杂交优势和染色体工程等方面。本文针对以上方面进行了全面的总结，这些内容不仅方便了读者对减数分裂重组的理论认知，还拓展了通过调控减数分裂重组操控生物育种的思路。     

植物中减数分裂过程相关调控基因的研究进展

减数分裂过程是真核生物进行有性生殖的基础,是细胞维持稳定的染色体数目、实现遗传多样性的重要方式,占据真核生物生命周期的中心地位。在植物中,减数分裂异常会产生染色体片段、单价体、多价体等,失常的减数分裂行为通常会导致植物不育,对于以种子供人类应用的作物来说是致命的。减数分裂是一个非常繁复的过程,其有序进行需要一系列相关基因的协调参与。本文主要从调控减数分裂的基因出发,重点讨论了参与第一次减数分裂前期中几个标志性事件的基因的作用,为从减数分裂角度进行作物品种改良提供理论依据。     

蛋白质代谢通路对鸡雄性生殖细胞分化的调控

【目的】探究蛋白质代谢在鸡雄性生殖细胞分化过程中的作用机制,为完善鸡胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)体外向雄性生殖细胞诱导分化体系研究提供依据。【方法】采用流式分选的方法获取高纯度的ESC、原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)和精原干细胞(spermatogonia stem cell,SSCs),分别提取细胞的总RNA,采用RNA-Seq方法对3种细胞的转录本进行深度测序,然后进行WEGO(web gene ontology)和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析,筛选出鸡雄性生殖细胞分化过程中参与蛋白质代谢的关键通路及其关键基因,RT-q PCR(Real time Quantitative PCR)检测部分关键差异基因的表达变化,并与RNA-Seq(RNA sequencing)结果进行比较分析,同时分别从体内和体外水平对关键基因NOS2进行抑制,观察各分组不同天数的细胞形态变化及检测NOS2和C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖标记基因表达变化情况。【结果】在雄性生殖细胞分化的整个阶段,有697个差异基因参与生物代谢,显著富集于精氨酸-脯氨酸代谢通路、酪氨酸代谢通路以及色氨酸代谢通路,在这3条通路上筛选出NOS2、FAH和IDO等关键性基因,这些基因的在ESCs向SSCs分化过程中表达变化趋势与其在RNA-Seq中的结果一致。体内抑制NOS2基因后,NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖标记基因在空白组和对照组之间无显著性的差异,而在抑制剂组中,NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖标记基因的m RNA表达量均出现了降低;而体外抑制NOS2基因后,对照组中的ESCs在2、4、6、8和10d内细胞不断增殖,但是未出现类胚体;RA诱导组中,2d出现小的类胚体,4d类胚体增大,且数量增多,6d类胚体边缘开始出现破裂,8d类胚体解体,10d出现类精原样细胞;抑制剂组中,ESCs在2、4、6、8和10d内无类胚体出现,且相较于对照组细胞增殖缓慢;RA+抑制剂组中,2和4d内无类胚体出现,细胞增殖缓慢,6d出现小的类胚体,8d类胚体数量少量增多,且体积稍显增大,10d类胚体开始裂解。并且经过抑制剂的抑制后,NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖标记基因的表达量在RA诱导组、抑制剂组和RA+抑制剂组中相对于对照组均呈显著性或极显著性的下调趋势。【结论】基于RNA-Seq技术及生物信息学方法筛选出ESCs向雄性生殖细胞分化过程中精氨酸-脯氨酸代谢通路及关键基因NOS2的基础上,通过对NOS2基因在鸡体内和体外的抑制,发现NOS2在被抑制后,ESCs向雄性生殖细胞分化的过程受到抑制。说明了精氨酸-脯氨酸代谢通路及关键基因NOS2对ESCs向雄性生殖细胞分化过程中起到重要的调节作用。     

青鳉tsn的克隆与表达分析

有性繁殖的性别决定机制虽具有多样性,但其生殖细胞都经过几轮有丝分裂和增殖后进入减数分裂,最终产生雌性或雄性配子。尽管有丝分裂过程中的生殖细胞在形态上没有雌雄差异,然而,未分化的生殖细胞在有丝分裂过程中如何获得雌雄性别特征尚不清楚。青鳉(Oryzias latipes)正常XX卵巢、正常XY精巢以及性腺体细胞衍生因子(gonadal soma-derived factor,gsdf)缺失型(gsdf^-/-)卵巢的蛋白质组学质谱比对分析结果显示,gsdf^-/-XY卵巢中Tsn(Translin)蛋白产物显著高于gsdf^-/-XX卵巢,提示Tsn蛋白表达可能受dmy(DM-domain on Y chromosome,又名dmrt1bY)及下游Gsdf雄性信号调控。从青鳉性腺组织的cDNA中克隆了tsn基因的ORF(Open Reading Frame)片段。氨基酸序列的同源性比对分析及系统发育树评估显示,Tsn在脊椎动物物种间具有进化保守性,青鳉和斑马鱼(Danio rerio)的Tsn氨基酸序列高度同源。反转录PCR和实时荧光定量PCR检测结果显示,tsn的mRNA在野生型青鳉多个组织中广泛表达,其中在精巢中的表达量显著高于卵巢。免疫荧光检测发现,gsdf^-/-XY卵巢中抗青鳉Tsn抗体阳性反应的囊性生殖细胞异常增多,同蛋白组学分析得到的gsdf^-/-XY卵巢中Tsn蛋白表达量高于gsdf^-/-XX卵巢的结果相一致。在青鳉性腺分化发育过程中,Gsdf信号可能抑制Tsn阳性的雄性囊性生殖细胞增殖,当该信号被破坏后,这种抑制作用消失,导致Tsn阳性生殖细胞在gsdf^-/-XY卵巢中大量积累。青鳉Tsn阳性生殖细胞的囊性增殖,是青鳉有丝分裂期生殖细胞雄性分化的特征之一,为脊椎动物有丝分裂期生殖细胞的雌雄性别鉴定提供了线索。     

栽培二棱大麦花粉母细胞减数分裂的研究

本文以幼穗为材料,观察了二棱大麦花粉母细胞的减数分裂。观察表明:大麦的小穗顺序与花粉母细胞减数分裂时期呈显著的相关关系。同一小花不同花药减数分裂时期基本是同步的;同一花药细胞减数分裂不同步的比率为50％。实验也统计了减数分裂各时期在同一穗上的频率。观察到大麦花粉母细胞减数分裂各时期均有体细胞有丝分裂现象;也观察到第二次减数分裂子细胞分裂不同步的不正常现象。     

脂代谢通路对鸡雄性生殖细胞分化的调控机制

【目的】探索家鸡雄性生殖细胞分化过程中脂代谢相关基因以及信号通路的调控机制,以期为完善体外诱导体系提供依据。【方法】采用流式细胞分选法获得纯度较高的胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)、原始生殖细胞(primitive germ cells,PGC)和精原干细胞 (spermatogonial stem cell,SSC),提取细胞总RNA。利用RNA-seq高通量分析方法对这三种细胞进行转录组水平测序,进行GO（Gene ontology）分析和KEGG通路富集,寻找脂代谢相关基因以及信号通路;并利用脂代谢--视黄醇代谢通路终产物视黄酸（retinoic acid,RA）以及抑制剂苯磺酰异羟肟酸 (piloty’s acid)在体外诱导ESC向雄性生殖细胞分化和体外鸡胚注射后孵化,qRT-PCR（quantitative real time PCR）检测视黄醇代谢通路上差异基因的表达变化,与RNA-seq结果进行比较分析同时检测雄性生殖细胞标记基因的变化情况。【结果】GO功能显著性富集和 Pathway 显著性富集分析结果发现：在ESC向SSC分化过程中共存在328个基因持续参与脂代谢调控,富集到27条脂代谢通路中,包括视黄醇代谢、初级胆汁酸的合成、甾类激素的生物合成、脂肪酸代谢、甘油酯代谢以及类固醇的生物合成等通路。在视黄醇代谢通路中ADH5在PGC中特异表达,ALDH1A1在整个发育过程中持续上调,ADH5和ALDH1A1在细胞中参与视黄酸的合成;CYP26b1在整个发育过程中持续上调,参与视黄酸的降解过程;RA体外诱导ESC向SSC方向诱导试验结果表明ADH5、ALDH1A1和CYP26b1家族基因在体外RA诱导过程中变化与体内分化过程一致,RA诱导组产生的SSC样细胞显著高于控制组和Piloty’s Acid+RA组。鸡胚注射抑制剂试验结果表明视黄醇通路被抑制后孵化至18d后SSC细胞表面特异标记基因integrinα6和integrinβ1的表达水平显著的低于正常的孵化组(CON)和阴性对照组（BLANK）【结论】脂代谢--视黄醇代谢通路在家鸡雄性生殖细胞的分化过程中起重要作用,体外利用视黄醇代谢通路终产物RA进行诱导时第2天出现类胚体,第4、6天类胚体逐渐增大,第8天开始裂解,在第10天出现SSC样细胞,而在诱导过程中抑制视黄醇通路信号后则会降低SSC样细胞的产生,而在体外孵化过程中视黄醇通路抑制后也能影响SSC细胞的产生。     

Improved Isolation and Culture of Embryonic Germ Cells from Guanzhong Dairy Goat

A total of 219 embryonic-germ-cell-like （EG-like） clumps were derived from 15 selected goat fetuses. Isolation of primordial germ cells （PGCs） based on co-culture with primary goat embryonic fibroblast showed no difference from traditional feeder layer-based culture method used in mouse and human. The putative primary EG colonies were multilayer clumps of compact cells with unclear cell-cell boundaries. Three subculture methods of goat EG-like colony, traditional enzymatic digestion, mechanical cutting and combination of the both, were compared in this study. As a result, EG-like colonies traditionally disassociated with collagenase 1V could be subcultured for up to 4 passages. And the mechanically disaggregated EG-like colonies were successfully maintained 9-12 passages with or without enzymatic treatment. The pluripotency of the EG-like colonies was identified by their specific marker staining, spontaneous differentiation and embryoid bodies （EBs） formation in vitro. Most goat EG-like colonies （〉 80%） were AKP positive and immunocytochemically characterized with positive SSEA-1, Oct-4 and c-kit staining but SSEA-4. Under the condition of delaying passage, goat EG-like cells could differentiate into fibroblast-like, epithelium-like, and neuron-like cells. In addition, EBs could be obtained successfully in routine hanging drop culture. The serum free culture system （feeder layer-based） used in this study was suitable for keeping PGCs and EG-like cells in their undifferentiated condition, but failed to converse them to immortal cells. These results indicated that mechanical cutting is an effective method for passaging goat EG cell colonies. However, the microenvironment of conversing EG cells to immortal cells is still unclear.     

利用绒山羊原始生殖细胞培养胚胎干细胞的研究

[目的]建立绒山羊胚胎干细胞体系。[方法]采用与其胎儿成纤维细胞共培养的方式从20 mm绒山羊胎儿生殖嵴及其周围组织分离克隆出大量原始生殖细胞(PGCS)集落。[结果]这些集落的细胞经过多次传代具有胚胎干细胞(ES)的诸多特征,如鸟巢状结构、AKP染色阳性、具有连续传代能力等。[结论]该细胞具有多能性,类似ES细胞。     

百合三倍体种间杂种花粉母细胞减数分裂行为观察

对细叶百合(2x)×布鲁拉诺(4x)的三倍体种间杂种花粉母细胞减数分裂过程进行了观察,发现三倍体种间杂种减数分裂过程中出现较多异常现象,在双线期出现不等二价体;在后期I和末期工出现染色体桥;在后期Ⅰ、末期Ⅰ、中期Ⅱ和末期Ⅱ出现滞后染色体;在末期Ⅰ和二分体时期出现微核;在末期Ⅰ和后期Ⅱ出现不均等分离等.花粉母细胞减数分裂异常可能是导致花粉败育的主要原因.     

剪秋罗大小孢子母细胞减数分裂进程观察

该研究以大花剪秋罗为材料,研究其大孢子母细胞减数分裂进程、花粉母细胞减数分裂进程及其形态学特征上的对应关系,以便从形态学上辨别其对应的减数分裂时期,便于日后对其进行多倍体诱导育种工作。结果表明通过对大花剪秋罗大小孢子母细胞减数分裂进程的观察,发现大花剪秋罗大小孢子母细胞发育过程和外部形态存在一定的时序对应关系,可根据外部形态结合小孢子母细胞临时压片来初步判别大孢子母细胞减数分裂时期,但个体之间的同步性是否一致有待进一步研究。