红鳍东方鲀生长激素释放激素(GHRH)基因多态性及其与生长性状的关联分析

为研究生长激素释放激素(growth hormone-releasing hormone, GHRH)基因对红鳍东方鲀Takifugu rubripes生长性状的影响,设计4对可覆盖GHRH基因全序列的PCR引物,采用直接测序法对序列进行分析比对以筛选多态位点。试验群体为随机挑选的219尾红鳍东方鲀,于该群体的6月龄及12月龄时测量其体质量、体长、体高等10个生长相关性状,随后将筛选出的多态位点与生长性状进行关联分析,并进行连锁不平衡及双倍型分析。结果表明：共筛选出7个SNPs位点,分别为C81T、G315C、C1083T、A1524G、G2107A、T2125C和G2256A,其中,C81T、G315C和A1524G 3个位点的多态性与大多数生长性状均存在显著关联性(P<0.05);G2256A与T2125C,G207A与C083T位点均处于连锁不平衡状态,但并非完全连锁;6月龄群体中,双倍型D4和D5的体质量平均值显著高于D3(P<0.05),12月龄群体中,双倍型D5的体质量平均值显著高于D3(P<0.05)。研究表明,C81T、G315C和A1524G 3个位点是对红鳍东方鲀生长有正向影响的优势位点,6月龄群体中,双倍型D4和D5为优势基因型,12月龄群体中,双倍型D5为优势基因型,在后续红鳍东方鲀选育过程中可以优先选择这些位点和基因型。     

红鳍东方鲀微卫星DNA多态性初步分析

用红鳍东方(Takifugu rubripes)微卫星标记对两个不同群体红鳍东方的DNA多态性进行分析。经20对引物的扩增,得到每个个体的微卫星片段,其中16对引物能扩增出较好的谱带。用2%的琼脂糖凝胶电泳检测微卫星标记的PCR扩增产物,并对扩增结果进行了统计分析。计算得到两个群体的平均等位基因数分别为1.875 0和2.437 5;多态信息含量(PIC)平均值分别为0.275 1和0.379 4;平均杂合度观测值分别为0.025和0.200。统计结果初步表明两个不同群体平均杂合度较低,遗传多态性不高。     

红鳍东方鲀微卫星DNA多态性初步分析

用红鳍东方(Takifugu rubripes)微卫星标记对两个不同群体红鳍东方的DNA多态性进行分析。经20对引物的扩增,得到每个个体的微卫星片段,其中16对引物能扩增出较好的谱带。用2%的琼脂糖凝胶电泳检测微卫星标记的PCR扩增产物,并对扩增结果进行了统计分析。计算得到两个群体的平均等位基因数分别为1.875 0和2.437 5;多态信息含量(PIC)平均值分别为0.275 1和0.379 4;平均杂合度观测值分别为0.025和0.200。统计结果初步表明两个不同群体平均杂合度较低,遗传多态性不高。     

3个线粒体基因在红鳍东方鲀和暗纹东方鲀中的比较分析

由于形态学无法更精准地鉴别部分红鳍东方鲀和暗纹东方鲀,因此需要通过分子手段鉴别此类无法直观辨认的东方鲀。该研究以15尾红鳍东方鲀和30尾暗纹东方鲀为材料,使用NCBI上红鳍东方鲀和暗纹东方鲀的线粒体全基因组中3个基因COⅠ、COⅡ、COⅢ保守区域通过Primer 5.0进行引物设计。将45个样品在摸索得到的最适条件下进行扩增并测序,对测序结果进行检验,分析种间差异并进行碱基组成性分析,得出COⅠ上有9个SNPs,COⅡ上有4个SNPs,COⅢ有10个SNPs,使用MEGA-X进行进化树分析得出,该研究所设计的引物可以有效地鉴别2种东方鲀。     

红鳍东方鲀鳍细胞系的建立及生长特性研究

为研究红鳍东方鲀Takifugu rubripes鳍细胞系对该鱼病毒病诊断和治疗的影响,采用组织块培养法启动红鳍东方鲀鳍组织细胞的原代培养,用胰蛋白酶消化法进行传代培养,目前红鳍东方鲀鳍细胞传至40代,为成纤维细胞样细胞,原代培养和早期传代培养使用的培养基为添加了20%胎牛血清的DMEM/F12高糖培养基,添加的生长因子分别为终浓度为10 ng/m L的人碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)、终浓度为20 ng/m L的Ⅰ型胰岛素样生长因子和终浓度为20μg/m L的硫酸软骨素,30代以后使用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基,将细胞于25℃、5%CO2恒温培养箱中培养。结果表明:生长曲线显示,细胞在0～2d内处于潜伏期,2～4 d时进入对数期,4～5 d时进入平台期,5 d后开始转入衰退期;红鳍东方鲀鳍细胞系的倍增时间为50. 24 h;细胞经超低温保存60 d,解冻复苏后测定其存活率为80%;经微卫星位点扩增,凝胶电泳后的条带证实细胞系来源于红鳍东方鲀。研究表明,红鳍东方鲀鳍细胞系的建立丰富了鱼类细胞系的种类,也为红鳍东方鲀病毒病的研究及疫苗制备等提供了数据资料。     

红鳍东方鲀与杂交鲀的性腺转录组比较分析

为分析红鳍东方鲀与杂交鲀(菊黄东方鲀♀×红鳍东方鲀♂)性腺发育的分子机制,该研究应用Illumina高通量测序技术对二者的卵巢和精巢组织进行转录组测序与生物信息学分析。结果表明:通过分析与筛选共得到差异表达基因(DEGs)4 157个(卵巢组织)和8 260个(精巢组织)。其中卵巢组织样本(O₂vsO₁)中表达上调的差异基因有1 912个,表达下调的有2 245个;精巢组织样本(T₂vsT₁)中表达上调的差异基因有4 234个,表达下调的有4 026个。通过GO功能注释与KEGG富集分析,在卵巢组织样本中(O₂vsO₁),差异表达基因主要归纳为93个功能类别与153条代谢通路;在精巢组织中(T₂vsT₁),差异表达基因可以主要归纳为73个功能类别与154条代谢通路,其中神经活性配体-受体相互作用过程、丝裂原活化蛋白激酶通路和钙信号通路的富集程度最高。该研究结果丰富了红鳍东方鲀与杂交鲀的转录组信息,为后续相关研究提...     

红鳍东方鲀不同家系群体的形态性状差异与相关性分析

为获得优良的红鳍东方鲀Takifugu rubripes家系与形态性状,为其育种工作提供数据参考,采用聚类分析、单因素方差分析和相关分析3种多元统计方法,对3个6月龄红鳍东方鲀家系群体的14项形态性状进行比较研究。结果表明:全同胞家系(F)的体质量(BWH)、体高(BD)、体宽(BW)、尾柄高(CPD)均高于日本家系(J)和半同胞家系(H),且显著高于日本家系(P<0.05),全同胞家系6月龄的生长速度明显快于其他两个家系;日本家系与全同胞家系和半同胞家系的形态差异较大,进化树分析结果显示,半同胞家系与全同胞家系先聚为一支,然后再与日本家系聚为另外一支;单因素方差分析结果显示,3个家系间的形态性状中眼后头长(EH)、头长(HL)、体质量(BWH)、头长+躯干长(HL+TR)、眼间距(IS)存在显著性差异(P<0.05);相关性分析结果显示,体全长(TL)、体长(BL)、体高(BD)、体宽(BW)、头长+躯干长(HL+TR)、尾长(TA)和尾柄高(CPD)与体质量显著相关(P<0.05)。研究表明,综合3个家系间均差异显著且变异系数相对较大,以及与体质量显著相关的性状作为遗传育种主要筛选性状标准,可以考虑用全同胞家系作为红鳍东方鲀遗传育种的优良家系,选育性状主要参考体质量、体宽、体高、体长、头长和尾柄高,本研究结果可为红鳍东方鲀育种工作提供基础资料。     

红鳍东方鲀不同家系群体的形态性状差异与相关性分析

为获得优良的红鳍东方鲀Takifugu rubripes家系与形态性状,为其育种工作提供数据参考,采用聚类分析、单因素方差分析和相关分析3种多元统计方法,对3个6月龄红鳍东方鲀家系群体的14项形态性状进行比较研究。结果表明:全同胞家系(F)的体质量(BWH)、体高(BD)、体宽(BW)、尾柄高(CPD)均高于日本家系(J)和半同胞家系(H),且显著高于日本家系(P<0.05),全同胞家系6月龄的生长速度明显快于其他两个家系;日本家系与全同胞家系和半同胞家系的形态差异较大,进化树分析结果显示,半同胞家系与全同胞家系先聚为一支,然后再与日本家系聚为另外一支;单因素方差分析结果显示,3个家系间的形态性状中眼后头长(EH)、头长(HL)、体质量(BWH)、头长+躯干长(HL+TR)、眼间距(IS)存在显著性差异(P<0.05);相关性分析结果显示,体全长(TL)、体长(BL)、体高(BD)、体宽(BW)、头长+躯干长(HL+TR)、尾长(TA)和尾柄高(CPD)与体质量显著相关(P<0.05)。研究表明,综合3个家系间均差异显著且变异系数相对较大,以及与体质量显著相关的性状作为遗传育种主要筛选性状标准,可以考虑用全同胞家系作为红鳍东方鲀遗传育种的优良家系,选育性状主要参考体质量、体宽、体高、体长、头长和尾柄高,本研究结果可为红鳍东方鲀育种工作提供基础资料。     

红鳍东方鲀IgM重组表达与多克隆抗体制备

红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）是我国重要的海水养殖经济鱼类,探究红鳍东方鲀IgM的结构与功能对其病害防治与免疫系统的研究均有重要意义。本研究克隆获取了红鳍东方鲀IgM的重（H）链恒定（C）区序列,序列大小为1326bp,编码442个氨基酸,将获得的IgM序列连接至pET28a表达载体上,利用大肠杆菌BL21进行体外重组表达,SDS-PAGE结果显示：重组蛋白红鳍东方鲀IgM（TrIgM）大小约为62kDa,重组表达的IgM主要以包涵体形式表达。通过体外复性获得可溶性TrIgM蛋白, 将制备的TrIgM蛋白免疫BALB/c小鼠,获得了TrIgM鼠抗血清,Western blot检测结果表明：制备的鼠抗血清可以与重组TrIgM蛋白和红鳍东方鲀天然血清中的IgM的重链蛋白特异性结合。本研究中制备的抗血清可作为检测红鳍东方鲀IgM的特异性抗体,为红鳍东方鲀相关免疫检测提供基础。     

红鳍东方鲀仔鱼期摄食与生长的研究

在水温 ( 1 6± 1 )℃条件下 ,红鳍东方 (Takifugurubripes)仔鱼孵出后 4d开始摄食 ,此时其卵黄囊体积由初孵时的 0 636mm3减少到 0 375mm3;1 2d时 ,卵黄完全耗尽。最高初次摄食率出现在卵黄耗尽时 ,可达 1 0 0 % ;仔鱼能维持 9d高达 90 %以上的初次摄食率。初次摄食强度最大值也出现在 1 2d。饥饿不可逆点 (PNR)出现在 1 5～ 1 6d。在内营养期日平均增长率为 0 2 1 7mm/d ;在PNR前的摄食期 ,饥饿仔鱼的日平均生长率为 0 0 1 7mm/d ;而摄食仔鱼的日平均生长率为 0 0 95mm/d ;PNR后至死亡前 ,饥饿仔鱼呈负增长 ,而摄食仔鱼的日平均生长率达 0 41 0mm/d。     

红鳍东方鲀卵巢与精巢的蛋白质组比较分析

为研究红鳍东方鲀Takifugu rubripes性腺发生的相关机制,选择3龄体质量约2.0 kg的红鳍东方鲀成熟卵巢与精巢组织,利用非标记定量技术(Lable-free)对卵巢与精巢两种组织蛋白质组进行定性与定量分析,并运用GO、KEGG分析等方法对差异表达的蛋白进行富集分析。结果表明:非标记定量显示,在两组织间卵巢中特有的蛋白为150个,精巢中特有的蛋白为132个,有172个在卵巢中表达较高的蛋白及161个在精巢中表达较高的蛋白,在卵巢中存在与卵巢发育相关的高表达蛋白ELAVL2、RNA helicase、LSM4和FRUYP1,而在精巢中特异表达蛋白GSDF影响精巢发育;经GO分析发现,RNA结合(RNA binding)可能影响卵巢发育,两组织差异蛋白在膜组成部分(Integral component of membrane)具有最大差值;GO功能显著性富集分析得出,转移酶活性(Transferase activity)在两组织之间差异最显著;KEGG通路分析显示,核糖体通路(Ribosome)在两组织间差异蛋白最多,该通路也可能与性腺发育相关,通路中核糖体蛋白L10A被证实与一些物种性别发育相关,并发现吞噬体(Phagosome)、溶酶体(Lysosome)及鞘脂代谢通路(Sphingolipid signaling pathway)可能与精子成熟相关。研究表明,红鳍东方鲀卵巢与精巢蛋白质组差异较大,与卵巢发育相关的蛋白有ELAVL2和RNA helicase及核糖体通路等,与精巢发育相关的蛋白有GSDF及吞噬体通路等,本研究结果可为红鳍东方鲀性腺组织发育研究提供参考。     

红鳍东方鲀生长性状的遗传力估计及性状间相关关系的初步研究

为估计红鳍东方鲀Takifugu rubripes生长性状的遗传力及生长性状间的相关关系,构建了5个全同胞家系,测定了210日龄(504尾)和360日龄(500尾)红鳍东方鲀的体质量、体长和体全长等生长性状的表型值,构建固定模型,用全同胞法估计了210日龄和360日龄红鳍东方鲀的体质量、体长和体全长3个生长性状的遗传力。结果表明:红鳍东方鲀的体质量、体长和体全长3个生长性状的遗传力估计值在210日龄时分别为0.54、0.38、0.52,在360日龄时分别为0.46、0.37、0.44,这3个性状的遗传力属于中等和高等遗传力;体质量与体长,体质量与体全长,以及体长与体全长的遗传相关系数在210日龄时分别为0.99、0.99、0.98,在360日龄时分别为0.97、0.97、0.96,这3个性状之间的遗传相关呈高度正相关;测定了102日龄(296尾)红鳍东方鲀的体质量、体长和体高3个生长性状,利用回归模型建立了体质量(W)与体长(L)和体全高(H)的数学模型为W=e-8.513L2.046H0.742(R2=0.903)。本研究结果可为红鳍东方鲀的遗传育种研究提供参考。     

红鳍东方鲀生长性状的遗传力估计及性状间相关关系的初步研究

为估计红鳍东方鲀Takifugu rubripes生长性状的遗传力及生长性状间的相关关系,构建了5个全同胞家系,测定了210日龄(504尾)和360日龄(500尾)红鳍东方鲀的体质量、体长和体全长等生长性状的表型值,构建固定模型,用全同胞法估计了210日龄和360日龄红鳍东方鲀的体质量、体长和体全长3个生长性状的遗传力。结果表明:红鳍东方鲀的体质量、体长和体全长3个生长性状的遗传力估计值在210日龄时分别为0.54、0.38、0.52,在360日龄时分别为0.46、0.37、0.44,这3个性状的遗传力属于中等和高等遗传力;体质量与体长,体质量与体全长,以及体长与体全长的遗传相关系数在210日龄时分别为0.99、0.99、0.98,在360日龄时分别为0.97、0.97、0.96,这3个性状之间的遗传相关呈高度正相关;测定了102日龄(296尾)红鳍东方鲀的体质量、体长和体高3个生长性状,利用回归模型建立了体质量(W)与体长(L)和体全高(H)的数学模型为W=e-8.513L2.046H0.742(R2=0.903)。本研究结果可为红鳍东方鲀的遗传育种研究提供参考。     

光谱对红鳍东方鲀仔稚鱼生长及相关基因表达量的影响

为了解光谱对红鳍东方鲀Takifugu rubripes仔稚鱼(200尾,体质量为1.86 mg±0.48 mg)生长及相关基因表达量的影响,采用实时荧光定量PCR技术,对不同光谱处理后第12、22天仔稚鱼的生长激素基因GH(Growth hormone)、生长激素受体1型基因GHR1(Growth hormone receptor 1)、类胰岛素生长因子1型基因IGF1(Insulin-like growth factor 1)、生长激素释放激素基因1型GHRH1(Growth hormone-relasing hormone 1)和生长激素抑制激素1型基因SS1(Somatostatin 1)相对表达量变化情况进行了研究。结果表明:经不同光谱处理后,黄光组(λ_(590～595 nm))仔稚鱼的体长、体质量比其他光色组增加较多,其次是蓝光(λ_(450～455 nm))、白光(λ_(400～780 nm))、绿光(λ_(525～530 nm))组,不同光色对仔稚鱼生长有显著性影响(P<0.05);12 d时,红光组(λ_(625～630 nm))的GH基因相对表达量显著高于蓝光、黄光、白光组(P<0.05),绿光组GHR1基因相对表达量显著高于其他光色组(P<0.05),绿光组IGF1基因相对表达量显著高于白光组(P<0.05),绿光和红光组GHRH1基因相对表达量显著高于白光、黄光组(P<0.05),红光组SS1基因相对表达量显著高于其他光色组(P<0.05),SS1基因表达量由大到小依次为红光组>蓝光组>绿光组>白光组>黄光组;22 d时,红光组仔稚鱼几乎全部死亡,绿光组GH基因相对表达量著高于蓝光、黄光组(P<0.05),不同光色处理组的GHR1、GHRH1基因相对表达量均无显著性差异(P>0.05),绿光组IGF1基因相对表达量显著高于其他光色组(P<0.05),黄光组SS1基因相对表达量显著高于其他光色组(P<0.05)。研究表明,黄光对红鳍东方鲀仔稚鱼生长、发育具有促进作用,红光、绿光不适合红鳍东方鲀仔稚鱼生存。     

光谱对红鳍东方鲀仔稚鱼生长及相关基因表达量的影响

为了解光谱对红鳍东方鲀Takifugu rubripes仔稚鱼(200尾,体质量为1.86 mg±0.48 mg)生长及相关基因表达量的影响,采用实时荧光定量PCR技术,对不同光谱处理后第12、22天仔稚鱼的生长激素基因GH(Growth hormone)、生长激素受体1型基因GHR1(Growth hormone receptor 1)、类胰岛素生长因子1型基因IGF1(Insulin-like growth factor 1)、生长激素释放激素基因1型GHRH1(Growth hormone-relasing hormone 1)和生长激素抑制激素1型基因SS1(Somatostatin 1)相对表达量变化情况进行了研究。结果表明:经不同光谱处理后,黄光组(λ_(590～595 nm))仔稚鱼的体长、体质量比其他光色组增加较多,其次是蓝光(λ_(450～455 nm))、白光(λ_(400～780 nm))、绿光(λ_(525～530 nm))组,不同光色对仔稚鱼生长有显著性影响(P<0.05);12 d时,红光组(λ_(625～630 nm))的GH基因相对表达量显著高于蓝光、黄光、白光组(P<0.05),绿光组GHR1基因相对表达量显著高于其他光色组(P<0.05),绿光组IGF1基因相对表达量显著高于白光组(P<0.05),绿光和红光组GHRH1基因相对表达量显著高于白光、黄光组(P<0.05),红光组SS1基因相对表达量显著高于其他光色组(P<0.05),SS1基因表达量由大到小依次为红光组>蓝光组>绿光组>白光组>黄光组;22 d时,红光组仔稚鱼几乎全部死亡,绿光组GH基因相对表达量著高于蓝光、黄光组(P<0.05),不同光色处理组的GHR1、GHRH1基因相对表达量均无显著性差异(P>0.05),绿光组IGF1基因相对表达量显著高于其他光色组(P<0.05),黄光组SS1基因相对表达量显著高于其他光色组(P<0.05)。研究表明,黄光对红鳍东方鲀仔稚鱼生长、发育具有促进作用,红光、绿光不适合红鳍东方鲀仔稚鱼生存。     

壳聚糖纳米颗粒对红鳍东方鲀生长、免疫酶及免疫基因的影响

为了研究壳聚糖纳米颗粒这一新型免疫添加剂对红鳍东方鲀Takifugu rubripes生长性能、免疫指标的影响,以体质量为(9.910±0.306)g的红鳍东方鲀幼鱼为研究对象,试验设6组,每组设3个平行,每个平行放30尾鱼,投喂基础饲料中分别添加0(对照)、0.2%的壳寡糖(COS)、0.2%的壳聚糖(CS),以及0.2%、0.1%、0.02%的壳聚糖纳米颗粒(CN)的试验饲料,养殖周期50 d,试验结束后测定各组红鳍东方鲀的特定生长率,肝、脾、肾组织中碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)及溶菌酶(LZM)的活性,以及补体c3、热休克性蛋白hsp70、免疫调节因子ifr2、Toll样受体tlr3等免疫基因的相对表达量。结果表明:饲料中添加壳聚糖纳米颗粒和壳寡糖能显著促进红鳍东方鲀的生长(P<0.05);饲料中添加壳聚糖纳米颗粒能显著增加鱼体肝脏的AKP、CAT酶活性,脾脏的ACP、LZM活性,肾脏的SOD、LZM酶活性(P<0.05);壳聚糖纳米颗粒对鱼体ifr2基因表达的促进作用不明显(P>0.05),但能显著提高脾脏中c3、tlr3、hsp70的相对表达量(P<0.05)。研究表明,饲料中添加壳聚糖纳米颗粒对红鳍东方鲀的生长具有促进作用,并能提高鱼体的免疫力,同时与壳寡糖的作用效果相当。