尼罗罗非鱼清道夫受体基因Scara3的克隆及病原微生物刺激后的表达响应

为探究清道夫受体3(scavenger receptor class a member 3,Scara3)在尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus抵御病原微生物过程中的作用,采用聚合酶链式反应克隆得到罗非鱼Scara3基因,利用荧光定量PCR技术分析Scara3在健康尼罗罗非鱼组织分布及细菌、病毒感染后的表达情况,并进行亚细胞定位分析。结果表明：克隆得到尼罗罗非鱼Scara3基因cDNA全长序列为3 889 bp,开放阅读框(ORF)为1 827 bp,编码608个氨基酸,具有跨膜结构域和胶原(Collagen)结构域;多序列比对发现,Scara3氨基酸序列在脊椎动物中相对保守;亚细胞定位显示,Scara3蛋白在全细胞分布;荧光定量PCR分析显示,Scara3基因在健康罗非鱼各组织中均有表达,在血液、肠道、皮肤和胸腺等组织中表达量较高且显著高于其他组织(P<0.05);经脂多糖(LPS)、灭活无乳链球菌Streptococcus agalactiae和聚肌胞苷酸(Poly I:C)刺激罗非鱼头肾白细胞后,Scara3表达量显著上调(P<0.05),经灭活无乳链球菌和Poly I:C刺激后,肠道、头肾和皮肤组织中的基因表达量表现出时序性。研究表明,尼罗罗非鱼在对细菌和病毒感染的免疫反应活动中,Scara3基因起着重要作用,本研究结果为后期硬骨鱼类中Scara3基因的功能研究提供了科学参考。     

尼罗罗非鱼干扰素诱导蛋白44基因克隆及表达分析

【目的】探索干扰素诱导蛋白44基因（ifi44）在尼罗罗非鱼各组织的分布特征及其响应无乳链球菌感染和聚肌胞苷酸[Poly(I∶C)]刺激过程中的表达模式,为进一步揭示ifi44基因在鱼类免疫应答中的作用机制打下基础。【方法】克隆On-ifi44基因开放阅读框（ORF）,通过ExPASy、TMHMM-2.0、Euk-mPLoc 2.0、SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析,根据单细胞转录组测序结果分析On-ifi44基因在细胞层面的分布情况,并采用实时荧光定量PCR检测On-ifi44基因在尼罗罗非鱼各组织中的表达分布特征及在无乳链球菌感染和Poly(I∶C)刺激后的时序表达情况。【结果】On-ifi44基因ORF序列全长1437 bp,编码478个氨基酸残基,其编码蛋白分子量为52.7 kD,理论等电点（pI）为4.97。On-ifi44含有1个TLDc＿dom结构域（1～157 aa）和1个GTP-bd结构域（197～322 aa）,不含跨膜结构域。On-ifi44氨基酸序列与奥利亚罗非鱼ifi44氨基酸序列的相似性为97.94%;基于ifi44氨基酸序列相...     

尼罗罗非鱼CD209基因的克隆、表达及功能鉴定

为揭示尼罗罗非鱼模式识别受体CD209的分子结构、组织表达特性并初步了解其免疫功能,利用聚合酶链式反应(PCR)获得尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus(体质量为100 g±5 g)CD209基因的开放阅读框片段(open reading frame, ORF),命名为OnCD209;使用生物信息学软件对其氨基酸序列进行分析,采用RT-qPCR法对健康尼罗罗非鱼的各组织及无乳链球菌刺激后尼罗罗非鱼肝脏、脾脏、鳃和肠道的CD209基因表达量进行分析,并构建了CD209-pEGFP-N1及CD209-pcDNA3.1载体,研究了CD209基因在293T细胞中的定位及在细胞中过表达时对NF-κB酶活性的影响。结果表明:OnCD209的ORF区片段长度为1 383 bp,可编码460个氨基酸,预测该蛋白具有一个C型凝集素结构域;多重氨基酸序列比对及系统进化分析显示,CD209氨基酸序列在各物种间相对不保守,尼罗罗非鱼与田纹狮子鱼Liparis tanakae的CD209氨基酸序列聚为一支,亲缘关系最近;RT-qPCR结果显示,所有组织(脑、血液、皮肤、肌肉、头肾、肠道、鳃、肝脏、脾脏和胸腺)中均能检测到OnCD209的mRNA表达,且在血液中表达量最高;尼罗罗非鱼在受到无乳链球菌感染后,OnCD209的表达在各组织中呈现相似的变化趋势,大致呈先在6 h时上调,后在12、24 h时下调,再在48 h后上调的表达模式;亚细胞定位分析显示,OnCD209定位于细胞膜上;双荧光素酶报告基因系统检测发现,OnCD209对NF-κB通路的活性显著性激活。研究表明,OnCD209可能参与尼罗罗非鱼对细菌的免疫应答过程及炎症反应过程。     

尼罗罗非鱼CD209基因的克隆、表达及功能鉴定

为揭示尼罗罗非鱼模式识别受体CD209的分子结构、组织表达特性并初步了解其免疫功能, 利用聚合酶链式反应 (PCR) 获得尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus (体质量为100 g±5 g) CD209基因的开放阅读框片段 (open reading frame, ORF), 命名为OnCD209; 使...     

无乳链球菌感染吉富品系尼罗罗非鱼的病理学研究

[目的]确定无乳链球菌侵染吉富品系尼罗罗非鱼的途径及靶器官,为罗非鱼抗病育种及无乳链球菌病疫苗的研发提供理论依据.[方法]分别采用腹腔注射、经口灌胃及体外浸泡3种方式对吉富品系尼罗罗非鱼进行无乳链球菌感染,然后采集感染罗非鱼的鳃、脾脏、肝脏和小肠组织进行病理形态学观察,并利用家兔抗无乳链球菌血清进行免疫组织化学定位,明确不同感染途径下无乳链球菌在鱼体内各组织中的分布规律及其浸染的靶器官.[结果]3种人工感染方式均能促使吉富品系尼罗罗非鱼感染无乳链球菌,其中,腹腔注射和经口灌胃在感染2h后即出现病理变化,而体外浸泡感染方式出现病理变化的时间约在感染5h后,且病变程度较腹腔注射和经口灌胃的感染方式轻.免疫组织化学定位发现,腹腔注射组吉富品系尼罗罗非鱼的病原菌信号出现顺序为脾脏→肝脏和鳃→小肠,经口灌胃组的病原菌信号出现顺序为小肠→鳃和脾脏→肝脏,体外浸泡组的病原菌信号出现顺序为鳃→脾脏→肝脏和小肠.[结论]采用腹腔注射、经口灌胃及体外浸泡3种方式均能促使吉富品系尼罗罗非鱼感染无乳链球菌,其对应的病原菌信号分别优先在脾脏、肠道和鳃组织出现.因此,自然养殖条件下防止养殖水体和食源被无乳链球菌污染是防控罗非鱼无乳链球菌病暴发的有效措施.     

尼罗罗非鱼芳香化酶基因的染色体定位

从尼罗罗非鱼的细菌人工染色体基因文库中提取和纯化含有卵巢和脑芳香化酶基因的重组质粒DNA,通过简并PCR制备芳香化酶基因原位杂交探针,并用荧光素进行标记。结果显示,尼罗罗非鱼卵巢和脑芳香化酶基因位于2对不同的小染色体上,而不是位于性染色体上。结果提示：芳香化酶基因不是尼罗罗非鱼主要的性别决定基因。     

尼罗罗非鱼Dmrt1基冈克隆及在不同组织中的表达

Dmrt1基因是Dmrt基因家族的一个重要成员,在动物性别决定过程中发挥重要作用.参照小鼠Dmrt1基因DM保守区及有关文献,设计了1对简并引物,扩增了尼罗罗非鱼的Dmrt1基因,并对扩增产物进行了亚克隆与测序.结果在雌雄尼罗罗非鱼个体中各获得1个预期的基因片段.长度为140bp.序列无性别差异.序列同源性分析表明,尼罗罗非鱼Dmrt1基因DM盒区核苷酸序列与人和鼠相应基因的同源性为78%;编码的氨基酸序列与人和鼠相应基因编码序列的同源性为89%,充分显示了Dmrt1基因在进化上的高度保守性.进一步根据获得的Dmrt1序列,设计1对特异引物,采用RT-PCR技术对尼罗罗非鱼不同组织Dmrt1基因的表达进行了研究.结果发现,Dmrt1只在精巢中特异表达.在卵巢、眼、肠、鳃及心脏组织中无表达,提示该基因在性别分化和功能维持上可能具有重要作用.     

尼罗罗非鱼Hsc70的原核表达和多克隆抗体制备

通过原核表达系统表达尼罗罗非鱼热休克蛋白Hsc70,纯化该蛋白并制备其多克隆抗体。对尼罗罗非鱼热休克蛋白进行生物信息学分析,设计特异性引物,扩增出Hsc70基因,通过双酶切与pET-28a构建重组质粒表达载体,并转入大肠埃希菌B21中通过诱导剂IPTG进行原核诱导表达,表达产物用SDS-PAGE鉴定并用镍柱进行纯化。将纯化后的重组蛋白免疫日本大耳兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体效价,Western blot检测抗体特异性。结果表明,原核表达系统成功表达了尼罗罗非鱼热休克蛋白Hsc70,重组蛋白分子量约为75 ku,主要以包涵体形式表达。经镍柱纯化得到高纯度的Hsc70;该蛋白免疫日本大耳兔获得特异性多克隆抗体,效价为1∶2 048 000;Western blot检测到一条75 ku的特异性条带,表明该抗体能特异性地识别尼罗罗非鱼Hsc70蛋白。尼罗罗非鱼Hsc70蛋白在大肠埃希菌中成功表达,制备的重组蛋白和多克隆抗体为深入研究尼罗罗非鱼Hsc70的功能提供了分子工具。     

尼罗罗非鱼跨膜Bax抑制剂母体6基因Tmbim 6的克隆、表达及功能鉴定

为了解跨膜Bax抑制剂母体6(transmembrane Bax inhibitor motif containing 6, TMBIM 6)在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)病原体感染中的作用,利用聚合酶链式反应(PCR)对Tmbim 6基因进行克隆与鉴定,并采用实时荧光定量PCR(qPCR)分析Tmbim 6在健康尼罗罗非鱼(体质量为80～100 g)的组织分布模式及无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、Poly I:C模拟病毒刺激后的表达变化。结果表明：尼罗罗非鱼Tmbim 6开放阅读框为714 bp,可编码237个氨基酸,包含6个跨膜结构域和1个C-末端基序;亚细胞定位显示,尼罗罗非鱼TMBIM 6定位于细胞质,双荧光素酶报告基因系统检测发现,Tmbim 6在HEK-293T细胞中过表达后极显著抑制NF-κB通路(P<0.01);qPCR分析显示,Tmbim 6基因在所检测的组织中广泛分布,在肝脏和肌肉中的表达量最高;经无乳链球菌感染和Poly I:C刺激后,Tmbim 6在肝脏、脾脏、头肾、脑和肠道中的表达水平均显著上调...     

广西罗非鱼源无乳链球菌耐药性及其四环素耐药基因检测

[目的]研究分析广西罗非鱼源无乳链球菌的耐药性及其四环素类耐药基因,为指导罗非鱼无乳链球菌病的临床用药和揭示其耐药机制提供参考依据.[方法]采用二倍稀释法测定8种抗生素对广西罗非鱼源无乳链球菌的最小抑菌浓度(MIC),运用PCR检测菌株的四环素类耐药基因(tetM、tetO、tetL和tetS)携带情况,并以体外诱导法测定罗非鱼源无乳链球菌对多西环素耐药性的获得速率.[结果]37株广西罗非鱼源无乳链球菌对氨苄青霉素、多西环素、红霉素和土霉素均敏感,对硫酸新霉素和磺胺二甲嘧啶不敏感(已产生耐药性);仅从8株菌株中检出tetM基因,检出率21.6%(8/37),而tetO、tetL和tetS基因的携带率均为0,即广西罗非鱼源无乳链球菌仅存在tetM+tetO-tetL-tetS-和tetM-tetO-tetL-tetS-两种耐药基因型.经多西环素连续8代的体外传代诱导,6株携带tetM基因的罗非鱼源无乳链球菌MIC由0.24μg/mL上升至3.91μg/mL,即耐药性获得速率约16倍.PCR检测结果显示,各传代菌株均携带有tetM基因,且各传代菌株间的核甘酸相似性为100.0%.[结论]广西罗非鱼源无乳链球菌存在tetM+tetO-tetL-tetS-和tetM-tetO-tetL-tetS两种耐药基因型,对氨苄青霉素、多西环素、红霉素和土霉素仍较敏感,对硫酸新霉素和磺胺二甲嘧啶已产生耐药性.携带tetM基因的罗非鱼源无乳链球菌经体外诱导后对多西环素的耐药性大幅度提高,说明未达有效抑菌浓度时极易诱导无乳链球菌产生耐药性.     

尼罗罗非鱼TIRAP基因克隆、组织表达及其在无乳链球菌、脂多糖和聚肌胞苷酸刺激下的免疫应答

为研究包含TIR结构域的接头蛋白(TIR domain-containing adaptor protein,TIRAP)基因在TLR信号介导的先天免疫中的调控作用,通过反转录-聚合酶链式反应和分段扩增获得了尼罗罗非鱼Oreochromis niloticusTIRAP基因的cDNA全长,并对其生物信息学进行分析,利用RT-qPCR法分析TIRAP在健康鱼各组织中的表达情况,以及在无乳链球菌Streptococcus agalactiae、脂多糖(LPS)和聚肌胞苷酸(Poly I:C)刺激后不同组织不同时间点的表达量变化。结果表明:TIRAP cDNA全长2 900 bp,开放阅读框为816 bp,可编码291个氨基酸;系统进化分析显示,尼罗罗非鱼与快乐东方鲷Astatotilapia calliptera TIRAP的亲缘关系较近;TIRAP在尼罗罗非鱼11个组织(肝、皮肤、心脏、肾、胃、鳃、脑、脾、肠、血液和肌肉)中均有表达,其中肌肉中表达量最高(P<0.05),胃中表达量相对较低;人工感染无乳链球菌引起TIRAP基因在肠和肾中上调表达,均在注射后1 d时表达量达到最大值;LPS和Poly I:C刺激引起TIRAP基因在肝、脾和肾中上调表达,但在肠中表达量均低于对照组(0 h)。研究表明,无乳链球菌、LPS和Poly I:C均能诱导TIRAP基因表达,TIRAP基因参与了尼罗罗非鱼免疫应答反应,暗示TIRAP在先天免疫中发挥作用。     

甲磺隆在尼罗罗非鱼体内蓄积的研究

在室外人工水生生态试验装置中,采用放射性同位素示踪技术研究了14C标记的甲磺隆在尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus体内的蓄积过程。结果表明:尼罗罗非鱼不同组织器官对甲磺隆的蓄积量存在一定差异,虽然鱼体肌肉中的放射性比活度在各器官中最低,但肌肉对放射性标记物的蓄积量最高;甲磺隆在鱼体不同组织器官内的蓄积与排出达到动态平衡所需的时间不同,鱼内脏中达到平衡时所需时间最短,而鱼躯干部所需时间最长,鱼内脏对甲磺隆表现为清除排出,而鱼头部和躯干部对甲磺隆均表现为先吸收蓄积,然后再逐渐转化为清除排出。     

甲磺隆在尼罗罗非鱼体内蓄积的研究

在室外人工水生生态试验装置中,采用放射性同位素示踪技术研究了14C标记的甲磺隆在尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus体内的蓄积过程。结果表明：尼罗罗非鱼不同组织器官对甲磺隆的蓄积量存在一定差异,虽然鱼体肌肉中的放射性比活度在各器官中最低,但肌肉对放射性标记物的蓄积量最高;甲磺隆在鱼体不同组织器官内的蓄积与排出达到动态平衡所需的时间不同,鱼内脏中达到平衡时所需时间最短,而鱼躯干部所需时间最长,鱼内脏对甲磺隆表现为清除排出,而鱼头部和躯干部对甲磺隆均表现为先吸收蓄积,然后再逐渐转化为清除排出。     

尼罗罗非鱼肝cDNA文库的构建

用Stratagene技术构建了吉富品系尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus,GIFT strain)肝cDNA文库。首先用TRIZOL法提取肝总RNA,经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测,表明总RNA纯度高且完整性良好。然后分离纯化mRNA,合成双链cDNA之后,加EcoRⅠ接头、EcoRⅠ末端磷酸化、XhoⅠ消化,并用葡聚糖凝胶柱层析分级收集cDNA样品,得到300 mg cDNA,符合建库要求。双链cDNA与Uni-ZAP XR Vector连接后,用GigapackⅢGold Packaging Extract进行体外包装得到cDNA文库。测得的文库滴度为1.25×107pfu/mL,文库噬菌体的滴度符合文库保存和筛选实验的要求。随机挑选20个阳性单克隆噬菌斑进行PCR鉴定后,得出文库的重组率达100%,扩增出的片段主要集中在0.5~2 kb之间,平均插入片段长度约为1.05 kb,结果说明本实验所构建的cDNA文库质量较高。取扩增文库80μL进行体外切割,约含3.6×106个重组子,切割后phagemid量为2.0×106,切割效率为79.4%。经抽提质粒获得质粒DNA约1.2 mg。     

水库鲮和罗非鱼谷胱甘肽转移酶基因表达量与水中蓝藻含量的关系

采用荧光定量的方法对不同季节广州显岗水库鲮(Cirrhinus molitorella)和尼罗罗非鱼(Oreochro-mis niloticu)肝脏中去毒酶基因谷胱甘肽转移酶GST基因的表达情况,并结合不同季节鱼类摄入蓝藻量进行研究,旨在了解鱼体中GST基因的表达量与水体中蓝藻含量的内在联系。结果表明,4月份水库蓝藻暴发,也是鲮和尼罗罗非鱼摄食产毒蓝藻量最多的月份。GST基因的表达情况是:4月份鲮GST基因表达量比其他月份低,可能与鲮对有毒蓝藻的敏感性和耐受力有关,4月份尼罗罗非鱼GSTA及GSTR2表达量最高;其他月份,鲮GSTT表达量最高,而GSTK表达量较低,尼罗罗非鱼GSTA及GSTR2表达量相对较低。结果表明鲮GSTT在去毒过程中起重要作用,但作为环境检测的生物标记,仅适用于环境中藻毒素较低的情况。尼罗罗非鱼GSTA和GSTR2的表达量与食物中的产毒蓝藻生物量多少成正比,因此,尼罗罗非鱼GSTA及GSTR2可作为环境中藻毒素的生物标记,且尼罗罗非鱼可摄入大量有毒蓝藻,通过GST基因去除有毒蓝藻毒性,可用于生物控藻,改善水质。     

尼罗罗非鱼肝cDNA文库的构建

用Stratagene技术构建了吉富品系尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus,GIFT strain)肝cDNA文库。首先用TRIZOL法提取肝总RNA,经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测,表明总RNA纯度高且完整性良好。然后分离纯化mRNA,合成双链cDNA之后,加EcoRⅠ接头、EcoRⅠ末端磷酸化、XhoⅠ消化,并用葡聚糖凝胶柱层析分级收集cDNA样品,得到300 mg cDNA,符合建库要求。双链cDNA与Uni-ZAP XR Vector连接后,用GigapackⅢGold Packaging Extract进行体外包装得到cDNA文库。测得的文库滴度为1.25×107pfu/mL,文库噬菌体的滴度符合文库保存和筛选实验的要求。随机挑选20个阳性单克隆噬菌斑进行PCR鉴定后,得出文库的重组率达100%,扩增出的片段主要集中在0.5~2 kb之间,平均插入片段长度约为1.05 kb,结果说明本实验所构建的cDNA文库质量较高。取扩增文库80μL进行体外切割,约含3.6×106个重组子,切割后phagemid量为2.0×106,切割效率为79.4%。经抽提质粒获得质粒DNA约1.2 mg。