烟草转录因子NtMYC2对激素及 非生物因素胁迫的响应

为探究烟草转录因子NtMYC2对逆境胁迫的响应,以烟草幼苗为试验材料,用50μmol·L~(-1) MeJA,100μmol·L~(-1) ABA,200 mmol·L~(-1) NaCl,20%PEG6000,4℃和黑暗条件下分别进行激素诱导、高盐、模拟干旱、低温和暗胁迫处理,并取处理1,3,6,12,24和48 h时的烟草叶片提取RNA,反转录为cDNA后利用qRT-PCR技术分析NtMYC2的表达情况。结果表明,NtMYC2的表达受MeJA、ABA、干旱、高盐、低温和黑暗胁迫的诱导,且表达模式随激素和胁迫处理的不同而不同。NtMYC2的表达量随MeJA处理时间的延长呈先下降后上升的趋势,随ABA和黑暗处理时间的延长呈逐渐上升的趋势,都在48 h时达最高表达水平,但ABA诱导的表达水平最高,是对照的17.31倍。盐胁迫1h时,NtMYC2的表达量是对照的3.95倍,随后下降,6 h后与对照相当。低温诱导NtMYC2表达上调,在处理6h时表达量最高,48h时最低(与对照无明显差异);模拟干旱胁迫48 h可显著提高NtMYC2的表达水平。此外,利用PlantCARE软件分析NtMYC2启动子区域,结果显示启动子区域包含有脱落酸、生长素、低温、干旱、光等多种非生物胁迫相关顺式作用元件。     

基于慈竹转录组MYB基因的克隆及胁迫诱导表达

从慈竹笋转录组数据库中克隆出2个MYB基因(Be MYB1、Be MYB2)进行生物信息学分析,探讨其响应脱落酸(ABA)、Na Cl、聚乙二醇6000(PEG 6000)胁迫的机制。结果表明,Be MYB1与Be MYB2基因分别编码632个和338个氨基酸;Be MYB1蛋白属于MYB相关蛋白,与小麦Ta MYB48蛋白聚为一枝,具有2个序列模体(motif);Be MYB2蛋白属于R2R3-MYB蛋白,与毛竹Pe MYB2蛋白、水稻Os MYB18蛋白聚为一枝,具有3个motif。Be MYB1和Be MYB2基因均响应了ABA、Na Cl和PEG 6000,但Be MYB2基因对胁迫的响应能力更强,Be MYB1和Be MYB2基因在响应非生物胁迫时发挥重要作用。     

猪白细胞介素-2基因的克隆与表达

根据GenBank上发表的猪白细胞介素-2（Interleukin．2,IL-2）基因序列,设计1对引物。采用RT-PCR技术,以ConA刺激的猪外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出484bp的特异性片段,将其克隆入pGEM-Teasy载体。序列测定表明;扩增片段为猪IL-2基因,该基因与GenBank上发表的猪IL-2基因的核苷酸序列同源性达99．8％。将其定向克隆至原核表达载体pET32a,构建了表达重组猪IL-2的基因工程菌株,经IPTG诱导表达和层析纯化,获得了纯化的重组猪IL-2蛋白。     

苦荞转录因子FtNAC15基因的克隆及表达分析

为研究NAC转录因子在苦荞中的功能,从苦荞发育种子中克隆了一个NAC家族基因,其开放阅读框全长1 098 bp,编码365个氨基酸,将其命名为FtNAC15。基因结构分析表明:FtNAC15基因由3个外显子和2个内含子组成。氨基酸序列多重比对和进化关系分析表明:FtNAC15蛋白与水稻ONAC003、拟南芥ANAC010和ANAC073亲缘关系较近,属于NAC家族转录因子家族中同一亚组。基因上游启动子序列顺势作用元件分析表明:该基因启动子中的顺式作用元件可以分为5类,即启动子核心元件、节律和光照响应元件、转录因子结合位点、非生物胁迫响应元件和激素响应元件。表达分析表明:FtNAC15基因在种子发育的成熟期和干旱胁迫下上调表达,表明其参与调控荞麦种子发育和响应干旱胁迫。     

葡萄VvGW2基因的克隆及表达

为了从葡萄品种美人指中克隆VvGW2基因,并对其结构特征及表达模式进行分析.在NCBI中查找与水稻粒形基因OsGW2同源性最高的葡萄序列,根据葡萄的GW2基因序列设计特异引物.采用改良CTAB法提取美人指花序中总RNA,运用RT-PCR技术进行克隆.利用NCBI数据库中的BLASTn和BLASTp程序进行相似性分析;利用Bioxm2.6推测分析蛋白质分子量和等电点;根据NCBI中Conserved Domains程序进行蛋白质保守域结构预测;用ExPaSy提供的在线SOPMA程序进行蛋白质二级结构预测;利用实时荧光定量RT-PCR研究该基因表达模式.结果显示,从美人指中克隆得到1个GW2基因同源序列,命名为VvGW2基因.VvGW2基因开放阅读框长度为1 272 bp,共编码423个氨基酸,预测蛋白质分子量为46 960,理论等电点为4.68.该基因编码的氨基酸具有GW2蛋白质保守的环指结构域,该环指蛋白质为C5HC2类型.与GenBank中登录的其他植物GW2蛋白质序列相似性为47％ ～53％.根据VvGW2基因所编码的氨基酸序列构建系统进化树,结果显示,葡萄与可可聚为一类.实时荧光定量RT-PCR分析结果显示,VvGW2基因在美人指花或果实的各时期均有表达,其中在开花期基因表达量最高.不同葡萄品种中,VvGW2基因的表达量存在差异,在指形葡萄品种美人指的表达量最高,在圆形葡萄品种中的表达量很低.表明VvGW2基因在不同时期和不同品种中的表达量差异可能与葡萄果实形状相关.     

一种新的番鸭MSTN基因转录本的克隆及真核表达

    利用RT-PCR扩增 MSTN cDNA全序列,然后进行克隆、测序;将重组质粒 pEGFP-N1-MSTN-2通过脂质体瞬时转染番鸭成纤维细胞,用RT-PCR和SDS-PAGE检测其蛋白表达.结果表明,番鸭体内存在2种MSTN基因转录本,MSTN-1(EU336991)和MSTN-2(EU336992),大小分别为1128 bp和754 bp,同源性为94%;且MSTN-2是一个全新的MSTN转录本,含有1个开放阅读框,可编码124个氨基酸.将pEGFP-N1-MSTN-2转染番鸭成纤维细胞48 h后,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白表达,蛋白大小约为14 kDa.这对于进一步研究MSTN基因功能及作用机理具有重要意义.     

菲律宾蛤仔RP2基因的克隆及组织表达分析

采用反转录PCR(RT-PCR)与c DNA末端快速克隆(RACE)法首次从壳长为28 mm的菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum外套膜中克隆出RP2基因(Gen Bank登录号:KF826881)。结果表明:RP2基因c DNA序列长度为1158 bp,包括62 bp的5'端非编码区,41 bp的3'端非编码区,开放阅读框1053 bp,编码350个氨基酸;推导的氨基酸序列具有TBCC(57aa~175aa)和CARP(65aa~102aa)保守结构域,并为非跨膜糖蛋白;经Blast同源性比较表明,菲律宾蛤仔RP2氨基酸序列与太平洋牡蛎Crassostrea gigas的相似性较高(56%),与高等哺乳动物、鸟类、鱼类、两栖类和节肢动物各模式动物之间的相似性为43%~53%,与非洲眼线虫Loa loa的相似性较低(33%);利用实时定量PCR技术检测RP2基因在菲律宾蛤仔不同组织中的表达,结果显示,RP2基因在菲律宾蛤仔雄性性腺中表达量最高,在鳃、水管和外套膜组织中次之,在斧足和闭壳肌中表达量极少,在雌性性腺中无表达。研究表明,RP2基因在菲律宾蛤仔各组织中的表达较为广泛,但不同组织的表达量存在明显差异,本研究结果可为无脊椎动物RP2基因的结构及其功能研究提供基础数据。     

斑鳢嗜水气单胞菌病病原的鉴定及其病理组织学的研究

从患病斑鳢Channa maculata体内分离到一株细菌(FS20100810),经人工感染试验证实为该病的病原菌。该菌株兼性厌氧,为革兰氏阴性杆菌,能运动,无芽孢,无荚膜,能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、七叶苷,氧化酶反应、接触酶反应、吲哚试验和M.R.试验均为阳性。该菌株对斑鳢的半致死浓度为6.83×105 cfu/mL。16S rRNA基因序列与嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila的同源性为99.6%。药敏试验结果显示,该菌株对氧氟沙星、菌必治、先锋噻肟等抗生素敏感,对复方新诺明等中度敏感,对苯唑青霉素、青霉素G、氨苄青霉素耐药。通过对人工感染的斑鳢进行组织切片观察,发现病鱼的鳃、心肌、肝脏、肾脏、脾脏、肠道等器官组织均有明显的病理变化。     

斑鳢嗜水气单胞菌病病原的鉴定及其病理组织学的研究

从患病斑鳢Channamaculata体内分离到一株细菌（FS20100810）,经人工感染试验证实为该病的病原菌。该菌株兼性厌氧,为革兰氏阴性杆菌,能运动,无芽孢,无荚膜,能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、七叶苷,氧化酶反应、接触酶反应、吲哚试验和M．R．试验均为阳性。该菌株对斑鳢的半致死浓度为6．83×10^5cfu／mL。16SrRNA基因序列与嗜水气单胞菌Aeromonashydrophila的同源性为99．6％。药敏试验结果显示,该菌株对氧氟沙星、菌必治、先锋噻肟等抗生素敏感,对复方新诺明等中度敏感,对苯唑青霉素、青霉素G、氨苄青霉素耐药。通过对人工感染的斑鳢进行组织切片观察,发现病鱼的鳃、心肌、肝脏、肾脏、脾脏、肠道等器官组织均有明显的病理变化。     

乌鳢、斑鳢及其杂交F_1代肌肉营养成分和含肉率的比较分析

为了进一步研究杂交鳢的经济性状和杂交优势,采用常规生化分析方法,测定乌鳢Channa argus、斑鳢C.maculata、乌斑鳢C.argus♀×C.maculata♂和斑乌鳢C.maculata♀×C.argus♂的含肉率及肌肉营养成分,对其营养价值进行比较分析,并评价了其肌肉品质。结果表明:乌鳢、斑鳢、乌斑鳢、斑乌鳢平均含肉率分别为68.24%、71.34%、70.71%、70.18%;乌鳢、斑鳢、乌斑鳢和斑乌鳢粗蛋白质含量为20.6%~21.4%,粗灰分含量为1.2%~1.5%,水分含量为76.1%~76.7%,脂肪含量1.7%;必需氨基酸含量占氨基酸总量的49.40%~49.65%,鲜味氨基酸含量占氨基酸总量的38.35%~38.87%,其中乌斑鳢的必需氨基酸指数(EAAI)和鲜味氨基酸含量均高于乌鳢、斑鳢和斑乌鳢。研究表明,乌鳢、斑鳢、乌斑鳢和斑乌鳢肌肉中蛋白质含量均较高,脂肪含量较低,氨基酸种类齐全,必需氨基酸与鲜味氨基酸含量较高,乌斑鳢蛋白质营养水平与乌鳢、斑鳢和斑乌鳢相当,但其蛋白质氨基酸水平所体现的肌肉品质则优于乌鳢、斑鳢和斑乌鳢。     

乌鳢、斑鳢及其杂交F_1代肌肉营养成分和含肉率的比较分析

为了进一步研究杂交鳢的经济性状和杂交优势,采用常规生化分析方法,测定乌鳢Channa argus、斑鳢C.maculata、乌斑鳢C.argus♀×C.maculata♂和斑乌鳢C.maculata♀×C.argus♂的含肉率及肌肉营养成分,对其营养价值进行比较分析,并评价了其肌肉品质。结果表明:乌鳢、斑鳢、乌斑鳢、斑乌鳢平均含肉率分别为68.24%、71.34%、70.71%、70.18%;乌鳢、斑鳢、乌斑鳢和斑乌鳢粗蛋白质含量为20.6%²1.4%,粗灰分含量为1.2%21.4%,粗灰分含量为1.2%¹.5%,水分含量为76.1%1.5%,水分含量为76.1%⁷6.7%,脂肪含量<1.7%;必需氨基酸含量占氨基酸总量的49.40%76.7%,脂肪含量<1.7%;必需氨基酸含量占氨基酸总量的49.40%⁴9.65%,鲜味氨基酸含量占氨基酸总量的38.35%49.65%,鲜味氨基酸含量占氨基酸总量的38.35%³8.87%,其中乌斑鳢的必需氨基酸指数(EAAI)和鲜味氨基酸含量均高于乌鳢、斑鳢和斑乌鳢。研究表明,乌鳢、斑鳢、乌斑鳢和斑乌鳢肌肉中蛋白质含量均较高,脂肪含量较低,氨基酸种类齐全,必需氨基酸与鲜味氨基酸含量较高,乌斑鳢蛋白质营养水平与乌鳢、斑鳢和斑乌鳢相当,但其蛋白质氨基酸水平所体现的肌肉品质则优于乌鳢、斑鳢和斑乌鳢。     

斑鳢内脏白点病病原的分离鉴定

从患内脏白点病的斑鳢Channa maculata肝、脾、肾组织中分离并筛选出一株致病菌GC1,对该病菌的形态学及生理生化特性进行了测定,结果均符合舒氏气单胞菌Aeromonas schubertii的特性。以细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增,得到该菌的部分16S rRNA基因序列,长约1 502 bp。将所测序列与GenBank中序列进行Blast比对并构建系统进化树,结果表明,该序列与舒氏气单胞菌的同源性高达99%。人工感染试验证明,该菌株具有极强的致病力,LD50为104.5CFU/mL。29种药物筛选结果显示:该菌对菌必治、先锋必、头孢氨苄、头孢噻吩、先锋V、萘啶酸、四环素、氧氟沙星、氟罗沙星等18种药物高度敏感;对阿莫西林、红霉素、克拉霉素等7种药物中度敏感;对青霉素G、杆菌肽、苯唑青霉素等不敏感。     

斑鳢内脏白点病病原的分离鉴定

从患内脏白点病的斑鳢Channa maculata肝、脾、肾组织中分离并筛选出一株致病菌GC1,对该病菌的形态学及生理生化特性进行了测定,结果均符合舒氏气单胞菌Aeromonas schubertii的特性。以细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增,得到该菌的部分16S rRNA基因序列,长约1 502 bp。将所测序列与GenBank中序列进行Blast比对并构建系统进化树,结果表明,该序列与舒氏气单胞菌的同源性高达99%。人工感染试验证明,该菌株具有极强的致病力,LD50为104.5CFU/mL。29种药物筛选结果显示：该菌对菌必治、先锋必、头孢氨苄、头孢噻吩、先锋V、萘啶酸、四环素、氧氟沙星、氟罗沙星等18种药物高度敏感;对阿莫西林、红霉素、克拉霉素等7种药物中度敏感;对青霉素G、杆菌肽、苯唑青霉素等不敏感。     

鸭TTR基因cDNA克隆和表达研究

为研究转甲状腺素蛋白(transthyretin,TTR)与肉鸭脂肪代谢的相关性,通过快速扩增cDNA末端技术(RACE)获得北京鸭TTR基因全长cDNA序列,并采用实时荧光定量PCR法对鸭TTR基因表达谱进行研究。结果显示:鸭全长TTRmRNA编码150个氨基酸的前体肽,该肽含20个氨基酸的信号肽和130个氨基酸的成熟肽;与哺乳动物相比,鸭TTR亚基N-末端序列多出的3个氨基酸Val-Ser-His,可能使鸭TTR结合甲状腺素T3的亲合力增加。定量检测结果表明,鸭TTRmRNA在脉络丛中的表达量最高,与鸡、爬行类和哺乳动物类似。本实验证实鸭TTR基因在脉络丛中的表达量比鸡更高,并首次发现TTRmRNA在鸭皮下脂肪组织中表达。     

肉鸡MTHFR基因的克隆和表达水平研究

采用RT-PCR方法克隆了鸡MTHFR(methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)基因,利用生物信息学方法预测蛋白结构,应用定量PCR(qPCR)技术检测组织表达特性。结果表明,鸡MTHFR基因的cDNA序列长度为2 342 bp(GenBank登录号: KU351685),开放阅读框长1 956 bp,编码651个氨基酸;进化树分析表明,鸡MTHFR氨基酸序列与绿头鸭和鸿雁的关系较近。MTHFR氨基酸序列包含保守的MTHFR superfamily结构域,为亲水蛋白;二级结构主要是α-螺旋(38.71%)和无规则卷曲(36.41%);亚细胞定位显示,该蛋白存在于细胞质和细胞核的概率分别为60.9%和30.4%。qPCR分析表明,MTHFR基因在所检测鸡的8种组织中均有表达,其中在心脏中表达水平最高,在腿肌中的表达水平最低;叶酸缺乏试验表明,母鸡叶酸缺乏能极显著增加子代肉鸡MTHFR基因在肝脏中的表达水平(P<0.01)。研究结果可为进一步研究MTHFR基因的结构和功能以及叶酸在家禽生产中的应用提供资料。     

小麦胁迫相关基因TaLEA2的克隆、生物信息学及表达特性分析

【目的】克隆小麦Triticum aestivum晚期胚胎发育丰富蛋白基因并对其进行基因结构、蛋白特性及表达模式分析,为其耐盐性研究奠定理论基础.【方法】搜索小麦EST数据库,通过同源克隆分离并获得小麦晚期胚胎发育丰富蛋白基因,用生物信息学软件分析该基因结构及蛋白特性,荧光定量试验分析该基因的表达模式.【结果和结论】获得1条1 100 bp的核苷酸序列,该序列包含了1个981 bp的开放阅读框,编码1个由326个氨基酸残基组成的蛋白,该蛋白含有2个LEA2结构域,属于第2组LEA蛋白,该蛋白命名为TaLEA2.生物信息学分析显示TaLEA2蛋白具有LEA2家族的典型特征,富含赖氨酸(Lys),不含半光氨酸(Cys),无明显的高级结构,平均亲水系数(GRAVY)为-0.405,稳定系数为25.28,这种氨基酸组成及结构均有利于蛋白的热稳定性及亲水性.实时荧光定量PCR分析表明,TaLEA2基因为组成型表达,同时该基因存在组织表达差异,且表达受不同发育时期影响;该基因调控表达受高盐、低温、病原菌及干旱等胁迫的影响,尤其在干旱胁迫中上调表达明显,但该基因不受外源ABA刺激的影响.推测TaLEA2基因参与了小麦正常条件下的生长发育,同时也广泛地参与了小麦抵御逆境胁迫的响应,尤其在小麦的抗旱胁迫过程中发挥重要作用.