广西麻鸡感染A亚群与J亚群禽白血病病毒的诊断

对疑似患有禽白血病的广西麻鸡进行病理剖检、接种DF-1细胞进行病毒分离以及对细胞培养上清进行p27抗原检测、细胞培养物进行PCR扩增,并对分离到病毒的gp85基因进行测序和分析比较。结果表明,从该病鸡同时分离到了A亚群禽白血病病毒(ALV-A)与J亚群禽白血病病毒(ALV-J),分别命名为ZS14-A株、ZS14-J株。对ALV-A gp85、ALV-J gp85基因的遗传变异分析结果显示,ZS14-A与6株国内外A亚群参考毒株之间的氨基酸同源性为86.3%~87.8%,其中与国外株MAV-1同源性最高,为87.8%。ZS14-J与7株国内外J亚群参考毒株之间的氨基酸同源性为83.4%~96.1%,其中与J亚群原型株HPRS103同源性最高,为96.1%。     

J亚群禽白血病病毒gp85基因在重组杆状病毒中的表达及鉴定

为获得J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的gp85蛋白,将ALV-J的gp85基因克隆至pFastBac-HTA供体质粒,将其转入DH10BacTM大肠杆菌感受态细胞,使gp85基因整合到Bacmid穿梭载体中,构建重组穿梭载体Bacmid-gp85。通过脂质体介导,将重组穿梭载体Bacmid-gp85转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacgp85。Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定结果表明ALV-J gp85蛋白在Sf9昆虫细胞中得到正确表达,表达的重组gp85蛋白分子量约为38 ku。ALV-J gp85重组蛋白在Sf9细胞中的正确表达为其功能研究和应用提供了良好的基础。     

安徽省五华鸡J亚群禽白血病病毒gp85基因分子序列特征分析

为进一步了解J亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)gp85基因的结构、功能及其遗传变异趋势,采用PCR方法克隆了安徽省地方品种五华鸡ALV-J gp85基因序列ALV-J-WH,并将该序列与GenBank数据库中登录的15个gp85基因序列进行了比对分析。结果显示,ALV-J-WH与所比对的氨基酸序列同源性介于85.9%~96.2%之间,与其同源性最高的是来自于国内ALV-J毒株的JN378888基因序列,进化树也证实两者亲缘关系较近;此外,相对其他ALV-J gp85氨基酸序列,ALV-J-WH在223位氨基酸后有10个氨基酸的缺失;对所有全长序列分析结果表明,共有71个可变氨基酸位点,10个高度变异位点,尤其是hr1和hr2区域分布较多。结果表明,ALV-J-WH与国内部分ALV-J毒株分离gp85基因来自共同的原始病毒,但其具有独特的序列特征;ALV-J gp85基因高度易变,部分高频率突变的氨基酸位点可能是ALV-J在抗体免疫选择压下的作用位点。     

A、J亚群禽白血病病毒感染肉用种鸡的诊断

通过流行病学调查、剖检病变和组织病理学观察,结合PCR技术检测病原核酸,确诊肉用种鸡群发生了由ALV—A和ALV—J感染而导致的淋巴细胞性白血病和骨髓细胞瘤型白血病。在检测的6只病鸡中,6只病鸡均感染了ALV—J,2只病鸡感染了ALV-A.     

从J亚群禽白血病肿瘤中检测出禽网状内皮组织增生症病毒

将表现为典型 J亚群禽白血病肿瘤的病料分别接种于鸡胚成纤维细胞和 DF1细胞 ,采用间接荧光抗体试验(IFA)和 PCR方法 ,从这些肿瘤病料中分离和鉴定出 8株 J亚群禽白血病病毒 (AL V- J)。对证明感染了 AL V- J的细胞继续培养 ,并用禽网状内皮组织增生症病毒 (REV)的特异性单抗及引物做 IFA和 PCR,在 8株 AL V- J中 ,有 3株AL V- J的感染细胞中同时有 REV感染。由此表明 ,发生肿瘤的肉鸡中 ,AL V- J和 REV的共感染已相当普遍。将这 3株 REV- SD0 0 0 3、SD0 0 0 4和 SD0 10 2的 3′- L TR用 PCR扩增、克隆和序列比较 ,发现分离的 SD0 0 0 3、SD0 0 0 4和SD0 10 2与国内的另外 2株 REV- SD990 1和 HA990 1的同源性为 96 .7%和 96 .1% ;而与另 1株 REV参考株鸭脾坏死性病毒 (SNV)的同源性高达 99%。     

J亚群禽白血病病毒膜表面糖蛋白基因gp85的克隆与表达

以pGEM-IMC2.2重组质粒为模板扩增禽白血病病毒内蒙株IMC10200gp85基因，构建了转移栽体pFast Bacl-IM gp85，并利用Bac-to-Bac表达系统获得了重组杆状病毒rBac-IMC gp85。转染Sf9细胞后的表达研究表明，重组杆状病毒可高效表达IMC10200的gp85基因，表达产物具有病毒的抗原特异性，与ALV-J单抗JE9有强的间接免疫荧光反应。蛋白质印迹法分析表明，表达产物的分子质量约54ku。     

J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆与表达

构建J亚群禽白血病病毒gp85基因的原核表达载体,并在大肠埃希菌中获得表达。根据原核表达载体pET30的酶切图谱设计引物,以重组质粒pBS-T-env为模板,扩增gp85基因。将此段基因克隆到表达载体pET30上,转化大肠埃希菌BL21,用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达出约为70ku的融合蛋白。获得了gp85基因的表达产物,为研制ALV-J的特异性抗血清及国内ALV-J病毒分子诊断试剂盒奠定了基础。     

J亚群禽白血病病毒与禽网状内皮增生症病毒共感染对肉鸡生长和免疫功能的抑制作用

1日龄肉鸡感染J亚群禽白血病病毒(ALV—J)以及共感染禽网状内皮增生症病毒(REV)后，肉鸡生长发育明显受阻，体重增重明显下降(P＜0．05)，法氏囊、胸腺明显萎缩(P＜0．05)，在用新城疫疫苗免疫后，感染组血清中新城疫抗体效价显著低于对照组(P＜0．05)；在ALV—J和REV共感染后，这种抑制作用更为明显(P＜0．01)。ALV—J单独感染后，鸡对传染性法氏囊病病毒(IBDV)弱毒疫苗免疫后的抗体反应与对照组没有明显差别，但ALV—J与REV的共感染可明显延缓鸡对IBDV弱毒疫苗免疫的抗体反应。     

血管瘤相关J亚群禽白血病病毒ZH-08株的分离与全基因组序列测定

本研究从临床表现为典型血管瘤型禽白血病病例的广东某肉种鸡场的病鸡中,分离到1株J亚群禽白血病病毒(ALV-J),命名为ZH-08。利用ELISA抗原检测、PCR和间接免疫荧光试验对分离株进行鉴定,结果都呈阳性。依据ALV-J原型株HPRS-103前病毒全基因组序列设计并合成3对引物,采用分段扩增的方法完成了分离株的全基因组序列测定。结果显示该分离株基因组序列全长7 597 bp,与已公开的全基因组序列大小比较略有差异,但符合典型的复制完全型反转录病毒的基因组结构,基因序列中不含已知致癌基因。将该分离株的亚群特异性gp85基因序列与国内外各参考株相应序列进行相似性比较,发现ZH-08与YZ9901株相似性最高(93.7%)。基于gp85核苷酸序列的系统进化分析表明:ZH-08株与SD07LK1株的亲缘关系最近。本研究为该毒株的生物学特性以及致病机制研究奠定了基础。     

J亚群禽白血病病毒gp85基因在毕赤酵母中的分泌表达

为获得J亚群禽白血病病毒gp85蛋白,将gp85基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K,构建了pPIC9K-gp85表达载体。将鉴定正确的表达载体经Sal Ⅰ酶切线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,经MD及G418抗性平板筛选后挑取阳性克隆进行PCR鉴定,获得重组酵母菌株GS115/pPIC9K-gp85。对阳性重组菌进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE、Western blotting和Dot-ELISA分析,结果表明,gp85基因在毕赤酵母中获得分泌表达,表达产物与J亚群禽白血病病毒多克隆抗体有良好的反应活性,分泌表达量达40 mg/L。本研究为J亚群禽白血病病毒诊断方法的建立及gp85蛋白的深入研究奠定了基础。     

血管瘤相关禽白血病病毒CD08株的分离与鉴定

通过病理剖检、接种DF-1细胞、ELISA抗原检测以及聚合酶链式反应(PCR)等方法,从湖南常德某集约化养殖场的疑似禽白血病感染的蛋鸡中分离到1株血管瘤相关B亚群禽白血病病毒(ALV-B),命名为CD08.利用特异引物对分离株进行PCR检测和gp85扩增,将测序得到的gp85序列与国内外各亚群禽白血病病毒相同区域序列进行相似性分析,发现其核苷酸序列相似性在44.3%～92.9%之间,其中与属于ALV-B的MAV-2株相似性最高,而与美国ALV-J ADOL-7501株相似性最低.基于gp85核苷酸序列的系统进化分析表明:CD08株的gp85序列与MAV-2株的亲缘关系最近.     

817肉杂鸡肉瘤组织分离出A、J亚型禽白血病病毒

山东某地饲养的36日龄817肉杂鸡生长迟缓并发生颈部肉瘤。取肉瘤组织上清液接种CEF,培养12d,用IFA试验进行病毒鉴定。检测结果表明,从该肉瘤组织分离到A亚型与J亚型禽白血病病毒(ALV-A、ALV-J),命名为SD1005株。取肉瘤组织上清液人工感染817肉杂鸡与SPF鸡进行动物回归试验,结果复制出同样肉瘤。用复制出的新鲜肉瘤分别制备肉瘤细胞与肉瘤组织触片,IFA试验再次验证出ALV-A与ALV-J均为阳性,而且发现ALV-A与ALV-J分别共感染同一个组织细胞。同时,通过PCR方法用针对ALV-A、ALV-J的2对引物扩增并鉴定出肉瘤组织中含有ALV-A、ALV-J。对扩增的ALV-J囊膜糖蛋白(env)基因1 710bp片段进行的遗传变异分析结果显示,SD1005株与14株国内外参考株之间的同源性为88.5%～94.0%,其中与来自白羽肉鸡的美国参考株0661(AF247566)、ADOL-Hc1(AF097731)的同源性最高,分别为94.0%、93.8%。本研究显示,来自817肉杂鸡的肉瘤组织上清液接种鸡可诱发急性肉瘤,其中既检出ALV-A,又检出ALV-J,但急性肉瘤由单个病毒诱发还是与共感染...     

蛋鸡J亚群禽白血病病毒HLJ09MDJ-1株的分离鉴定

为了解蛋鸡中禽白血病当前流行毒株类型及其gp85基因分子特征,在临床症状和病理组织学观察的基础上,采用ELISA抗原检测、特异性PCR以及亚群特异性免疫荧光试验(IFA),证实从黑龙江省某鸡场送检蛋鸡中分离到1株J亚群禽白血病病毒(ALV-J),命名为HLJ09 MDJ-1;克隆了其gp85基因,并进行了序列分析比较。结果表明,该分离株的gp85基因与国内外其他ALV-J毒株的核苷酸同源性为88.2%～98.2%。其中,HLJ09 MDJ-1与英国原型株HPRS-103的同源性最高(98.2%),与美国株ADOL-7501的同源性最低(88.2%),表明HLJ09 MDJ-1的gp85基因与HPRS-103有较近的亲缘关系。本研究从蛋鸡中分离到ALV-J毒株,为研究ALV-J宿主嗜性改变和ALV-J对蛋鸡致病机制提供了素材。     

禽网状内皮组织增生症病毒和A亚群禽白血病病毒共感染对疫苗免疫鸡生长性能和免疫器官的影响

禽为分析不同免疫状态下禽网状内皮组织增生症病毒(reticuloendotheliosis virus, REV)和A亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus, ALV-A)共感染对鸡生长性能及免疫器官的影响,通过对 1日龄和 10日龄常规疫苗免疫鸡群、1日龄灭活疫苗免疫鸡群、1日龄活疫苗免疫鸡群进行REV与ALV-A单感染或共感染,于不同日龄称重,采集免疫器官,对生长性能、免疫器官比重进行比较和分析。结果显示,1日龄鸡单感染或共感染REV和ALV-A均会引起发病、死亡及体重下降,REV、ALV-A单感染组及共感染组平均病死率依次为27.6%、11.6%及31.9%,表明,疫苗免疫刺激增强了REV与ALV-A感染的致病性。10日龄鸡REV、ALV-A单感染及共感染于81日内病死率分别为13.3%、6.7%及20%,低于1日龄感染各相应组,体重下降程度也低于 1日龄感染鸡,表明鸡的日龄越高对REV、ALV-A感染的抵抗力越强。活疫苗与灭活疫苗免疫的比较显示,两种疫苗免疫应激均能引起鸡体重下降明显,且活疫苗免疫对体重的抑制作用更明显。REV单感染和共感染对生长发育的抑制作用高于ALV-A单感染,尤其是共感染对鸡体重的抑制作用最明显。对免疫器官比重的影响方面,1日龄感染时,共感染组胸腺比重显著降低,10日龄感染影响不显著,表明鸡日龄越大对病毒感染的抵抗力越强;常规免疫可引起法氏囊比重下降,但对法氏囊的影响是可恢复的,而REV单感染和共感染会加重常规免疫对法氏囊的损伤,且损伤更持久或不可恢复;ALV-A单感染对法氏囊的损伤影响不明显;单感染和共感染对脾脏比重的影响均不显著。本研究为深入研究REV和ALV-A单感染或者共感染诱导鸡群发生免疫抑制机制积累了重要的实验数据。     

七彩山鸡F亚群禽白血病病毒的分离与鉴定

为了解广东某七彩山鸡种禽场禽白血病流行情况,通过接种DF-1细胞、ELISA抗原检测、聚合酶链式反应(PCR)、囊膜基因克隆测序等方法分离并鉴定出两株ALV-F,分别命名为FGD1801和FGD1802。为进一步了解分离株遗传进化特点,利用PCR方法扩增出env基因并测序,同时与各亚群参考毒株的gp85核苷酸序列进行对比。结果显示:这两个分离株env基因gp85片段长度都为1080 bp,预计编码360个氨基酸,FGD1801和FGD1802分离株gp85基因核苷酸序列的相似性为92.8%,与A、B、E、J和K亚群共26株ALV参考毒株相似性在47.0%~64.5%之间,而与F亚群参考株的相似性在92.0%~92.5%,显著高于其他亚群,且位于同一进化分支上。研究表明,从七彩山鸡分离的FGD1801和FGD1802属于ALV-F,是我国华南地区新发现的ALV亚群。     

J亚群禽白血病病毒中国分离毒SD9902株env-gp85基因的克隆及表达

将 J亚群禽白血病病毒 (AL V- J)急性转化型中国分离毒 SD990 2株的 env- gp85基因的 PCR产物克隆进表达性载体 p GEX- 5 X- 3中 ,构建成重组质粒 p GEX- SD990 2 - gp85。将重组质粒 p GEX- SD990 2 - gp85转化的 BL 2 1大肠杆菌培养并用 IPTG诱导后 ,其菌体的超声波裂解物用 SDS- PAGE电泳分离蛋白质 ,在经考马斯亮蓝染色的 SDS- PAGE凝胶中与非重组载体 p GEX- 5 X- 3的转化菌裂解物相比 ,重组质粒 p GEX- SD990 2 - gp85的转化菌失去了相对分子质量为2 90 0 0的天然谷胱甘肽 (GST)蛋白带 ,但出现 1条相对分子质量为 6 30 0 0的条带 (相当于 AL V- J囊膜 gp85蛋白与GST的融合蛋白的相对分子质量 )。在 Western- blot中 ,AL V- J特异性单抗 JE9仅能从重组质粒 p GEX- SD990 2 - gp85的转化菌中特异性地识别出该 6 30 0 0的蛋白条带 ,而与天然非重组载体 p GEX- 5 X- 3的转化菌不发生反应。而抗 GST的抗体却从天然非重组载体 p GEX- 5 X- 3和重组质粒 p GEX- SD990 2 - gp85的转化菌中分别识别出 2 90 0 0或 6 30 0 0的条带。 Western- blot的结果证明 ,能分别被 AL V- J特异性单抗 JE9及 GST特异性抗体识别的相对分子质量为 6 30 0 0的蛋白质 ,确实为 GST与 AL V- Jgp85蛋白的融合蛋白     

ALV-J诱发鸡成红细胞白血病的临床病例分析

2010—2011年检测3批病例,分别来自泰安新泰的110日龄麻鸡、济宁泗水的90日龄麻鸡和济南20日龄蛋雏鸡。病鸡均表现消瘦、精神萎靡、嗜睡、鸡冠稍苍白或发绀等,死亡率分别为20%、12%和18%。剖检,3批病鸡均可见肝脏、脾脏及肾脏严重肿大,胸腺、肌肉、腺胃等组织器官出血。新泰病鸡肝脏和肺脏表面有明显的白色肿瘤结节。血液涂片与骨髓涂片观察发现大量红细胞转变为体积较大,胞质丰富蓝染,胞核大呈圆形、核内有很纤细的染色质、核周围有空泡的成红细胞,以晚幼成红细胞为主;组织学检查发现,在所有组织脏器血管及间质内均可观察到大量聚集的与血涂片中形态相一致的成红细胞,并且可观察到核分裂相,但未见淋巴细胞聚集。通过血液学和组织学观察不仅排除马立克氏病和网状内皮组织增生症,而且排除中毒及代谢性疾病的可能。以肝脏组织DNA为模板,在3批病鸡中利用PCR检测均扩增出J亚群禽白血病病毒(ALV-J)gp85基因924bp的特异性片段,而A亚群禽白血病病毒(ALV-A)、B亚群禽白血病病毒(ALV-B)阴性。免疫组织化学检测结果表明,发病鸡肺脏和脾脏等含血量丰富的组织内发现组织细胞及成红细胞胞质呈ALV-J抗原阳性。根据以上检测结果确定此3批患有成红细胞白血病病鸡均由ALV-J感染引起。ALV-J引起单纯鸡成红细胞白血病在国内为首次发现。ALV-J在我国鸡群中的多潜能致瘤机制需要进一步的研究。