贵州地方山羊Leptin基因表达的组织分布规律及品种差异

[目的]揭示贵州地方山羊瘦素基因(Leptin)表达水平的组织分布规律及品种差异,为研究Leptin基因与山羊肉质的关系提供参考依据.[方法]以黔东南小香羊、贵州白山羊、贵州黑山羊、黔北麻羊4个贵州地方山羊为研究对象,南江黄羊为对照,采用TaqMan实时荧光定量PCR对其肝脏、肾脏、心脏、肺脏、背最长肌、半膜肌和皮下脂肪中的Leptin基因表达水平进行测定.[结果]Lptin基因在不同山羊品种的肝脏、肾脏、心脏、肺脏、背最长肌、半膜肌和皮下脂肪中呈高表达,均以皮下脂肪的Leptin基因表达水平最高,且在黔东南小香羊、贵州白山羊、贵州黑山羊、黔北麻羊4个贵州地方山羊品种中,皮下脂肪中的表达水平显著高于心脏、肺脏、背最长肌和半膜肌(P＜0.05).除肝脏内Leptin基因表达水平在各品种间无显著差异(P＞0.05)外,在肾脏、心脏、肺脏、背最长肌、半膜肌、皮下脂肪中的表达水平均存在品种差异,且以贵州白山羊最高.[结论]贵州地方山羊品种Leptin基因表达的组织分布规律相似,均以皮下脂肪最高,在品种方面则以贵州白山羊的整体表达水平较高.     

吐鲁番黑羊羔羊MSTN/smad信号通路基因在不同组织的表达研究

[目的]研究MSTN/Smad信号通路基因(MSTN,Smad2,Smad3,Smad4,TGFBR1,TGFBR2)在新生和一周龄吐鲁番黑羊羔羊不同组织的表达差异.[方法]采用实时荧光定量PCR技术RT-PCR分析MSTN/Smad信号通路基因在新生吐鲁番黑羊羔羊股二头肌,股三头肌,半腱肌,半膜肌,背最长肌,尾脂等6种不同部位组织和一周龄羔羊的肝,肺,脾,肠,心,肾等6种内脏组织的mRNA表达水平进行分析.[结果]经过内参基因校正后,其中TGFBR1基因在肺组织中没有表达以外此基因和其他的基因在股二头肌,股三头肌,半腱肌,半膜肌,背最长肌,尾脂,肝,肺,脾,肠,心,肾等不同组织中均有表达.[结论]MSTN/Smad信号通路基因在各种不同组织中均有表达,对各组织的生长发育有影响.     

贵州白山羊肌肉生长抑制素(MSTN)基因生物信息学预测与系统进化分析

本研究旨在解析贵州白山羊肌肉生长抑制素(MSTN)基因的结构特性,为该基因功能探究提供理论依据。基于生物信息学及比较基因组学方法,对NCBI数据库中已登录的贵州白山羊MSTN基因完整编码区序列(CDS)核苷酸组成特性及编码蛋白的相关结构开展预测及分析,构建了15个物种MSTN基因系统进化树。结果表明,贵州白山羊MSTN基因CDS长度为1 128bp,共编码375个氨基酸,由3个外显子和2个内含子构成,其AT含量均高于GC。贵州白山羊MSTN蛋白属混合型二级结构,存在无规则卷曲、延伸链和α-螺旋,为弱碱不稳定亲水蛋白质;包括1个18个氨基酸的潜在信号肽,无跨膜区,形成5对二硫键,含有16个磷酸化位点;278～375位氨基酸为转化生长因子-β样结构域。贵州白山羊MSTN基因与绵羊、牛等牛科动物的亲缘关系较近,与鸡形目原鸡和绿头野鸭的亲缘关系较远。本研究可为贵州白山羊MSTN基因分子遗传学及其表达调控研究奠定理论基础。     

鸭肌肉生长抑制素基因的多态性

为了研究肌肉生长抑制素基因(MSTN)在鸭群体中的遗传变异情况,本试验以莆田黑鸭、连城白鸭、绍兴鸭、攸县麻鸭、建昌鸭及北京鸭为材料,运用连接酶检测反应(PCR-LDR)的方法对MSTN基因5′-调控区C1024GSNP位点进行基因分析,并分析了该位点在群体中的基因型频率、等位基因频率和Hardy-Weinberg平衡情况.结果表明:MSTN基因C1024G位点在7个鸭品种中均检测到CC、CG和GG 3种基因型.在连城白鸭、攸县麻鸭和高邮鸭中,基因型CC占优势,且以连城白鸭为最高(0.72);在莆田黑鸭和建昌鸭中,基因型CG占优势;在高邮鸭中,基因型GG占优势,而其他鸭品种中基因型GG比例均较低;在绍兴鸭中基因型CC、CG出现的频率相同.建昌鸭和北京鸭中等位基因G的频率高于等位基因C的频率,其他鸭品种中均为等位基因C的频率大于等位基因G的频率.莆田黑鸭、连城白鸭、绍兴鸭、攸县麻鸭、北京鸭和高邮鸭MSTN基因在1 024位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05),仅建昌鸭不符合Hardy-Weinberg平衡状态(P＜0.05).     

鸡肌肉生长抑制素在机械负荷引起肥大的肌肉中高表达

肌肉生长抑制素（MSTN）基因是TGF-β超家族的一种新基因,仅在骨骼肌特异表达并作为肌肉生长的负调控因子。机械牵拉能够引起完全分化的鸡受累的肌肉肥大,并诱导肌肉生长抑制素在转录水平和蛋白水平表达升高。     

肌肉生长抑制素基因—Myostatin的研究进展

肌肉生长抑制素又称 GDF-8,属 TGF-β超家族,是骨骼肌的负调控因子,通过调控成肌细胞的增殖影响肌肉的生长与发育,其变异会导致肌细胞增生与肌纤维肥大。Myostatin 基因功能靶向缺失的小鼠会发生显著的肌肉增生,该基因的变异也是牛双肌性状形成的重要原因。肌肉生长抑制素的研究将为肌肉萎缩等相关性疾病的治疗及动物育种提供新的途径。     

不同鹅种肌肉生长抑制素基因表达差异研究

以太湖鹅和罗曼鹅为研究素材,应用实时荧光定量PCR技术和ELISA技术,对MSTN基因在2个鹅种中的表达差异及其与骨骼肌生长的相关性进行比较研究。结果发现,2个鹅品种下丘脑、垂体、肝脏中MSTN基因基本都不表达,只在胸肌、腿肌中表达。罗曼鹅腿肌重显著高于太湖鹅,太湖鹅腿肌MSTN基因表达量却极显著高于罗曼鹅;腿肌率和胸肌MSTN蛋白表达量呈显著正相关,腹脂率和胸肌MSTN基因表达量呈显著正相关;表明MSTN基因发挥着抑制骨骼肌生长的作用,同时可以促进脂肪的积累。在2个鹅种中,公鹅腿肌MSTN蛋白表达量高于母鹅,表明70日龄时的仔鹅腿肌生长母鹅快于公鹅;腿肌MSTN基因表达量显著高于胸肌,提示70日龄时的仔鹅胸肌生长速度远远大于腿肌。     

绵羊肌肉生长抑制素基因外显子Ⅰ单核苷酸多态性分析

利用PCR-SSCP和DNA测序法,检测了德国肉用美利奴、特克塞尔、多浪羊和陶塞特等4个绵羊品种肌肉生长抑制素基因外显子Ⅰ的单核苷酸多态性。研究结果表明:在德国肉用美利奴肌肉生长抑制素基因外显子Ⅰ第 84位(相对翻译起始位点ATG)发现G→A的突变,但仅存在两种基因型,即GG和GA,基因型频率分别为0.6944和0.3056。该突变位点编码的氨基酸序列不发生改变,在其余样品均未检测到多态。     

藏猪肌肉生长抑制素基因外显子1的PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP技术分析了藏猪肌肉生长抑制素(MSTN)基因的单核苷酸多态性.根据GeneBank上猪MSTN基因全序列设计的两对引物,扩增了MSTN基因完整的外显子1,经SSCP分析,只有P1扩增产物存在多态性,表现为3种基因型(AA、AC和CC),A和C两种等位基因的频率分别为46.88%和53.12%.测序分析发现,CC型与AA型相比在MSTN基因编码区的第71bp处有一个A→C的单碱基突变,该突变导致编码的第24位氨基酸由天冬酰胺改变为苏氨酸.     

四个山西地方山羊品种Pit-1基因多态性的研究

垂体释放因子1基因(Pit-1)是动物经济性状的重要候选基因之一。采用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术对4个山西地方山羊品种的Pit-1基因进行多态性检测和分析,以了解该基因在这些品种中的遗传变异。结果表明:该基因座存在HinfⅠ限制性酶切多态性,表现AA和BB两种基因型,频率分别为0.01和0.99。洪洞奶山羊和吕梁黑山羊因突变而显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P0.05)。利用PCR-SSCP检测出5种基因型。优势等位基因均为B,基因型频率的品种间差异明显。吕梁黑山羊和黎城大青羊显著偏离平衡状态(P0.05)。中性检验表明,4个品种处于中性突变或遗传漂变过程中。各群体的期望杂合度和观察杂合度较为接近。基于两种技术的Fst值分别为0.0102和0.0197,说明总群体中大约只有1%～2%的变异来自群体间,群体间的遗传分化较弱。     

LEPR基因在贵州白山羊组织中的表达

为探究瘦素受体基因(LEPR)在贵州白山羊组织中的表达规律,利用实时荧光定量PCR技术检测LEPR基因在贵州白山羊心、肝、脾、肺、肾、肠、背肌、腿肌和皮下脂肪9个组织的表达量。结果表明:目的基因LEPR和内参基因GAPDH的熔解曲线均呈单一峰形,说明所选条件可准确定量LEPR基因在贵州白山羊各组织中的相对表达量。具体表达量为脂肪脾肺背肌肠肝肾心腿肌。     

贵州黑山羊IL-2基因的克隆及序列分析

根据Gen Bank中山羊IL-2基因序列(登录号:NM_001287567)设计一对特异性引物,采用RT-PCR技术从贵州黑山羊外周血淋巴细胞中扩增IL-2基因,并将其克隆到p MD19-T载体上,构建IL-2基因克隆质粒,通过质粒PCR、双酶切和序列测定进行鉴定,对其核苷酸、氨基酸进行了比对分析并绘制系统进化树。结果表明,贵州黑山羊IL-2基因大小为468 bp,编码155个氨基酸。该基因与山羊、绵羊、藏羚羊、蓝牛羚、林麝、猪、牛、猫、大熊猫、犬、人、鼠、鸡等动物的核苷酸一致性在39.6%~100%,氨基酸一致性在26.7%~100%,遗传进化树表明,贵州黑山羊IL-2基因与鸡亲缘关系最远。     

猪肌生成抑制素基因成熟蛋白编码序列的表达与纯化

猪肌生成抑制素基因myostatin(MSTN)的cDNA在去除信号肽后,对成熟蛋白编码序列PCR扩增出1.2kb片段,将该片段与pMD18-T载体连接,转化JM109受体菌细胞,筛选阳性克隆,并测序分析,结果表明其与设计序列完全一致。将该克隆载体的质粒DNA用带有BamH 和Sal 内切酶识别序列的另1对引物进行PCR扩增,将回收的1.2kbPCR目的片段定向克隆到pET28a(+)表达载体上,成功地构建了猪肌生成抑制素成熟蛋白编码的原核表达载体。对成功构建的表达载体阳性克隆在LB液体培养基中用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳显示,重组菌表达的MSTN蛋白是以包涵体的形式表达的;SDS-PAGE凝胶经薄层扫描仪扫描分析,表达的MSTN包涵体蛋白占菌体不溶性蛋白含量的27.9%,表达的MSTN分子质量为41.4513ku。因为所构建的表达载体中含六聚组氨酸标签,用His-trap亲和柱进行纯化后,纯度可达92.5%。     

山羊痘病毒结构蛋白P32基因的表达

将山羊痘病毒结构蛋白P32基因从重组质粒pMD-P32中亚克隆至pGEX-4T-1原核表达载体上,用构建的重组表达质粒pGEX-P32转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,1 mmol/L IPTG诱导表达,细菌裂解物经SDS-PAGE检测到分子量约为58 ku的目的蛋白,与预期的产物大小一致.Western-blotting表明该重组蛋白可被山羊痘阳性血清所识别.     

山羊Eda基因的克隆、序列分析及表达

【目的】克隆山羊Eda基因CDS区全序列,并对其进行序列分析,研究Eda基因在毛囊生长周期不同阶段皮肤组织中的表达规律。【方法】以太行黑山羊为研究对象,采集其毛囊生长休止期、生长期和退行期背部皮肤组织,采用RT-PCR技术克隆山羊Eda基因,通过在线软件Blastn进行基因cDNA序列分析,用SMART进行氨基酸序列分析,利用SWISS-MODEL软件进行蛋白质结构分析;以β-actin为看家基因,采用实时荧光定量PCR技术对 mRNA在毛囊生长不同时期皮肤组织中的表达规律进行分析。【结果】太行黑山羊Eda-A1基因CDS区全长1 176 bp,编码391个氨基酸;Eda-A2比Eda-A1少6个碱基（nt1161-1166）,编码389个氨基酸;山羊Eda蛋白氨基酸序列相似性在不同物种间均大于90%。SMART分析表明,CDS编码的蛋白质包含了TNF、跨膜区以及胶原等结构域。SWISS-MODEL软件预测结果表明,Eda-A2与Eda-A1在蛋白质表面结构上存在明显差异。毛囊退行期的皮肤组织中,Eda mRNA表达量最高,且极显著高于毛囊休止期和毛囊生长期（P＜0.01）,毛囊生长期的表达量中等且显著高于休止期（P＜0.05）,毛囊休止期的表达量较低。【结论】Eda基因CDS区在物种间保守性较强,Eda mRNA在毛囊生长周期不同阶段表达量有差异,推测Eda基因对毛囊生长周期的调控有一定影响。     

人α-乳白蛋白质基因的克隆及其在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达

采用PCR方法从人类基因组DNA中扩增hα-LA基因,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,并进行测序验证。通过双酶切法将测序正确的hα-LA亚克隆至真核表达载体pCEP4,构建真核表达载体pCLA并进行酶切鉴定。用脂质体法将pCLA转染至奶山羊胎儿成纤维细胞中,用RT-PCR法检测细胞中hα-LA基因mRNA的表达,用Western-blotting法检测培养上清液中hα-LA蛋白质的表达。结果显示:克隆的hα-LA基因序列完全正确,pCLA酶切鉴定正确,RT-PCR检测到转染细胞中hα-LA基因mRNA的表达,Western-blotting检测到转染细胞培养上清液中hα-LA蛋白质。表明所克隆的hα-LA基因组DNA能够在奶山羊胎儿成纤维细胞中正确转录和翻译。     

罗氏沼虾TLRs基因表达差异分析

[目的]探究罗氏沼虾Toll样受体(TLRs)基因(MrToll1、MrToll2和MrToll3)在不同组织中及感染溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)后不同时间鳃组织的表达量差异变化,为揭示罗氏沼虾TLRs在应对病害等免疫方面的表现和作用机理提供参考依据.[方法]利用实时荧光定量RT-PCR分别检测MrToll1、MrToll2和MrToll3基因在罗氏沼虾肌肉、鳃、肝胰腺、心脏、胃、肠、血淋巴、神经节、眼柄等不同组织中的相对表达量,并以同样方法检测罗氏沼虾感染溶藻弧菌后TLRs基因的相对表达量变化情况.[结果]罗氏沼虾MrToll1、MrToll2和MrToll3基因在各组织中广泛表达,但存在组织表达差异性.MrToll1和MrToll2基因在鳃组织中的相对表达量最高,分别是在肝胰腺中相对表达量的19.26和20.03倍;MrToll3基因在神经节中的相对表达量最高,是在肝胰腺中的10.13倍.感染溶藻弧菌悬液后,罗氏沼虾死亡率随时间的推移不断升高,至注射感染72 h时死亡率达峰值(64%),随后不再出现死亡.感染溶藻弧菌后罗氏沼虾MrToll1基因表达量呈先升高后下降的变化趋势,注射感染后24 h的表达量达峰值;Mrtoll2基因表达量呈下降—升高—下降—升高的波动变化趋势,注射感染后24 h的表达量达峰值;MrToll3基因表达量急剧下降,且维持在较低水平.[结论]罗氏沼虾MrToll1基因是鳃组织抵御细菌感染的主要应答基因,MrToll2基因可能参与鳃组织的其他免疫活动,MrToll3基因的调控机制尚未清晰.     

猪myostatin基因5’调控区的酶切多态性分析

用 PCR- RFLPs分析方法 ,对长白、大白、杜洛克、军牧 号、民猪 5个猪种的 myostatin基因 5’调控区进行了酶切多态性分析。结果表明 ,长白、大白、杜洛克以等位基因 T为主 ,检测的 4 0头军牧 号的等位基因全部是 T,民猪 3种基因型均有 ,且频率近乎相等。统计分析表明 ,3种基因型的分布在长白、大白、杜洛克、军牧 号间差异不显著 ,而民猪同这 4个品种间的差异极显著     

鸡、鹅肌肉生成抑制因子基因的克隆及序列分析

采用反转录．聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从鸡胚、鹅胚中扩增得到肌肉生成抑制因子基因,分别克隆到pGEM-T Easy载体中进行序列测定．结果表明,克隆得到的MSTN基因序列均由1128个核苷酸组成,MSTN基因序列同源性为94．6％,推导相应氨基酸序列的同源性达97．9％．