桑黄化型萎缩病病原体16S rRNA基因的序列分析

用PCR法克隆了中国桑黄化型萎缩病病原植原体的 16SrRNA基因 ,并进行了序列分析。结果表明 :克隆的基因大小为 1372bp ,与日本桑萎缩病病原植原体 16SrRNA的同源性高达 99 85 % ,只存在个别碱基的突变。Blastj检索结果显示与中国桑黄化型萎缩病病原体 16SrRNA的基因同源性高达 99%的有来源于玉米、洋葱、土豆等5 0多种其它植物的植原体 16SrRNA基因 ,表明植物萎缩病病原体 16SrRNA基因具高度保守性。     

桑黄化型萎缩病病原单克隆抗体的制备

从桑树黄化型萎缩病组织中,提纯病原类菌原体(MLO),制备成功桑MLO单克隆抗体。     

用组织培养法保存、增殖桑黄化型萎缩病病原的研究

取岛桑（ＭｏｒｕｓａｃｉｄｏｓａＧｒｉｆｆ）苗茎尖进行组培脱毒，昆虫介体接种病原，继代培养，获得无休眠期的标准桑黄化型萎缩病株和病原类菌原体驯化株。通过对ＭＳ培养基成分的调节，可以批量繁殖病株和类菌原体。     

桑黄化型萎缩病病原体在越冬病枝条内的消长情况

<正>桑黄化型萎缩病病原类菌原体(MLo),在桑树生长季节中,病原主要分布在病枝条皮部、叶柄、叶脉、叶肉组织中。但以桑树枝条新梢幼嫩组织中病原菌含量较多。以往实验证实,桑树在生长季节中,病枝条上的各芽都带有病原,套接健康桑苗都能发病。但对越冬病桑枝条是否带毒未开展系统性研究,以往曾提出越冬病枝条经冬季低温可以失     

不同桑树种质资源对桑黄化型萎缩病的抗病性鉴定

<正> 桑树黄化型萎缩病是桑树的主要病害,我国各蚕区均有发生。对该病的防治目前主要采取挖除病株,栽植抗病品种和消灭媒介昆虫等的综合防治措施,其中栽植抗病良种是最经济而有效的。为此,作者于“七五”期间对我所保存的较优良的桑树种质资源进行了桑黄化型萎缩病的抗病性鉴定,以明确各种质资源的抗病能力,提供生产上选择抗病良种及育种上选择亲本提供依据。本鉴定于1986～1991年在桑黄化型萎缩病发生的重病区—湖州市洋西乡汤楼村进行,供鉴材料156份,于1986年春栽植,每份材料栽植10～20株,亩栽桑1000株,在管理     

桑萎缩病病原类菌原体的提纯、致病性及抗血清制备研究

用0．3mol／L甘氨酸缓冲液从病桑嫩叶提取病原类菌原体（MLO）,提取液上清经硅藻土柱层析分离,其洗脱液用高速离心浓缩,制备成部分纯化的病原MLO提纯物。采用显微注射技术,将提纯病原注射到介体昆虫体内,使病原在昆虫体内繁殖,再将获毒虫放饲在健桑苗上传毒接种,获得表现典型萎缩病症状的病株。病柔韧皮部筛管细胞的超薄切片在电镜下观察到大量病原MLO粒子,证实提纯MLO具致病性。同时用提纯病原为免疫抗原制备兔抗血清,抗血清用健桑提取液吸收后,获得仅与病桑抗原产生反应的特异抗血清,免疫电泳测验、仅产生一条沉淀带。     

从浙江蚕区桑园发生桑黄化型萎缩病植株分离植原体的分子鉴定

从浙江省蚕区的桑园内采集表现桑黄化型萎缩病症状的植株叶片,并提取叶脉总DNA,通过巢式PCR和常规PCR方法对桑黄化型萎缩病植原体分离物(MYD-ZJ)的16S r DNA、延伸因子基因tuf和核糖体蛋白基因rp进行扩增及克隆,分别得到大小为1 239 bp、842 bp和1 240 bp的序列。对这些基因片段序列进行系统进化分析,结果表明,MYD-ZJ的16S r DNA序列与来自山东、安徽等省感病桑树分离桑黄化型萎缩病植原体的同源序列的相似度为98%,在进化树中位于同一进化支;MYD-ZJ的tuf基因序列与来自山东省的桑黄化型萎缩病植原体的同源序列的相似度为89%~100%,并与该同源序列以及同样来自山东省的枣疯病植原体、苦楝丛枝病植原体等聚为一支;MYD-ZJ的rp基因序列与来自山东省、安徽省的桑黄化型萎缩病植原体的同源序列的相似度为100%,在进化树中位于同一进化支。研究结果明确了MYD-ZJ属于翠菊黄化植原体组的16SrⅠ-B亚组、tufⅠ-B亚组及rpⅠ-B亚组。     

桑黄化型萎缩病的发生及其防控对策

调查了桑黄化型萎缩病的发生史、症状及发生规律,提出了植物检疫、农业防治、物理机械防治、化学防治四个方面的桑黄化型萎缩病防控对策。     

山东兔场皮肤真菌病病原rDNA-ITS区序列测定及分析

利用皮肤真菌核糖体内转录间隔区（Internal transcribed spacer,ITS）序列通用引物,对采自山东地区主要兔场的皮肤真菌病的16株分离菌进行了PCR扩增,ITS区的克隆、测序、序列变异及遗传进化关系分析。经与Gen-Bank核酸序列数据库数据比对结果表明：16株病菌分别为须癣毛癣菌（12/16,75%）、犬小孢子菌（2/16,12.5%）、石膏样小孢子菌（2/16,12.5%）;不同病原菌的5.8SrDNA序列高度保守,而ITS区的变异性则较高;对该区序列的聚类分析表明,不同种菌株ITS1比ITS2在碱基构成和序列长度上有更大变异;而种内各菌株的ITS1和ITS2在长度上均没有变异,碱基构成上存在微小的变异,可基于该区进行兔皮肤真菌的分类鉴定。该研究确定了兔皮肤病原PCR检测特异引物的靶序列,为兔皮肤真菌病病原的特异性分子鉴定提供了可靠的靶标,为兔皮肤真菌的科学分类提供了分子依据。     

桑花叶型萎缩病病原研究初报

通过往返双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(Return-PAGE)和垂直双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)检测,发现从桑花叶型萎缩病的病叶组织中提取的总核酸中存在环状小分子RNA,即类病毒RNA。根据桑花叶型萎缩病的症状和发生规律以及植物类病毒病的定义,认为这种环状小分子RNA可能是引起桑花叶型萎缩病的病原。     

桑黄化型萎缩病抗病性鉴定技术研究进展

就桑品种对黄化型萎缩病抗病性鉴定技术的研究进行了综述。介绍了 7种鉴定技术的操作方法 ,并对其进行了简要评价。     

一种引起成年桑树根部腐烂的病害及致病菌分离与初步鉴定

对山西省运城市投产桑园内桑树发生根部腐烂、枝叶萎凋枯死病害的病原菌进行分离鉴定,为病害的有效控制提供理论依据。从桑树发病植株根部分离到一株病原菌(暂命名为TY.GF1),将该病原菌接种到健康桑树根部,其致病症状与桑根腐病的症状相似。该病原菌在PDA培养基上的培养性状及孢子形态特征与米根霉(Rhizopus oryzae)相似。通过病原菌TY.GF1的核糖体18S rDNA及内部转录间隔区(ITS)序列PCR扩增和测序,分别获得长度为1 805、627 bp的序列片段。基于18S rDNA及ITS序列构建的进化树显示,与TY.GF1菌株亲缘关系最近的为米根霉和淀粉霉(Amylomyces rouxii)。结合病原菌致病性特点及形态特征与18S rDNA、ITS序列分析结果,初步鉴定这种新发生的桑树病害为桑根腐病,其病原菌可能为米根霉。     

桑树黄化型萎缩病植原体溶血素基因MDPH的克隆及生物信息学分析和原核表达

溶血素为细菌分泌的能够使细胞溶解的毒素,是病原菌重要的毒力因子。利用同源克隆技术得到桑树黄化型萎缩病植原体溶血素全长基因,命名为MDPH(GenBank登录号:HQ891118)。MDPH全长717 bp,编码238个氨基酸,预测蛋白质分子质量为27.3 kD,等电点为9.29,氨基酸序列与其它植原体中已分离的溶血素有很高的同源性。蛋白质序列结构预测表明:MDPH的二级结构中富含α-螺旋,其次为β-折叠和无规卷曲,而β-转角仅占5.46%。对蛋白质序列的理化特征预测表明:MDPH有多个亲水和疏水区域,且疏水性强于亲水性;易形成跨膜螺旋,具有7个显著跨膜结构区;蛋白的抗原性较强,不含有明显的信号肽序列,为非经典分泌蛋白。将MDPH的编码区插入原核表达载体pET30a(+),并转化到E.coli BL21中,经过IPTG诱导,MDPH在BL21菌株中成功表达。研究结果为深入探讨MDPH的功能及植原体的致病机制奠定了基础。     

应用16S rRNA基因序列鉴定柞蚕空胴病病原菌

20世纪70年代末,采用形态分类学方法,将引起柞蚕空胴病的致病菌鉴定为柞蚕链球菌(Streptococcus pernyi sp.nov)。分别提取已分离柞蚕空胴病的5株病原菌株的基因组DNA,PCR扩增16S rRNA基因片段,经克隆、测序后,与GenBank中登录的相关肠球菌、链球菌菌株的16S rRNA基因序列进行同源性比对并构建系统进化树。结果表明,供试的5株菌株的16S rRNA基因序列相似性在99.5%～99.9%之间,相互之间存在着10个可变位点,推测5株菌株属于同一个菌种;5株菌株的16S rRNA基因序列与肠球菌属(Enterococcus)16S rRNA基因序列的相似性较高,在92.4%～99.8%之间,而与链球菌属(Streptococcus)16S rRNA基因序列的相似性相对较低,在87.3%～87.8%之间;5株菌株与肠球菌属在系统进化树上聚为一类。基于菌株的16S rRNA基因序列分析,鉴定柞蚕空胴病的病原菌应归属于肠球菌属。     

产丁二酮的嗜热链球菌的筛选和鉴定

从酸马奶中分离出五株链球菌，其中KM18的丁二酮的产量为20mg／mL。利用PCR扩增该菌的16SrRNA基因，将测序结果同该属内菌株的16SrRNA基因序列作多序列比较，并建立链球菌属的系统发育树。结果表明，KM18的16SrRNA基因序列同S．thermophilus的同源性百分比为98．2％。综合系统发育树的结果，将KM18鉴定为S．thermophilus。菌株KM18的16SrRNA基因序列已经在GENBANK申请国际序列注册号，为D0176426。     

锦鲤溃疡病病原菌的分离及16SrRNA鉴定

为寻找引起养殖锦鲤(Ornamental carp)病害的致病因子,从北京地区自然患病的锦鲤体内分离疑似致病菌,再将此菌人工感染健康锦鲤,确定致病菌。采用生理生化鉴定与16S rRNA基因序列的系统发育学分析相结合的方法确定该致病菌株的系统发育地位,同时采用琼脂扩散法测定该菌对抗菌类药物的敏感性。试验结果表明,从病鱼体内分离得到革兰氏阴性杆菌CL0901,人工感染健康锦鲤后,能够引起鱼生病甚至死亡,症状与自然发病症状一致。菌株CL0901与Aeromonas veronii ATCC 35624T的16S rRNA基因序列相似性达99.9%,构建系统发育树,并结合形态特征与生理生化测定结果,将该致病菌鉴定为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。在21种抗菌类药物对该菌的抑菌试验中,左氧氟沙星、诺氟沙星和洛美沙星等10种药物的抑菌效果较好。本研究为进一步防制锦鲤养殖病害提供依据。     

广州桑树植原体分子检测及多样性初探

采用植原体16S-23S rDNA区段的通用引物对P1/P7和巢式引物对Rm16F2/Rm16R1,建立了快速准确的桑树植原体巢式PCR检测技术。对广州的两个桑树品种资源圃中的部分桑树品种进行了植原体分子检测,结果在两个资源圃中均发现有植原体存在。对巢式PCR的扩增产物(16S rDNA片段)进行了限制性片断长度多态性(RFLP)分析,显示出3种RFLP带型,暗示桑树植原体存在多样性。对所得植原体16S rDNA片段进行序列测定,并与其它植物植原体作亲缘关系分析,结果表明该植原体的16S rDNA序列与其它植物病原植原体之间的同源性为83.3%~99.9%,并初步判断所检测到的桑树植原体属于16S rI组。     

Isolation and Identification of Bacterial Pathogen of Pig Arthritis in Yunnan

This experiment was conducted to investigate the bacterial causes and drug resistance of pig arthritis of four farms in Yunnan.Through isolation and culture,biochemical test,drug sensitive test,animal pathogenicity experiment and 16S rRNA identification,we analyzed the samples from four farms with pig arthritis symptom.The results showed that in all 96 samples,55 samples were Staphylococcus aureus positive,the positive rates were 20.8%,83.3%,91.7% and 33.3% in A,B,C and D farms,respectively;56 samples were Streptococci positive,the positive rates were 95.8%,21.7%,25.0% and 83.3%,respectively;Mixed infection rates were 20.8%,21.7%,25.0% and 33.3%,respectively.Therefore,Staphylococcus aureus was the major bacterial pathogen which caused pig arthritis in B and C farms;Streptococci was the major bacterial pathogen which caused pig arthritis in A and D farms;Two kinds of bacteria were more sensitive to ceftriaxone,minocycline and ciprofloxacin,and resistant to multiple antibiotics.