番鸭细小病毒VP3基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为获得针对番鸭细小病毒VP3蛋白的多克隆抗体,根据已发表的该病毒基因序列设计一对引物,利用PCR扩增出VP3基因,将其克隆到原核表达载体p ET-32a,转化感受态细胞BL21(DE3)。经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测重组蛋白。将重组蛋白切胶免疫BALB/c小鼠,制备抗番鸭细小病毒部分结构蛋白的多克隆抗体。结果显示成功获得VP3基因,构建的原核表达重组质粒成功表达预期的重组蛋白,免疫小鼠获得的多克隆抗体能与番鸭细小病毒及VP3蛋白反应。表明制备的多克隆抗体可用于MDPV的检测,并为进一步研究MDPV奠定了基础。     

番鸭细小病毒YL08株VP2和VP3蛋白的原核表达及免疫反应性

为获得番鸭细小病毒(muscovy duck parvovirus, MDPV)重组结构蛋白VP2、VP3,本研究以含有MDPV YL08株VP1基因的重组载体pET-32a-VP1为PCR扩增模板，分别亚克隆VP2、VP3基因。构建了重组载体pGEX-6p-VP2、pGEX-6p-VP3并将它们转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中，分别构建了重组菌株pGEX-6p-VP2/Rosetta(DE3)和pGEX-6p-VP3/Rosetta(DE3)。2种重组菌株在IPTG诱导下分别获得了重组蛋白GST-VP2和GST-VP3,分子质量分别为91、86 ku。Western blot分析结果表明，重组蛋白GST-VP2和GST-VP3可特异性结合GST-tag单克隆抗体和MDPV感染番鸭血清，免疫反应性良好。Dot-ELISA比较分析结果表明，在等质量条件下，GST-VP2的免疫反应性强于GST-VP3。     

番鸭细小病毒M91G27株VP3基因的克隆与序列测定

利用ＰＣＲ技术,从纯化番鸭细小病毒Ｍ９１Ｇ２７毒株鹅胚尿囊液中扩增出病毒结构多肽ＶＰ３基因。将该ＰＣＲ扩增片段克隆入ｐＵＣ１８质粒载体的ＨｉｎｃⅡ和ＳａｃⅠ位点之间,酶切分析筛选到含１．６ｋｂ基因片段的重组质粒ＭＰ１３。结果表明：该片段与国外已报道毒株核苷酸序列有９８．８％的同源性,氨基酸序列有９８．１％的同源性,证明该重组质粒是ＶＰ２基因的克隆。     

表达鹅细小病毒VP3基因重组腺病毒的构建与鉴定

[目的]构建表达鹅细小病毒 （GPV） VP3基因的重组腺病毒,为机体免疫试验和免疫效果评价奠定基础.[方法]以重组质粒pcDNA-VP3为模板,以GPV-VP3为目的基因,构建GPV-VP3重组腺病毒载体,通过转染获得能稳定表达GPV-VP3基因的重组腺病毒,通过IFA和Western-blot检测GPV-VP3基因的表达情况.[结果]扩增到的GPV-VP3基因全长为1 605 bp,线性化的重组腺病毒穿梭质粒pCR259-VP3能在QBI-HEK293细胞中瞬时表达GPV-VP3基因,表达蛋白的分子量约为60Ku.[结论]该重组腺病毒的构建将为GPV新型疫苗研发和后期体内试验奠定基础.     

A型口蹄疫病毒VP3基因的克隆及原核表达

从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT- PCR获得cDNA.并根据FM-DV全基因组序列设计了1对针对VP3基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP3并亚克隆入pMD 18-T载体.将鉴定出的阳性质粒和表达载体PET32a用BamH Ⅰ、HindⅢ双酶切回收后连接,获得阳性重组质粒PET32-VP3.用IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白VP3,并用SDS - PAGE进行检测,表达产物用镍亲和树脂进行纯化.结果证明口蹄疫病毒VP3蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表达产物得到了纯化,为实验室进一步研究提供了重要的材料.     

鹅细小病毒延边株VP3基因真核表达质粒构建

用碱裂解法对鹅细小病毒延边分离株进行GPV基因组DNA提取.根据已发表的鹅细小病毒VP3基因序列,设计1对含有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点的引物,以GPV基因组DNA为模板,应用PCR扩增出VP3基因片段,将VP3基因与克隆载体pMD 18-T连接,转化到感受态大肠杆菌BL21中进行克隆.用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切该片段并回收该片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pVAXI真核表达载体中,获得重组质粒pVAXI-VP3,经PCR鉴定,限制性内切酶双酶切分析和克隆片段序列测定比较,证实了重组质粒的正确性.     

基于番鸭细小病毒VP3蛋白的间接ELISA方法建立

本试验采用经原核表达并纯化的番鸭细小病毒VP3蛋白作为包被抗原，辛酸-硫酸铵沉淀法提取纯化制备的兔抗番鸭IgG酶标抗体作为二抗，经一系列试验，确定了间接ELISA检测番鸭细小病毒抗体的最佳抗原浓度为5 μg·mL^-1，血清的最佳稀释度为1∶100，血清样品稀释液为含10% FBS和10%脱脂奶粉的PBST，兔抗番鸭酶标抗体最适稀释度为1∶2 500。将建立的方法进行了特异性、敏感性、重复性与中和试验的符合性等试验。试验结果表明，阳性血清样品作1 600倍稀释还能检测到抗体；与其他常见鸭传染病的阳性血清无交叉反应；批内、批间重复性试验的变异系数小于8.7%；100份番鸭血清样品用ELISA方法与中和试验的总符合率达90%以上。说明本试验建立的检测方法敏感性高、特异性强、重复性与稳定性好，可用于番鸭细小病毒流行病学调查及鸭群免疫番鸭细小病毒疫苗后抗体监测。     

猪细小病毒自然弱毒N株VP2基因的克隆及原核表达

为了进一步研究猪细小病毒自然弱毒株(PPV-N株)的自然弱毒分子生物学机理,对PPV-N株VP2基因进行克隆、测序和原核表达研究.结果表明,成功构建PPV-N株VP2基因的克隆重组质粒pMD18-T-VP2及表达重组质粒pET32a-VP2,经SDSPAGE及Western blotting鉴定,PPV-N株VP2基因在BL21(DE3)plysS菌中成功进行融合表达,表达出约85.4 KDa的VP2融合蛋白,且表达的VP2融合蛋白能与PPV阳性血清发生特异性反应.PPV-N株VP2基因的成功克隆及原核表达为今后研究PPV-N株的自然弱毒的分子生物学机理和研制PPV诊断抗原奠定了基础.     

犬细小病毒VP_2基因原核表达载体的构建与分析

从犬细小病毒/犬瘟热进口二联苗中提取犬细小病毒基因组DNA,以此为模板进行PCR扩增,PCR产物经BamH I和XhoI双酶切后,克隆至pET22b(+)质粒的相应位点上,构建了原核表达载体pET22b/VP2.重组质粒经限制性内切酶酶切和核苷酸序列分析表明,VP2基因已正确克隆到pET22b(+)载体上,从而成功地构建了pET22b/VP2表达载体.     

抗番鸭细小病毒卵黄抗体的制备

[目的]有效预防和治疗番鸭细小病毒病。[方法]用番鸭细小病毒连续免疫产蛋母鸡3次,收集鸡蛋,并制备出高免卵黄抗体。通过琼脂扩散试验对制备的卵黄抗体进行效价测定,用雏番鸭进行中和与治疗试验。[结果]制备的卵黄抗体琼扩效价达到1∶32,能有效中和番鸭细小病毒对雏番鸭的致病性,对发病的雏番鸭有很好的治疗作用。[结论]该研究为番鸭细小病毒的预防和治疗提供了一种有效的生物制品。     

猪轮状病毒VP6基因的原核表达载体构建和表达

根据已报道的猪轮状病毒VP6基因序列设计了2对引物,利用pGEM-T-Easy-VP6重组质粒为模板,经PCR扩增获得了1 194 bp的产物。将扩增片段分别插入到pET5α和pGEX-4T-2构建表达载体,并分别在大肠杆菌BL21(DE3)Plyss和ER2566中表达。结果表明:成功构建了重组质粒,而且该片段在大肠杆菌中也成功表达,获得了大小为44 kD的蛋白。     

胰腺炎型鸭1型甲肝病毒结构蛋白VP1基因的克隆和表达

通过RT-PCR方法扩增出MPZJ1206株胰腺炎型鸭1型甲肝病毒结构蛋白VP1基因,将其与原核表达载体pGEX-6P-1连接获得重组表达质粒pGEX-VP1,进行条件优化诱导表达,将表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析。结果表明,分子量约为52 kDa的重组目的蛋白得到表达。该研究为开发胰腺炎型鸭1型甲肝病毒诊断方法和研究VP1蛋白功能奠定基础。     

新型番鸭细小病毒的发现及其感染的临床表现

2008年下半年以来,福建省、浙江省、安徽省及江苏省等地部分鸭场或养鸭户的雏半番鸭和台湾白鸭出现低病死率,约于40日龄起脚易断、上喙变短占近30%,至出栏时残次鸭达60%;免疫接种了雏番鸭细小病毒弱毒活疫苗的雏番鸭依然发生类雏番鸭"三周病",除出现死亡外,幸存鸭的番鸭翅脚易断、上喙变短,83%感染鸭成为僵鸭,对我国养鸭业造成了较大的直接经济损失。经病原学检测、病毒分离鉴定和实验室感染试验,发现其病原为与原经典的雏番鸭细小病毒(MDPV)在基因组上、感染宿主范围和致病性存在较大差异的番鸭细小病毒,鉴于此,将之暂定名为新型番鸭细小病毒(NMDPV)。     

基于PCR技术的番鸭细小病毒和沙门氏菌混合感染诊断

2010年9月贵州省某养鸭场送检病鸭5例,为确诊病因,同时为其及时防治提供科学依据,对病例进行了流行病学调查、实验室剖检病变观察、细菌学、PCR检测。结果表明:该病例为番鸭细小病毒和沙门氏菌混合感染,分离的沙门氏菌具有高致病性,仅对氧氟沙星敏感,对多种常用药物产生耐药。     

水貂阿留申病毒VP2基因主要抗原表位区的原核表达

根据GenBank中已发表的水貂阿留申病毒(ADV)VP2基因核苷酸序列分别设计合成两对引物,用PCR方法扩增ADV国内分离株VP2基因中主要抗原表位区的两个片段,分别将其克隆到原核表达载体pMAL-c2的多克隆位点中。经酶切、PCR扩增和测序分析证实其已正确插入到表达载体中,且阅读框是正确的,构建原核表达载体pMAL-VPa和pMAL-VPb。阳性重组质粒转化宿主菌TB1,用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE检测和免疫印迹分析。结果表明两段蛋白均获得了表达,表达产物的分子质量分别约为63、65kD,与理论推测的分子质量一致;并在终浓度为1mmol/L的IPTG诱导下,4h时其表达量达到高峰;Western blot分析表明表达蛋白能被兔抗MBP抗体所识别,具有一定的抗原性。     

鸭1型甲肝病毒亚型VP3基因的克隆与原核表达

参照鸭1型甲肝病毒亚型(DHAV-1a)的基因组序列设计了1对VP3基因特异性扩增引物,通过RT-PCR方法扩增获得了DHAV-1a结构蛋白VP3基因,将纯化的VP3基因与pEASYTM-Blunt Zero Cloning Vector连接,构建DHAV-1aVP3基因克隆重组质粒,然后将VP3基因片段插入pET-32a(+)表达载体,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞。以1.0mmol·L-1 IPTG于37℃诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot分析表明VP3基因于大肠杆菌中成功表达,其分子量为47kDa,且表达的VP3蛋白能够与Anti-His Mouse mAb发生特异性反应,具有良好的生物活性,为进一步研究DHAV-1aVP3蛋白功能和以VP3蛋白为抗原研制DHAV-1a诊断试剂盒奠定基础。