人参尖镰孢菌原生质体制备条件优化及绿色荧光蛋白转化

为人参根腐病菌的侵染及防治提供可视化的检测和分析手段,通过摸索分生孢子最适萌发时间、酶解液组成、酶解温度、摇床转数及渗透压稳定剂种类,研究人参根腐病菌-尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)原生质体制备技术.结果 表明:将人参尖镰孢菌野生型菌株0083分生孢子在YEPD培养基中培养11h,酶解温度37℃、摇床转数180 r/min,渗透压稳定剂为0.7 mol/L NaC1的条件下,酶解液(崩溃酶、溶菌酶、纤维素酶和蜗牛酶质量浓度分别为0.01,0.03,0.02,0.005 g/mL)酶解0.25 g菌丝时,收获的菌丝体最有利于原生质体的形成和释放,共获得2.8× 107/mL原生质体.用聚乙二醇PEG介导外源DNA随机插入的方法,成功获得具有绿色荧光信号和潮霉素B筛选标记的转化子,转化效率(以单位质量的DNA的转化子数计)为1400/mg.选取转化子FOG1菌株经过6代继代培养后,菌落形态、产孢量和绿色荧光蛋白的表达与菌株0083无明显差异.因此,利用聚乙二醇(PEG)为媒介的遗传转化体系是稳定高效的遗传转化体系.     

层出镰孢菌连续移植菌株生物学特性及遗传多样性研究

为了探寻连续移植对强致病力层出镰孢菌株遗传变异的影响,本试验利用生物学测定和ISSR分子标记对层出镰孢菌连续移植20次菌株的菌落形态、显微形态、致病性和遗传多样性等进行了研究。生物学测定结果表明:不同移植次数菌株在菌落形态和菌体形态上未表现出明显差异;但菌丝生长速率、产孢量和致病力随着移植次数增多而表现出下降趋势,并且菌株产生菌核的能力减弱。ISSR分子标记分析结果表明:层出镰孢菌连续移植菌株间基因组DNA在简单重复序列间区存在丰富的遗传多样性;虽然大多数移植次数相近的菌株间表现出较高的遗传相似性,但菌株间的遗传分化明显,而这种遗传分化与菌株间表现出的生物学特性无明显的相关性。综上所述,层出镰孢菌株经过连续移植后出现了显著的退化现象。     

球孢白僵菌原生质体制备和再生条件

球孢白僵菌[Beauveria bassiana(Balsamo)Vuillemin]经液体培养后,采用酶解方法制备其菌丝原生质体,并采取单因素实验对再生条件进行了研究。结果表明,经纤维素酶制备球孢白僵菌原生质体后,再生的最佳条件是:用L-broth培养基培养球孢白僵菌78h,KCl 0.8mol/L(再生用蔗糖0.6mol/L),柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液为缓冲系统,纤维素酶:蜗牛酶:溶菌酶=5:2.5:2.5(mg/mL),在32℃水浴中酶解3h(pH自然)。     

层出镰孢高效杀菌剂筛选及田间防效

玉米鞘腐病是玉米上的一种重要鞘部病害,其病原主要为层出镰孢。为筛选该病的有效防治药剂,本研究选取9种杀菌剂进行了室内毒力测定,并对效果较好的药剂进行了田间防治试验。结果表明:苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、苯甲·嘧菌酯、咪鲜胺、硅唑·咪鲜胺对层出镰孢均有一定的抑制效果,其中苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、咪鲜胺和硅唑·咪鲜胺对层出镰孢具有较好的防治效果,其EC50值分别为2.16,1.59,0.01,0.01mg/L;对孢子萌发的抑制率分别为6.57%,9.09%,59.09%,58.08%;田间防效分别达55.72%,62.54%,52.32%和45.51%,挽回玉米产量损失率分别为2.61%,0.39%,8.45%,10.15%。综合上述结果可知,上述4种杀菌剂对玉米鞘腐病防效显著,可作为防治该病的备选药剂。     

尖孢镰刀菌唐菖蒲专化型原生质体制备优化及再生性能

唐菖蒲(Gladiolus hybridus Hort)根腐病是由尖孢镰刀菌唐菖蒲专化型(Fusarium oxysporum f.sp.Gladioli)引起的真菌性病害。原生质体是研究尖孢镰刀菌唐菖蒲专化型与唐菖蒲之间的互作关系的重要工具,试验以尖孢镰刀菌唐菖蒲专化型为供试菌株,进行原生质体制备条件的优化与再生,明确培养基、菌龄、β-巯基乙醇预处理、酶选择以及酶解时间对原生质体产生的影响。试验结果表明:在PDB培养基中原生质体制备的最优条件为15μLβ-巯基乙醇预处理1 h,在5%崩溃酶溶液酶解3 h。在此条件下,12~14 h菌丝的原生质体产量可达到1.4×107个/m L,再生率为57.4%。     

小单孢菌40027菌株原生质体的形成和再生

通过酶解温度、酶解时间和再生培养基对小单孢菌40027菌株原生质体形成和再生的研究,确定小单孢菌40027菌株原生质体制备条件为37℃酶解60min;原生质体的再生培养基为R-1培养基。     

水稻纹枯病菌原生质体制备与再生条件的优化

为获得进行水稻纹枯病菌遗传转化所需的高质量原生质体,选用该病菌强致病力菌株GD-118,分别从酶种类、菌龄、酶解时间、酶解温度、酶液pH值和渗透压稳定剂及其浓度6个方面优化了原生质体的制备条件,从酶解时间和渗透压稳定剂及其浓度2个方面优化了原生质体的再生条件。结果表明:优化后的水稻纹枯病菌原生质体制备的最佳条件组合是"纤维素酶+溶菌酶+崩溃酶"组合酶、总酶终质量浓度10mg/mL、菌丝菌龄15h、酶解时间3h、酶解温度35℃、酶液pH5.6、以0.6mol/LMgSO4.7H2O为渗透压稳定剂,此最佳条件组合所制备的原生质体产率高达4.00×107/g;原生质体最佳的再生条件是酶解3h的原生质体在含1.0mol/L甘露醇的再生培养基上26℃时进行培养,在此条件下可获得最佳的再生效果,再生率为39%。     

烟管菌T1原生质体制备及菌丝再生条件优化

[目的]研究烟管菌T1(Bjerkandera adusta)原生质体制备及菌丝再生的最佳条件。[方法]研究菌龄、渗透压稳定剂种类和浓度、pH、酶浓度及酶解时间对原生质体得率的影响,并研究再生培养基种类对菌丝再生的影响。[结果]在PDA液体培养基中,以28℃摇床培养3 d的菌丝最适于该菌原生质体制备;用0.5 mol/L KCl配制的含有15 mg/m L的溶壁酶于30℃下酶解3 h,获得原产量最高,达1.18×10~6个/m L;RM1培养基再生率最高,达1.22%。[结论]该研究优化了原生质体制备及菌丝再生条件,为进一步研究烟管菌噬藻分子机制提供理论依据。     

红酵母原生质体制备和再生条件研究

［目的］初步探讨红酵母原生质体制备和再生的条件。［方法］以红酵母为试材,研究渗透压稳定剂pH值、酶浓度、酶解时间、预处理时间4个因素对红酵母原生质体制备率和再生率的影响。［结果］pH值在6.5～7.0,原生质体的制备率和再生率随着渗透压稳定剂pH值的升高而上升。当酶浓度从0.2%上升到1.0%时,原生质体制备率上升较快,而原生质体再生率下降较慢。随着酶解时间的增加,原生质体的制备率逐渐增加,而原生质体的再生率逐渐下降。在5～15 min,原生质体制备率和再生率均随着预处理的时间的增加而降低。［结论］当渗透压稳定剂pH值为7.0,蜗牛酶酶浓度为1.0%,酶解时间为60 min,预处理时间为5 min时,原生质体的制备率和再生率能分别达到较高的值。     

茶薪菇原生质体制备条件的分析

以茶薪菇为出发菌株,对其原生质体制备条件进行研究,具体分析了酶浓度、菌龄、渗透压稳定剂以及酶解时间和温度等因素对茶薪菇原生质体产出量的影响。结果表明:采用液体发酵培养第5 d的菌丝体,以0.4 mol/L KC l作渗透压稳定剂,加入0.20%混合酶(纤维素酶与蜗牛酶按1∶1混合)在25℃下酶解3 h,制备原生质体效果最佳,原生质体产出量可达2.5×107个/mL。     

层出镰刀菌T-DNA插入突变体库的构建与分析

苹果再植病害(Apple replant disease,ARD)是世界苹果主产区广泛发生的病害。前期研究表明,层出镰刀菌是造成苹果再植病害的重要致病菌之一,但其分子致病机制尚缺乏研究报道。本研究的目的是建立农杆菌介导的层出镰刀菌的遗传转化体系,并获得大规模的遗传稳定的层出镰刀菌ATMT突变体库,为研究该菌的分子致病机理奠定基础。对影响农杆菌介导转化效率的主要因子进行单因子条件测验,得到其最优转化体系为:抑制H10菌丝和孢子生长的潮霉素的浓度为100μg/mL,层出镰刀菌的分生孢子浓度为107个/mL,农杆菌OD600值为0.3,AS浓度为200μg/mL,共培养时间为48h,共培养温度为26℃。利用这一体系构建了3000个转化子的突变体库,并对随机选择的200个突变体进行潮霉素抗性基因的PCR检测,并经过在PDA培养基上5代培养,验证了T-DNA插入片段的稳定性。     

高大环柄菇原生质体制备的研究

以高大环柄菇为出发菌株,对其原生质体制备条件进行研究,具体分析了酶浓度、菌龄、渗透压稳定剂以及酶解时间和温度等因素对高大环柄菇原生质体产出量的影响。结果表明:采用液体发酵培养第5 d的菌丝体,以0.5 mol/L NaC l作渗透压稳定剂,加入1.5 g/L混合酶(即纤维素酶与蜗牛酶按1∶1混合)在30℃下酶解3.5 h,制备原生质体效果最佳,原生质体产出量可达6.1×107个/mL。     

平菇原生质体制备条件的研究

从综合酶种类、酶浓度、菌龄、酶解温度、酶解时间及稳渗剂等方面,探讨平菇原生质体制备的条件。     

龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)原生质体制备与再生条件研究

报道了龟裂链霉菌（ Ｓｔｒｅｐｔｏｍ ｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ） 原生质体制备与再生最佳条件和该原生质体对抗生素的抗性结果。在 Ｓ生长培养基中加入φ＝ １ ％ 甘氨酸进行菌丝体培养２４ ｈ ,原生质体制备最佳条件为：溶菌酶浓度φ＝ ３ ％ 、酶解温度２８ ℃、酶解时间９０ ｍｉｎ ,其制备的原生质体数达到６ ．０ 亿个／ ｍ Ｌ 以上;原生质体最佳再生培养基为 Ｒ５ 再生培养,其再生率达到４６ ％ 。     

泰妙菌素生产菌种原生质体制备条件优化

[目的]探讨泰妙菌素生产菌种原生质体的最优制备方法。[方法]通过对原生质体制备条件进行优化,建立泰妙生产菌种原生质体制备体系。[结果]优化后制备条件:以培养3 d的菌丝体为材料,将其置于含质量浓度0.10%溶壁酶、0.60 mol/L MgSO_4的酶液中,25℃酶解3.0~3.5 h,将酶解液用G2砂芯漏斗过滤,滤液即为原生质体悬液。采用该方法,泰妙生产菌种原生质体制备率达1.5×10~6个/m L。[结论]试验结果为提高泰妙菌素生产菌种的产量提供了理论依据。