Plk1在猪胎儿成纤维细胞有丝分裂进程中的亚细胞定位和功能研究

本研究旨在探究Plk1在猪胎儿成纤维细胞中的亚细胞定位及其作用。通过间接免疫荧光技术检测了Plk1在猪胎儿成纤维细胞有丝分裂进程中的亚细胞定位,并通过Plk1特异性抑制剂GSK461364处理进一步分析Plk1在细胞有丝分裂进程中的潜在作用。结果显示:Plk1在猪胎儿成纤维细胞有丝分裂各个时期都有分布,且在细胞核周围有相对较高水平的Plk1表达;经GSK461364处理后,细胞活力显著降低,细胞周期进程阻滞在G2/M期,出现细胞核碎裂,并伴随着α-微管蛋白结构紊乱。研究表明:Plk1参与了调控猪胎儿成纤维细胞有丝分裂的进程,并与G2/M期的细胞核分裂和微管组装密切相关。     

细胞周期检查点激酶1的表达对猪卵母细胞体外成熟的影响

细胞周期检查点激酶1(Chk1)作为DNA复制检查点和DNA损伤反应的重要成员,在有丝分裂和减数分裂中都具有重要作用。为探究Chk1对猪卵母细胞减数分裂的影响,本研究首先采用免疫荧光染色和实时荧光定量PCR技术检测了Chk1在猪卵母细胞不同时期的表达和定位,随后利用chir-124抑制Chk1的表达,研究其对猪卵母细胞减数分裂的影响,以及相关基因的表达和纺锤体的变化。结果表明,Chk1在4个时期(GV、GVBD、MI、MII)均有表达,GV期主要定位在生发泡内,GVBD期主要定位在核周围,MI期和MII期主要定位在纺锤体上;用不同浓度的chir-124处理卵母细胞来抑制Chk1,发现0.5μmol/L的chir-124对卵母细胞生发泡破裂(GVBD)的影响最大,可显著提高猪卵母细胞处于GV-IV期的比例(P0.05),并且可显著提高卵母细胞达到GVBD期的比率(P0.05),但对后续的成熟没有显著影响;随后对MII期卵母细胞的基因表达进行检测发现,Chk1的抑制可调节cdk1、cdc25C、cyclin b1基因的表达,并使gwl基因的表达显著下降(P0.05),从而调节卵母细胞恢复减数分裂的进程;Chk1的表达会激活纺锤体组装检查点(SAC),阻止同源染色体分离,将猪卵母细胞定位在MI期,而减少Chk1的表达后,猪卵母细胞可渡过MI期,进入MII期。综上,在GV期使用chir-124抑制Chk1的表达可促进猪卵母细胞恢复减数分裂,并促进后续的成熟。     

哺乳动物卵母细胞纺锤体的形成及纺锤体检验点的作用机制

染色体精确分离是在纺锤体的正确组装和纺锤体检查点(spindle assembly checkpoint,SAC)的监控下完成的,对于哺乳动物卵母细胞来说,纺锤体的形成和SAC都是保证染色体精确分离的重要因素,如果染色体分离错误将直接导致自发性流产或其他出生缺陷。卵母细胞中心体缺失后,细胞依然能够依靠独立于中心体而围绕染色体成核的微管反向平行排列能形成双极纺锤体,即自我组装纺锤体。由微观组织中心(microtubue organizing center,MTOC)召集微管聚集,成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)维持两次减数分裂过程中纺锤体的形成过程,细胞静止因子(cytostatic factor,CSF)维持分裂中期结构,使纺锤体在染色体没有全部集合到赤道板时保持稳定。大体积的卵母细胞容易产生非整倍体,且卵母细胞中不含有中心体这一特殊性导致卵母细胞中是否存在SAC在很长一段时间内存在争议,但现在SAC是确保卵母细胞染色体精确分离的机制之一已被初步证明。在减数分裂中期染色体之间存在一种黏连,细胞会产生"等待-后期"信号抑制SAC活性,从而保持这种黏连稳定,直至所有染色体完成与纺锤体的连接,"等待-后期"信号失活,SAC启动,使染色体间的黏连失活,进而在纺锤体的作用下染色体分离。作者综述了减数分裂过程中纺锤体的特异性组装过程和纺锤体检查点的组成及作用机制,丰富了减数分裂的相关知识,并为减数分裂过程中非整倍体的形成机制提供依据。     

哺乳动物卵母细胞纺锤体的形成及纺锤体检验点的作用机制

染色体精确分离是在纺锤体的正确组装和纺锤体检查点(spindle assembly checkpoint,SAC)的监控下完成的,对于哺乳动物卵母细胞来说,纺锤体的形成和SAC都是保证染色体精确分离的重要因素,如果染色体分离错误将直接导致自发性流产或其他出生缺陷。卵母细胞中心体缺失后,细胞依然能够依靠独立于中心体而围绕染色体成核的微管反向平行排列能形成双极纺锤体,即自我组装纺锤体。由微观组织中心(microtubue organizing center,MTOC)召集微管聚集,成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)维持两次减数分裂过程中纺锤体的形成过程,细胞静止因子(cytostatic factor,CSF)维持分裂中期结构,使纺锤体在染色体没有全部集合到赤道板时保持稳定。大体积的卵母细胞容易产生非整倍体,且卵母细胞中不含有中心体这一特殊性导致卵母细胞中是否存在SAC在很长一段时间内存在争议,但现在SAC是确保卵母细胞染色体精确分离的机制之一已被初步证明。在减数分裂中期染色体之间存在一种黏连,细胞会产生"等待-后期"信号抑制SAC活性,从而保持这种黏连稳定,直至所有染色体完成与纺锤体的连接,"等待-后期"信号失活,SAC启动,使染色体间的黏连失活,进而在纺锤体的作用下染色体分离。作者综述了减数分裂过程中纺锤体的特异性组装过程和纺锤体检查点的组成及作用机制,丰富了减数分裂的相关知识,并为减数分裂过程中非整倍体的形成机制提供依据。     

HDAC1和HDAC2对小鼠卵母细胞组蛋白去乙酰化的作用

旨在探索组蛋白去乙酰化酶1 (histone deacetylase 1,HDAC1)和组蛋白去乙酰化酶2 (histone deacetylase 2,HDAC2)在卵母细胞减数分裂期组蛋白去乙酰化过程中的作用。首先利用免疫荧光技术,检测HDAC1与HDAC2在体细胞及卵母细胞不同时期的表达分布,然后分别利用抑制剂抑制HDAC1和HDAC2的活性,观察其对卵母细胞组蛋白去乙酰化的作用。结果:HDAC1与HDAC2分布在间期的体细胞和卵母细胞的细胞核中,但分裂期细胞中只有卵母细胞染色体上存在HDAC1的表达,抑制酶活性后该HDAC1的表达也消失;在小鼠卵母细胞第一次减数分裂双线期(germinal vesicle stage,GV期)卵母细胞体外成熟液中添加TSA (trichostatin A,HDACs广谱抑制剂)、Pyroxamide (HDAC1特异性抑制剂)、Santacruzamate A (HDAC2特异性抑制剂),发现Pyroxamide和Santacruzamate A均能显著抑制卵母细胞减数分裂过程中组蛋白乙酰化修饰的去除,但未能达到广谱抑制剂的抑制效果。研究表明,小鼠卵母细胞在减数分裂组蛋白去乙酰化过程中,HDAC1和HDAC2均具有组蛋白去乙酰化的作用,且与HDAC2相比,HDAC1发挥着主要的去乙酰化作用,这为组蛋白去乙酰化作用机理提供理论参考。     

猪卵母细胞在冷应激条件下的体外发育与CIRP基因表达

本试验旨在研究冷应激对猪卵母细胞发育能力及冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)基因表达的影响。常规体外成熟猪GV期卵母细胞,置于室温(25℃)下冷应激处理0.5、1、2、6、12和24 h,观察冷应激处理对其后卵母细胞成熟率和体外受精胚胎发育率的影响和微丝、微管等亚细胞结构的变化,Real-time PCR检测猪卵母细胞CIRP mRNA的表达。结果表明:短时间(2 h)冷应激处理后各组成熟率和体外受精卵裂率均与对照组无异(P0.05);微丝、微管及染色体等亚细胞结构均无明显改变(P0.05),但2 h组的囊胚发育率较对照组有明显下降(9.7%对12.3%,P0.05)。冷应激处理超过2 h后,各组成熟率和囊胚发育率与对照组相比均显著降低(P0.05),微丝、微管正常率均较对照组显著下降(分别为76.8%和53.6%对90.2%和77.2%;P0.05)。在冷应激条件下,猪卵母细胞CIRP mRNA表达水平升高,并在一定范围内随冷应激处理时间的延长而增加,至冷应激处理4 h时达最高。猪卵母细胞在短时间冷应激条件下,其发育能力和亚细胞结构并未受到显著影响;适当的冷应激条件可有效激发猪卵母细胞CIRP mRNA的表达。     

G蛋白偶联受体50在牦牛卵母细胞体外成熟过程中的表达与亚细胞定位研究

试验旨在研究G蛋白偶联受体50（G protein-coupled receptor 50,GPR50）在牦牛卵母细胞体外成熟过程中的表达与定位规律,为进一步解析卵母细胞成熟的分子机制及理解牦牛繁殖的特异性提供依据。通过牦牛卵母细胞体外成熟培养,利用免疫荧光染色监测不同时间点（0~24 h）纺锤丝形态和核相的变化,确定牦牛卵母细胞减数分裂4个时期,包括生发泡期（germinal vesicle,GV）、生发泡破裂期（germinal vesicle break down,GVBD）、第一次减数分裂中期（metaphase Ⅰ,MⅠ）与第二次减数分裂中期（metaphase Ⅱ,MⅡ）的时间点。在此基础上,通过实时荧光定量PCR检测GPR50基因在牦牛卵母细胞成熟过程中的动态表达量,免疫荧光染色检测GPR50蛋白在卵母细胞成熟过程中的的亚细胞动态定位情况。结果表明,牦牛卵母细胞体外成熟0 h时90%处于GV期,6 h时94%处于GVBD期,16 h时92%细胞处于MⅠ期,24 h时94%处于MⅡ期。实时荧光定量PCR结果表明,GPR50基因在牦牛卵母细胞GV期即有表达,并在GVBD、MⅠ、MⅡ期成熟过程中逐渐升高,在MⅡ期达到顶峰,且极显著高于GV与GVBD期（P<0.01）。GPR50蛋白在牦牛卵母细胞GV期时集中在膜上表达,并随着成熟进程的发展在细胞质和细胞膜均大量表达,在MⅡ期高亮度弥散表达。以上结果表明,GPR50基因参与牦牛卵母细胞减数分裂过程并发挥重要作用,为研究GPR50在牦牛卵母细胞成熟过程中的作用及机制提供了依据。     

细胞骨架抑制剂、电激活液对兔卵孤雌激活和发育的影响

应用细胞骨架抑制剂细胞松弛素B和秋水仙素处理兔成熟卵母细胞，然后采用电激活的方法激活兔卵母细胞，观察细胞骨架抑制剂对兔卵母细胞孤雌激活和孤雌发育的影响，结果表明：应用不同的电激活液，即甘露醇、Zimmerman氏和山梨醇对兔卵母细胞的孤雌激活效果无显著性差异（P〉0．05）；用7．5μg&#183;mL^-1细胞松弛素B处理卵母细胞后孤雌激活，其2-细胞胚率（82．2％）和囊胚发育率（43．4％）与对照组（76．4％和51．5％）相比无显著性差异（P〉0．05）；用1μg&#183;mL^-1秋水仙素处理兔卵母细胞，兔卵母细胞孤雌激活后的2-细胞胚率（64．9％）和囊胚发育率（23．8％）明显下降，与对照组相比存在显著性差异（P〈0．05）；用细胞松弛素B和秋水仙素共同处理的2-细胞胚率（62．5％）和囊胚发育率（30．9％）与秋水仙素单独处理的结果无显著性差异（P〉0．05）。因此，秋水仙素对兔卵母细胞的孤雌激活影响比CB更大。通过免疫荧光和激光扫描共聚焦显微镜观察发现，细胞骨架抑制剂处理后，经孤雌激活获得的囊胚中，微丝和微管结构未见异常。     

蛋白激酶C在哺乳动物卵母细胞第1次减数分裂成熟过程中的调节作用

蛋白激酶C（PKC）是一个广泛分布在真核细胞中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族。它在卵母细胞的生发泡破裂（GVBD）、染色体凝集、MⅠ期纺锤体组装和第一极体排放等过程中起着重要的调节作用。PKC的活性变化调节着GVBD的发生，GVBD标志着第1次减数分裂的启动。PKC活性在卵母细胞成熟过程中逐渐升高，在第1次减数分裂中/后期转变时活性下降，使卵母细胞得以释放出第一极体，至此卵母细胞完成第1次减数分裂进入第2次减数分裂。作者就PKC在卵母细胞第1次减数分裂成熟过程中的作用综述如下。     

秋水仙素条件优化及其对牛卵细胞c-mos基因表达水平的影响

为探讨秋水仙素对牛卵母细胞产生细胞膜突起的最适条件与对减数分裂纺锤体组装起重要调控作用的母源基因c mos表达量的影响,设计如下试验:比较试验组(Deme+ sucrose处理)与对照组1(Deme单独处理)和对照组2(sucrose单独处理)的卵母细胞细胞膜突起率变化.用荧光定量检测最适合秋水仙素浓度处理的卵母细胞与空白组和对照组母源基因c-mos基因表达量的差异.结果表明,用0.6 mg/L秋水仙素+0.05 mol/L蔗糖处理牛卵母细胞1h细胞膜突起率达72.0％,要显著高于对照组1(13.0％)和对照组2(P＜0.05);0.6 mg/L秋水仙素浓度优于其他质量浓度(P＜0.05).秋水仙素加蔗糖处理的卵母细胞的母源基因c-mos表达高于蔗糖处理组和空白组c-mos基因的表达(P＜0.05).     

微管的相关研究

微管(microtubule,MT)是由微管蛋白组装成长管状细胞器结构,存在于所有的真核细胞中,微管外径的平均值为24 nm,对较高的压力、较低的温度和秋水仙素很敏感。微管在细胞内呈网状和束状分布,并连同其它蛋白质组装成神经管、轴突、纤毛、鞭毛、中心粒、基粒、纺锤体等结构,参与维持细胞形态、细胞运动和细胞分裂。微管由两种类型的微管蛋白亚基组成,即α-微     

微囊藻毒素-LR对猪体外成熟卵母细胞氧化损伤与凋亡的影响

旨在探讨微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)对体外成熟猪卵母细胞的毒性损伤及其潜在损伤机制。本研究从屠宰场所获得的猪卵巢中收集GV期卵母细胞,将其随机分为4组,在卵母细胞体外成熟培养液中分别添加0、20、40和60μg·mL~(-1) MC-LR,研究MC-LR对卵母细胞第一极体(PbI)排出、纺锤体结构以及细胞内活性氧(ROS)、早期凋亡蛋白(Annexin V)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力的影响,并采用RT-qPCR分析氧化应激和凋亡相关基因SOD1、SOD2、CAT、GSH-Px、Bax和Bcl2 mRNA的表达变化情况,试验重复3次。结果发现,MC-LR处理导致猪卵母细胞PbI排出率呈浓度依赖性下降,当MC-LR添加浓度达40μg·mL~(-1)以上时,卵母细胞成熟率极显著下降(P0.01),且纺锤体结构异常率极显著升高(P0.001);进一步研究发现,MC-LR处理后卵母细胞ROS水平极显著升高(P0.01),而GSH-Px活性极显著降低(P0.01),并伴随着抗氧化相关基因SOD1、CAT及GSH-Px mRNA表达极显著下调(P0.01);细胞凋亡检测表明,MC-LR处理可导致卵母细胞早期凋亡率极显著增加(P0.01),凋亡相关基因Bax/Bcl2比值极显著升高(P0.001)。研究结果表明,MC-LR可诱导猪卵母细胞纺锤体结构异常,并引发氧化损伤与细胞凋亡,最终导致卵母细胞成熟能力下降。     

微管的相关研究

微管（microtubule，MT）是由微管蛋白组装成长管状细胞器结构，存在于所有的真核细胞中，微管外径的平均值为24nm，对较高的压力、较低的温度和秋水仙素很敏感。微管在细胞内呈网状和束状分布，并连同其它蛋白质组装成神经管、轴突、纤毛、鞭毛、中心粒、基粒、纺锤体等结构，参与维持细胞形态、细胞运动和细胞分裂。     

KDM1A对牦牛卵母细胞减数分裂成熟及其发育潜能的影响

旨在探讨KDM1A对牦牛卵母细胞减数分裂成熟及其发育潜能的影响。本研究在体外成熟液中添加不同浓度的KDM1A特异性抑制剂GSK-KDM1A,牦牛卵丘-卵母细胞复合体（COCs）体外培养24 h后,观察卵丘细胞的扩展和第一极体的排出情况;利用免疫荧光检测体外培养过程中卵母细胞内KDM1A的表达模式;采用实时荧光定量PCR检测体外培养卵母细胞内Kdm1a、Oct-4、Sox-2以及Nanog的表达水平;体外培养成熟后的牦牛卵母细胞进行体外受精,观察其卵裂率与囊胚形成率。结果显示,体外培养24 h后,GSK-KDM1A组的卵丘细胞扩展程度显著低于对照组（P<0.05）,而320 nmol·L^-1组的卵丘细胞扩展程度和第一极体排出率均显著低于160 nmol·L^-1组（P<0.05）。在卵母细胞体外成熟过程中,Kdm1a呈现动态表达模式,MⅠ期的表达水平显著低于GV和MⅡ期（P<0.05）;添加GSK-KDM1A能显著抑制卵母细胞中KDM1A蛋白的表达（P<0.05）,320 nmol·L^-1组各时间点KDM1A的表达量均显著低于160 nmol·L^-1组（P<0.05）。GSK-KDM1A组卵母细胞内Oct-4与Sox-2的表达水平显著高于对照组（P<0.05）,但Nanog的表达水平无显著差异（P>0.05）。牦牛卵母细胞体外成熟后,GSK-KDM1A组的卵裂率显著低于对照组（P<0.05）,但囊胚形成率无显著变化（P>0.05）。综上表明,KDM1A参与调控牦牛卵母细胞减数分裂成熟过程,GSK-KDM1A能有效抑制KDM1A的表达,影响卵母细胞减数分裂成熟及其发育潜能,揭示KDM1A在此过程中扮演重要角色。     

牛卵母细胞减数分裂期组蛋白H4K12乙酰化的变化

试验以牛卵母细胞作为材料,以曲古抑菌素A作为去乙酰化酶(HDAC)抑制剂。应用激光共聚焦显微镜技术,通过检测卵母细胞组蛋白H4K12乙酰强度,探讨乙酰基转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰基酶(HDAC)在减数分裂Ⅰ、Ⅱ期的活性。TSA的处理浓度为80μmol/L。结果显示,组蛋白H4K12乙酰荧光强度在卵母细胞减数分裂期完全消失;在TSA存在下培养成熟的卵母细胞,在减数分裂期检测到强的组蛋白H4K12乙酰化荧光强度;然后卵母细胞移入不含TSA的培养液中,3h后组蛋白H4K12乙酰荧光强度再次完全消失。结论:HAT在减数分裂Ⅰ、Ⅱ期无活性,HDAC在减数分裂Ⅰ、Ⅱ期有活性。     

XRCC1在卵子和早期胚胎中的定位与功能的初步分析

X射线修复交叉互补蛋白1(XRCC1)是一种支架蛋白，其在碱基切除修复中发挥重要作用。本文检测了XRCC1在卵母细胞和胚胎中的亚细胞定位，并研究了其对小鼠卵母细胞减数分裂成熟的影响，以及对随后的胚胎发育和基因组DNA甲基化的影响。结果显示，在卵母细胞成熟和受精后胚胎发育过程中，XRCC1主要定位在细胞核中。通过显微注射特异性抗体来阻断XRCC1后，卵母细胞生发泡破裂率和胚胎卵裂率出现显著性下降，同时2细胞胚胎中基因组DNA去甲基化水平异常。这说明XRCC1主要定位于细胞周期间期的细胞核，功能正常的XRCC1有助于减数分裂中小鼠卵母细胞质量的维持和早期胚胎的正常发育。     

Ste20-like kinase在细胞分裂过程中的作用研究进展

Ste20-like kinase（SLK）是近年来发现的一种蛋白激酶,是微管相关蛋白,在细胞分裂过程中参与许多生物活动。SLK在成熟细胞系中广泛的表达,并且在多种肿瘤细胞内表达异常,因此引起了广泛关注。最新证据显示,在有丝分裂过程中,SLK特异性地分布在纺锤体上并与纺锤体微管的稳定性相关。目前关于SLK的研究报道不多,本文对SLK的结构和表达以及在细胞分裂过程中有关于细胞迁移、调亡等方面进行了综述。     

TACE激酶在猪排卵过程中的作用机制

促黄体激素(LH)诱导猪卵泡排卵过程包括卵泡壁的破裂、颗粒细胞黄体化、卵丘细胞扩展和卵母细胞减数分裂成熟。LH受体主要在排卵前卵泡的颗粒细胞中表达,排卵刺激后表达水平明显降低。颗粒细胞和卵丘细胞表达的EGF样因子可以激活EGFR-MAPK3/1在这2种细胞中的通路。EGF样因子是由信号序列、跨膜区域和EGF区域组成,并且由特异性酶刺激释放EGF区域与EGFR互作诱导排卵过程。TACE/ADAM17是一种EGF样因子的蛋白水解酶,在FSH/LH刺激的颗粒细胞和卵丘细胞中表达并激活EGFR-MAPK3/1通路。应用特异性抑制剂或siRNA抑制技术而降低TACE/ADAM17的表达活性,则会抑制颗粒细胞黄体化、卵丘细胞扩展以及卵母细胞的成熟过程。因此,TACE/ADAM17是诱导猪排卵过程的主效基因。     

绵羊卵母细胞体外成熟过程中的线粒体分布变化

为了检测绵羊卵母细体外成熟前后的线粒体分布变化,将成熟过程不同阶段的卵母细胞用活体细胞线粒体跟踪试剂盒(GENMED kit)对线粒体进行染色,之后用碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)对细胞核进行染色,最后用激光共聚焦显微镜观察线粒体分布情况以及相应的细胞核所处的发育时期.结果:生发泡期(Germinal Vesicle,GV)的卵母细胞线粒体呈周边分布;生发泡破裂期(Germinal Vesicle Breakdown,GVBD)、第一次减数分裂中期(Metaphase Ⅰ,MⅠ中期)的卵母细胞呈半周边分布;第一次减数分裂末期(M Ⅰ Anaphase,MⅠ后期)的卵母细胞线粒体基本呈均匀分布,但是线粒体簇较小,着色较浅;第二次减数分裂中期(Metaphase Ⅱ,MⅡ期)的卵母细胞线粒体呈均匀分布,而且细胞质中央的线粒体簇变大,着色变深.结论:线粒体分布随着绵羊卵母细胞体外成熟阶段的进展,由细胞周边向均匀、由疏松向致密呈波动变化,这种变化有可能作为一种判定绵羊卵母细胞胞质成熟的有效参考指标.     

白藜芦醇对猪卵母细胞体外老化的抑制作用

旨在研究白藜芦醇(RES)对猪卵母细胞体外老化的影响及机制。添加不同浓度RES(0、1、2、4μmol/L),体外培养猪卵母细胞44 h后,通过卵丘扩散和第一极体排出率筛选出最佳有效浓度为2μmol/L。卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes, COCs)成熟培养44 h作为对照组,连续培养68 h作为体外老化组,置于含2μmol/L白藜芦醇成熟培养液中培养68 h,为白藜芦醇处理组。激光扫描共焦显微镜检测染色体和纺锤体,Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax表达水平。结果表明:RES处理组和对照组的猪卵母细胞染色体与纺锤体异常率均较老化组显著降低(P<0.01)。用2μmol/L RES处理后,猪卵母细胞Caspase-3和Bax蛋白表达量均有下降,显著低于老化组(P<0.001);Bcl-2蛋白表达量有所升高,但差异不显著。试验表明,RES可明显抑制猪卵母细胞的老化,这一作用可能主要通过抑制线粒体凋亡途径来实现的。