母牛卵泡期和黄体期子宫颈6种β-防御素的变化

为了解母牛生殖道β-防御素的表达及与发情周期的关系,实验采用荧光定量PCR检测卵泡期和黄体期母牛子宫颈6种β-防御素的变化。实验发现,在子宫颈中卵泡期和黄体期BNBD-4、BNBD-5的表达量无差异(P0.05),而卵泡期TAP、LAP1、BNBD-1、BNBD-10的表达量高于黄体期(P0.05)。母牛子宫颈中6种β-防御素均有表达,其中TAP、LAP1、BNBD-1、BNBD-10的表达量呈周期变化,可能与发情周期中子宫颈口开张程度有关。     

蒙古绵羊雌性生殖道β-防御素(sBD-1)的序列分析及组织表达

从蒙古绵羊输卵管、子宫、子宫颈、阴道组织中提取总RNA,根据GenBank中羊的β-防御素的cDNA序列设计合成引物,通过RT-PCR进行cDNA扩增,获得了301bp的片段。将该片段克隆于pMD-18T载体后进行序列分析,确认该PCR产物为β-防御素。通过相同的RT-PCR反应体系和条件后,对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,以β-actin为参照,根据PCR产物的亮度推断不同组织中β-防御素的表达量。结果,蒙古绵羊雌性生殖道上皮各组织均有β-防御素表达,说明β-防御素在蒙古绵羊雌性生殖道的先天免疫中起重要作用。β-防御素的表达量在雌性生殖道各组织内不同,提示雌性生殖道各组织的防御功能强度不同。     

雌性骆驼生殖组织β-防御素-1基因的克隆及其组织表达量的检测

从雌性骆驼输卵管、子宫、子宫颈、阴道组织中提取总RNA，根据已发表的骆驼β-防御素-1基因的cDNA序列设计合成引物，采用RT—PCR扩增出了骆驼β-防御素-1基因；将扩增产物克隆于pBlueselect T载体后进行了序列分析。以伊肌动蛋白（pactin）基因作为内参，对扩增的β-防御素-1基因进行琼脂糖凝胶电泳后，应用凝胶成像分析系统，推断出了不同组织中β-防御素-1基因的表达量。结果，从雌性骆驼生殖各组织上皮均获得了203bp的β-防御素-1基因的扩增片段，且β-防御素-1基因在雌性骆驼生殖道各组织内的表达量不同。结果表明，β-防御素-1在雌性骆驼生殖组织的先天免疫中起重要作用。     

子宫内膜炎奶牛子宫组织β-防御素及相关因子的表达

为了探讨奶牛子宫内膜组织中β-防御素、TNF-α和TLR4mRNA表达与炎症发生的关系。取奶牛子宫内膜组织,根据病理切片结果分成子宫内膜炎组和对照组,用RT-PCR分别测定各组的β-防御素、TNF-α和TLR4的mRNA。结果发现,子宫内膜炎组的LAP、BNBD5的mRNA表达极显著高于对照组(P<0.01),BNBD4的mRNA表达显著高于对照组(P<0.05),奶牛子宫内膜组织不表达TAP;且子宫内膜炎组的TNF-α和TLR4的mRNA表达显著高于对照组(P<0.05)。结果表明,奶牛子宫内膜炎的发生与β-防御素、TNF-α和TLR4都具有密切相关性,其中LAP、BNBD4和BNBD5这3种β-防御素参与奶牛子宫内膜炎的发生;TNF-α和TLR4可以作为炎症发生的信号分子。     

维生素D3对丝毛乌骨鸡组织中β-防御素基因的表达调控

本试验旨在研究不同水平维生素D3对丝毛乌骨鸡组织中β-防御素(AVBDs)基因表达的调控.采用实时荧光定量PCR方法检测饲喂不同水平(800、1 600、3 200和6 400 IU/kg)维生素D3对丝毛乌骨鸡胸腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和法氏囊中3个β-防御素(AVBD-1、AVBD-5和GAL-1)基因表达水平的影响.结果表明:3个β-防御素基因在6个组织中均有表达,其中乌骨鸡AVBD-1和GAL-1基因的最高表达水平都在采食了3 200 IU/kg维生素D3时的空肠;AVBD-5基因的最高表达水平在采食了1 600 IU/kg维生素D3时的十二指肠;在依次采食维生素D3800、1 600、3 200和6 400 IU/kg的乌骨鸡组织中,3个β-防御素基因都存在先升后降的表达趋势.结果表明,β-防御素基因在同一组织的表达水平与维生素D3饲喂水平存在剂量关系,适宜的维生素D3饲喂水平能上调这3个β-防御素基因在乌骨鸡组织中的表达量.     

荷斯坦牛中性粒细胞β-防御素基因克隆及其原核表达质粒的构建

根据已发表的牛β-防御素基因序列设计引物,从具有临床乳腺炎症状的荷斯坦奶牛血液中性粒细胞中提取RNA,克隆牛β-防御素基因并插入到原核表达载体pQE-30中,构建了原核表达质粒pQE-30/β-defesion。测序结果表明,克隆的目的基因长189bp,编码1个氨基酸,与已报道的牛β-防御素氨基酸序列同源性达95.6%。本研究为牛乳腺防御素的表达及功能、活性的研究奠定了一定的基础。     

鸡beta-defensin基因片段的序列鉴定及分析

防御素是一种富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽,是先天免疫的重要分子。鸡体内所含的防御素一共有13种,全部属于β防御素。本实验利用RT-PCR技术扩增出来航鸡的骨髓、肝脏、肾脏中所含防御素片段,并进行测序比对,同时对鸡β防御素的蛋白质分子结构、组织分布、表达调控及其生物学功能进行了介绍。     

牛中性粒细胞β防御素5重组蛋白联合利福平体内抗牛结核分支杆菌作用

探索牛中性粒细胞β防御素5重组蛋白联合利福平在体内抗牛分支杆菌的作用,为开发新型抗结核药物提供试验依据。将40只Balb/c小鼠随机分为4组,即空白对照组、感染模型组、利福平单独用药组、利福平与牛中性粒细胞β防御素5(牛β防御素5)联合用药组,每组10只,除正常对照组小鼠,其余小鼠鼻腔滴入牛分支杆菌,200CFU/只,4周后每天皮下注射利福平,连续2周,联合用药组同时皮下注射牛β防御素5,隔2d给药1次,连续2周,1周后采血用于检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-10浓度,取肺脏、脾脏用于观察组织基本病理变化和菌落计数。结果显示,与感染模型组相比,利福平组血清中TNF-α(P0.01)和IL-1β(P0.05)浓度显著降低,肺脏和脾脏中的载菌量明显减少,肺组织病理变化显著减轻;与利福平组相比,利福平与牛β防御素5组血清中IL-10浓度显著升高(P0.01),肺脏(P0.05)和脾脏(P0.05)中的载菌量明显减少,肺组织病理变化明显减轻。牛中性粒细胞β防御素5可协助利福平发挥更强的抗牛分支杆菌活性。     

荷斯坦奶牛乳腺β-防御素的差异表达

本研究为证明荷斯坦奶牛乳腺β-防御素的表达,扩增出6种β-防御素序列进行氨基酸分析,结果发现,扩增的6个保守的半胱氨酸,其核酸序列与NCBI数据库序列进行BLAST比对,结果LAP、BNBD4同源性100%,BNBD5为99.6%,EBD为99.5%, BNBD7、TAP为98.5%;实时荧光定量PCR检测6种防御素的mRNA水平的表达,它们之间的表达量都有显著性差异(BNBD4与BNBD5除外),其中LAP表达量最多,BNBD7,EBD,BNBD5,BNBD4次之,TAP的表达量最低。     

牛β-防御素BNBD5基因在毕赤酵母中的表达

本研究在本实验室成功构建的奶牛乳房炎抗性相关cDNA文库的基础上,旨在通过对牛β-防御素基因的分析,进一步揭示乳房炎抗性的分子机理.以牛β-防御素BNBD5基因作为乳房炎抗性的候选基因,通过克隆该基因的编码区,成功构建了毕赤酵母表达载体pPICZαA/BNBD5,并采用毕赤酵母表达系统表达了BNBD5蛋白.该结果为今后BNBD5抗体的制备奠定了基础.     

驯鹿β-防御素-1(reBD-1)基因在组织中表达的原位杂交检测

β-防御素主要是由哺乳动物黏膜上皮细胞产生,分布在机体宿主-环境的界面位置。在本研究中,利用已克隆的驯鹿β-防御素reBD-1cDNA作为探针,经地高辛标记后再应用原位杂交技术检测reBD-1mRNA在驯鹿组织内的表达部位。结果显示reBD-1mRNA表达在舌背表面的复层扁平上皮内,实质性器官肾也表达在肾小管及肾小囊上皮内,而淋巴器官脾脏内reBD-1mRNA表达在淋巴细胞和红髓的巨噬细胞内。表明驯鹿β-防御素不仅表达在上皮细胞内,而且在非上皮细胞内也有表达,提示reBD-1在黏膜和系统防御中均起着重要的作用。     

马鹿β-防御素-1cDNA全长克隆、序列信息及表达分析

为了研究马鹿β-防御素-1(Red deerβ-defensin-1,redBD-1)基因的结构与功能,揭示该基因的组织表达规律。本研究利用PCR结合RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)技术从马鹿舌黏膜中克隆redBD-1基因的cDNA全长序列并对其进行了生物信息学分析,同时采用Real-time quantitative PCR(RT-qPCR)技术检测该基因在各组织的表达情况。结果表明,redBD-1基因的cDNA全长序列为455bp,开放阅读框(ORF)为192bp,编码64个氨基酸。生物信息学分析表明,redBD-1蛋白的理论分子量为6.94ku,有10个带正电荷的氨基酸残基,无带负电荷的氨基酸残基,理论等电点为10.85。预测redBD-1蛋白有一个分泌信号肽结构,无跨膜区,主要在细胞外发挥生理功能;6个保守的半胱氨酸残基分别以Cys1-Cys5、Cys2-Cys4和Cys3-Cys6连接形成3个分子内二硫键;成熟蛋白的三级结构是由β-折叠、延伸和无规则卷曲构成。redBD-1基因编码的氨基酸序列同源性最高的是梅花鹿β-防御素(siBD-1)为98.4%,其次是水牛肠β-防御素(BEBD)为92.2%,与人β-防御素-2(HBD-2)同源性最低仅为35.9%。RT-qPCR结果得出,redBD-1在被检器官中均有表达,在消化系统、呼吸系统以及生殖系统的大部分器官表达量较高,肝、肾和脾等实质性器官表达量相对较低。本试验为今后深入研究防御素基因功能以及马鹿黏膜免疫系统提供理论依据。     

未孕和3个月孕龄的小尾寒羊子宫内膜β-防御素的表达研究

β-防御素主要分布于哺乳动物黏膜上皮细胞内,是黏膜表面抗微生物屏障的组成成分.小尾寒羊是重要的家畜之一.应用实时荧光定量PCR技术,分别对未孕和孕龄3个月的小尾寒羊子宫内膜β-防御素mRNA的表达进行了荧光定量PCR检测和分析,结果表明,在未孕子宫和怀孕子宫内膜组织中均有β-防御素mRNA的表达,但怀孕的子宫内膜组织中的表达量高于未孕子宫,说明β-防御素在生殖生理中有着重要的作用,为进一步研究生殖生理中的免疫防御机制奠定理论基础.     

猪β防御素研究进展

β防御素是猪体内分泌的一类抗菌肽,广泛分布于各个组织中,在抵抗病原入侵和免疫调节中发挥着重要作用。猪β防御素对细菌、真菌和病毒都有很强的杀灭作用,并且具有分子量小、热稳定性好、无残留等优点,是理想的抗生素替代品。研究表明,猪β防御素的表达与个体抗病力正相关,增加内源性防御素表达或直接摄入外源性防御素均能增强机体免疫力并促进生长。脂肪酸、氨基酸、维生素、益生菌、病原微生物等外源刺激皆可影响β防御素的表达。随着防御素相关研究的深入,将有望解决养猪生产中长期使用抗生素而导致的耐药性、药物残留及环境污染等问题。文章介绍了猪β防御素的结构特征、表达特异性及生物学功能,主要综述了外源刺激对β防御素表达的影响及其作用机制,初步说明外源β防御素作为饲料添加剂在仔猪生产中的效果,旨在为猪β防御素的深入研究及其在生猪健康养殖中的应用提供参考。     

哺乳动物雌性生殖系统β-防御素的研究进展

β-防御素(beta-defensian,BD)在哺乳动物雌性生殖系统中广泛表达,在免疫、预防生殖道感染及胎儿正常发育等方面起到重要作用。主要对哺乳动物β-防御素在哺乳动物雌性生殖系统组织中的分布、作用及其调控进行了综述,并对其应用前景进行了展望,以期更好地揭示β-防御素在雌性生殖系统中的影响,从而为β-防御素的进一步研究提供理论依据。     

DNA甲基化参与LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞TNF-α表达

为明确DNA甲基化是否参与LPS诱导的奶牛乳腺炎,本试验研究了DNA甲基化抑制剂对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症因子表达的影响。首先用浓度为0μg/mL、1μg/mL、10μg/mL和100μg/mL的LPS分别处理奶牛乳腺上皮细胞6 h、12 h、24 h,荧光定量PCR(qRT-PCR)检测白介素-6(IL-6)、牛防御素(BNBD-5)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的mRNA表达水平,ELISA法测TNF-α的浓度,随后用浓度为1.0μmol/L、2.5 umol/L和5.0 umol/L的DNA甲基化转移酶抑制剂(5-Aza-2′-deoxycytidine,5-AZA)分别处理奶牛乳腺上皮细胞24 h、48 h、72 h,qRT-PCR检测TNF-α的mRNA表达水平。结果显示LPS处理后,IL-6、BNBD-5、TNF-α的mRNA表达水平和TNF-α的蛋白水平显著上升;5-AZA处理后的TNF-α的表达量相对于LPS处理组显著上升。表明DNA甲基化参与LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞TNF-α的表达上调。     

滩羊β-防御素基因的克隆和表达

选取滩羊β-防御素分布较多的气管、食道和口腔等部位的黏膜组织,提取组织总RNA,RT-PCR获得滩羊β-防御素基因全序列.构建逆转录病毒表达载体,实现滩羊β-防御素基因的表达.经测序后得到滩羊β-防御素编码区的核苷酸序列(64个氨基酸).成功构建了带有滩羊β-防御素基因的逆转录病毒载体pLEGFP-SBD,在蓝光激发光下能观察到绿色荧光蛋白,并用SDS-PAGE方法检测到分子量约为8 kD的目的蛋白.该蛋白具有抗细菌和抑制VSV病毒增殖的活性.     

牦牛附睾组织不同区段防御素家族基因的表达谱和生物信息学分析

牦牛是高原地区牧民收入的主要经济来源之一，如何提高牦牛的繁殖力一直备受关注。β-防御素是一类具有广谱抗菌活性的肽，研究牦牛β-防御素（Bos mutus β-defensins,bBD）家族在附睾的表达具有重要意义。本实验使用实时荧光定量PCR技术分析牦牛附睾不同区段β-防御素基因的表达情况。结果显示，共有9个β-防御素基因在附睾头、体和尾的表达存在极显著差异。bBD109、bBD119、bBD121、bBD123、bBD128、SPAG11基因集中于附睾头部表达；bBD125与bBD136集中于附睾体部表达；bBD15同时在附睾头部和体部高表达。结合生物信息学分析发现，这9种β-防御素均存在保守的氨基酸序列、反向折叠的β-转角；bBD136脂溶性最高、疏水性强，bBD125和SPAG11相反；β-防御素基因编码蛋白均为不稳定蛋白（bBD123除外），并且预测分析都存在SP型信号肽（除bBD125外）；β-防御素家族基因在附睾不同区段的差异性表达情况以及编码蛋白质的各种理化性质与结构组成等特征都表明其可能在精子成熟过程中发挥着重要作用。