山羊DCT基因启动子活性区及其转录因子调控探究

旨在探究山羊DCT基因启动子活性区及相关转录因子对该基因的调控作用,为山羊DCT基因的表达调控提供理论依据。通过对山羊DCT基因5′侧翼区序列及第一外显子区序列进行生物信息学分析,并与人和小鼠DCT基因启动子序列进行比对,同时结合在线启动子预测结果,采用快速克隆的方法构建5个5′系列缺失序列的启动子报告基因载体,以此为基础构建3′缺失序列的6个报告基因载体,并构建SOX10、MITF和OTX2转录因子结合位点点突变的6个报告基因载体,以瞬时转染的方法转染A375细胞,双荧光素酶检测试剂盒检测缺失片段和点突变片段的启动子活性。结果表明,成功构建了山羊DCT基因11个不同长度的启动子报告基因载体,-990~+232bp的P3片段荧光素酶活性极显著高于其他片段(P0.01),基于P3构建的3′系列缺失片段中-881~-154bp的P8片段荧光素酶活性极显著高于其他片段(P0.01)。转录因子SOX10结合位点突变的载体荧光素酶活性极显著降低(P0.01),MITF和OTX2结合位点突变的载体荧光素酶活性极显著增强(P0.01)。山羊DCT基因启动子核心调控区位于-881~-154bp区域,转录因子SOX10对山羊DCT基因发挥正调控作用,而转录因子MITF和OTX2对山羊DCT基因的调控作用尚需深入研究。     

鹅MyoG基因启动子活性及转录调控元件分析

旨在分析鹅MyoG基因启动子活性区域和转录因子,探究该基因的转录调控机制。本研究首先通过PCR扩增泰州鹅MyoG基因5'侧翼区序列1 245 bp并对其进行测序和生物信息学分析,其次,构建4个不同缺失片段的双荧光素酶报告载体,转染C2C12细胞系。进一步利用在线软件预测核心启动子区关键转录因子,对转录因子结合位点HNF4（-521～-503 bp）、USF （-379～-370 bp）和E2（-296～-281 bp）进行定点突变并构建突变报告基因载体,在C2C12细胞系内初步鉴定MyoG基因核心转录调控因子。最后,采集70日龄泰州鹅胸肌、腿肌、心、肝、脾、肺、肾和下丘脑组织样,利用荧光定量PCR检测MyoG基因和核心转录调控因子的组织表达谱。结果表明,扩增得到的鹅MyoG基因5'侧翼区序列包含启动子元件;利用双荧光素酶报告载体检测到鹅MyoG基因启动子区-624～-154 bp区域存在关键顺式调控元件;结合定点突变技术初步鉴定USF是鹅MyoG基因核心转录调控元件。组织表达谱研究进一步表明,MyoG和USF基因在鹅8个不同组织中均有表达,且在胸肌、腿肌和心组织中共同高表达（P<0.01）。鹅MyoG基因5'侧翼区具有启动子转录活性,-624～＋37 bp是核心启动子区,USF是MyoG核心转录调控因子。试验结果为探究MyoG基因在鹅肌肉发育过程的调控机制提供理论依据。     

徐淮山羊c-Myc基因启动子的克隆及其功能的初步分析

本研究旨在确定徐淮山羊c-Myc基因启动子区域,找出该基因启动子的核心调控区,初步探讨c-Myc基因的表达调控机制。根据UCSC基因组数据库已公布的绵羊c-Myc基因的启动子序列,设计特异性PCR引物扩增c-Myc基因的一系列启动子缺失片段,定向克隆至pEGFP-N1和PGL3-c-Myc,分别转染gFF、COS7及P19细胞,并进行TSA和NFAT1诱导,同时对-402~-249bp区域的转录因子SP1结合位点进行定点突变,最后进行双荧光报告基因活性检测。结果表明,徐淮山羊c-Myc基因5′侧翼区-1 334~+1bp区域的启动子活性最强,-402~+1bp区域为c-Myc基因启动子基本活性区域。进一步研究发现,-1 334~-971bp、-587~-147bp区域存在正调控元件,-1 976~-1 334bp、-971~-587bp区域存在负调控元件。TSA和NFAT1均能增强cMyc启动子的活性,SP1结合位点定点突变后,启动子活性降低。本试验通过构建包含c-Myc基因启动子不同片段的重组报告基因载体并比较其转录活性,确定了c-Myc基因启动子的核心区域,发现转录因子SP1是c-Myc基因启动子核心区域的调控元件,为进一步研究c-Myc基因的表达调控机制奠定了基础。     

关岭牛解偶联蛋白3基因5’侧翼区克隆和生物信息学分析

本试验对贵州关岭牛解偶联蛋白3（uncoupling protein,UCP3）基因5'侧翼区进行克隆,并利用生物信息学软件对其1080 bp的克隆序列进行分析,以研究UCP3基因5'侧翼区特异性转录调控元件的调控机制。软件分析发现关岭牛UCP3基因5'侧翼区含有6个可能的转录起始点和33个潜在转录因子结合位点,与东北虎、家猫、印度水牛、藏羚羊、山羊、绵羊UCP3基因5'侧翼区（-196～+100 bp）序列相似性分别为82%、82%、98%、95%、96%和98%;该区域保守性较强,推测转录起始点上游-200～+1 bp可能是其核心启动子区域,该区域在调控基因转录和翻译方面具有共同的作用。试验成功克隆了UCP3基因5'侧翼区序列1080 bp,初步预测了该基因的核心启动子区。     

猪DKK1基因启动子区的克隆及其活性分析

旨在初步探索DKK1基因转录调控机制,本研究利用启动子在线预测软件分析了该基因启动子区序列特征,根据Ensembl数据库已公布的猪DKK1基因的5′侧翼区序列,设计特异性PCR引物进行扩增、测序,进而构建启动子区不同缺失片段的pGL3-DKK1双荧光素酶表达载体,分别转染293T细胞和Hela细胞,并进行双荧光素酶报告基因检测。结果显示,DKK1基因启动子中含有1个TATA-box、多种转录因子和1个CpG岛;DKK1基因启动子对239T细胞具有偏好性,其中p-1 679/+292bp启动子片段活性最高,且显著高于其他缺失片段(P0.01)。-953~-1 679bp为核心启动子区域,-586~-953bp区域可能存在负调控元件,在-953~-1 679bp区域可能存在正调控元件。本试验通过对DKK1基因进行生物信息学分析并结合不同长度启动子片段双报告基因活性检测,证实了DKK1基因的5′侧翼区序列具有启动子转录活性,并初步确定了该基因的启动子区域,找到了启动子的核心区域和主要调控区域,为进一步研究DKK1基因转录调控机制奠定基础。     

牛α-乳清蛋白基因5'调控区多态性研究

试验选择品种差异较大的贵州荷斯坦奶牛和务川黑牛构建不同DNA池,设计1对引物分别扩增2个牛种α-乳清蛋白(alpha-lactalbumin, LALBA)基因5'调控区及第1外显子部分序列总长1126 bp。结果表明,LALBA基因5'调控区存在5个SNPs位点:T-114C、C-166T、A-225C、C-344T、T-778C,T-114C仅在务川黑牛表现多态性。生物信息学软件预测LALBA基因核心启动子区及转录因子结合位点,SNP位点导致11个转录因子结合位点消失,其中1个位于核心启动子区,产生5个新的转录因子结合位点。突变前后RNA二级结构发生明显改变,目标序列未发现CpG岛。     

牛MYOZ2基因启动子克隆及活性分析

旨在克隆测定牛肌原调节蛋白2基因(Myozenin2,MYOZ2)启动子的全长序列,进行活性区域分析,为牛MYOZ2基因功能和表达调控机理研究提供理论依据。通过5′RACE方法确定牛MYOZ2基因转录起始位点;采用PCR技术,以牛基因组为模板克隆MYOZ2基因启动子序列。利用在线软件分析启动子区域中可能包含的转录因子结合位点。依据分析结果重新设计引物,构建7个包含不同缺失片段的双荧光素酶报告基因载体,转染C2C12细胞系,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动子活性。结果表明,克隆得到牛MYOZ2基因启动子序列2 065bp,确定MYOZ2基因的转录起始位点;MYOZ2基因片段-84/+125荧光素酶相对活性极显著高于空载体pGL3-Basic(P0.01),MYOZ2基因片段-683/+125荧光素酶相对活性极显著高于基因片段-263/+125(P0.01)。MYOZ2基因启动子核心区域位于-84/+125bp,而且MEF2,SRF,MyoD,YY1等转录因子可能参与MYOZ2基因的转录调控。     

鹅p21基因克隆、启动子分析及转录调控研究

【目的】 分析鹅p21基因的结构和启动子活性，探讨p21基因的转录调控机制。【方法】 以泰州鹅为试验对象，通过同源克隆、RACE和生物信息学分析等方法获得鹅p21基因全长序列和5′-侧翼区序列特征；构建6个不同缺失片段的启动子区双荧光素酶报告载体并分析其荧光素酶活性，进而确定p21基因核心启动子区；对核心启动子区转录因子结合位点生肌决定因子(MyoD)(+25~+36 bp)进行定点突变，并构建突变报告基因载体，在C2C12细胞系内初步鉴定鹅p21基因核心转录调控因子。【结果】 鹅p21基因cDNA全长1 943 bp，CDS区大小为453 bp，编码151个氨基酸，蛋白序列包含高度保守的CDI家族结合位点。系统进化树分析表明，鹅p21基因与鸭亲缘关系最近，与鸡和火鸡有较强的进化关系。鹅p21基因5′-侧翼区包含启动子元件，—35~+37 bp是核心启动子区，发挥正向调控作用，结合定点突变技术初步鉴定MyoD是鹅p21基因核心转录调控元件。【结论】 本研究获得了鹅p21基因完整的cDNA序列和启动子区域，MyoD是p21基因核心转录调控因子，为探究p21基因在鹅胚胎期肌肉发育过程中的调控机制提供理论依据。     

猪Nhlh2基因启动子活性及其表达调控的初步研究

旨在研究母猪Nhlh2基因启动子活性及其与转录因子之间的调控关系,为探索该基因的表达调控提供分子水平的依据,也为研究母猪繁殖机制提供一定的参考。本研究以猪卵巢组织DNA为模板,PCR扩增Nhlh2不同长度的启动子缺失片段,克隆到pGL3-basic载体构建启动子报告基因重组质粒,并将其转染到猪卵巢颗粒细胞,测定相对双荧光素酶活性值;通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP),研究Nhlh2启动子与YY1、C/EBPβ蛋白之间的相互作用;随后构建转录因子超表达、突变载体和小干扰RNA(siRNA),利用双荧光素酶检测系统进行活性验证。经双荧光素酶报告系统检测发现,Nhlh2基因的P7(-238~+129)区域启动子转录活性最高,-654~-238片段范围可能存在负调控元件,-238~-20区域可能存在正调控元件;通过生物信息学分析和ChIP验证,Nhlh2启动子区-101~-85和-153~-140区域分别是转录因子YY1和C/EBPβ的结合位点;突变YY1和C/EBPβ的结合位点后,P7的双荧光活性显著上调;超表达YY1和C/EBPβ后,P7的双荧光活性显著下调;干扰YY1和C/EBPβ的表达后,P7的双荧光活性显著上调。本研究确定了猪Nhlh2基因的核心启动子区域为-238~+129,YY1和C/EBPβ分别结合在Nhlh2基因启动子区的-101~-85和-153~-140区域,抑制猪Nhlh2基因的转录活性。     

牛CART基因核心启动子鉴定及转录调控分析

旨在筛选牛CART基因核心启动子区并鉴定调控CART表达的转录因子,探究其转录调控机制。本研究采集3头健康母牛下丘脑组织,提取基因组DNA,通过PCR扩增、测序获得牛CART启动子序列,EMBOSS、MethPrimer、New PLACE数据库分析启动子结构特征;构建4个包含不同截短长度的CART启动子报告基因载体,双荧光素酶报告基因活性检测鉴定核心启动子区;应用DNA pull down结合质谱分析(n=3),功能聚类及结合位点预测分析筛选核心启动子区候选转录因子;构建转录因子过表达载体,转染至293T细胞,分析转录因子对牛CART核心启动子区的转录调控功能(n=3)。结果表明,牛CART基因-1 200 bp～+22 bp区域存在CpG岛和TATA box、CAAT box等顺式作用元件;构建的4个截短启动子报告基因载体均具有转录起始活性,-292 bp～+22 bp片段转录起始活性最强,为牛CART基因核心启动子区;转录因子RFX5、CREB、RFX1、JUND、TEAD4、TFAP2D、RELA可与牛CART基因核心启动子区特异性结合;进一步研究证实RFX5、RFX1、TEA...     

猪StAR基因启动子区克隆及其转录活性研究

旨在通过分析猪StAR基因启动子活性区域,探究猪StAR基因的转录调控机制,从育种学角度为提高猪繁殖力提供新思路。本研究根据Ensembl数据库已公布的猪StAR基因的5′侧翼区序列,利用在线预测软件对该基因启动子区序列信息进行分析,以大白猪基因组DNA为模板,利用特异性引物,进行PCR扩增、测序,进而构建启动子区不同缺失片段的pGL3-StAR双荧光素酶表达载体,转染293T细胞并进行活性检测。结果显示,StAR基因5′侧翼区不含有典型的TATA-box和CpG岛;成功克隆了10个含有不同长度的启动子片段,并构建了各片段与表达载体的重组质粒;转染293T细胞后经双荧光素酶活性检测发现,大白猪StAR基因5′侧翼区存在着核心启动子,其中-196~+127bp这一区域活性值最高,且显著高于其他缺失片段(P0.01),表明在+127~-196bp的区域内存在重要的正调控因素,外显子1对启动子活性起重要的调控作用。-41~-196bp为核心启动子区域,该区域存在着关键的正调控元件,包含GATA2、GATA4、SP1、ZNF263、Hoxa9、KLF16和ZNF740转录因子结合位点。本试验通过对StAR基因进行生物信息学分析,并结合不同长度启动子片段双报告基因活性检测,证实了StAR基因的5′侧翼区序列具有启动子转录活性。初步确定了该基因的启动子区域,找到了启动子的核心区域和主要调控区域,为进一步研究StAR基因转录调控机制提供理论依据。     

关岭牛肌球蛋白重链1基因5'侧翼启动子的克隆和生物信息学分析

本试验旨在进行关岭牛肌球蛋白重链1（myosin heavy chain 1,MYH1）5'侧翼启动子的克隆和生物信息学分析。采集关岭牛血液及组织样品（背最长肌、后腿肌、心脏、肝脏、小肠、脂肪组织）,利用PCR方法扩增关岭牛MYH1基因5'侧翼区,构建关岭牛pUCm-T-MYH1克隆载体,并对MYH1基因5'侧翼区进行生物信息学分析,最后利用实时荧光定量PCR法测定了MYH1基因在关岭牛不同组织中的表达。结果显示,本试验成功获得1 373 bp（-1 360~+12 bp）的MYH1基因5'侧翼启动子序列;利用生物信息软件对获得的克隆序列进行分析发现,MYH1基因5'侧翼启动子序列存在5处可能的转录起始点和多个潜在转录因子结合位点;关岭牛与金丝猴、野猪、家鼠、藏羚羊、野驴的MYH1基因5'侧翼区保守性较强的区域为转录起始点上游-400~+100 bp,推测转录起始点上游-400~+75 bp可能是其核心启动子区域。实时荧光定量PCR分析发现,MYH1基因在关岭牛背最长肌和后腿肌中高表达,在心脏、肝脏、小肠、脂肪组织中表达量很低,说明MYH1基因表达具有组织特异性。     

猪SEPW1基因的转录调控分析

本研究旨在对猪SEPW1基因的潜在启动子区进行克隆及转录活性分析，获得其核心启动子区域，并进一步分析转录因子SP1对SEPW1基因转录活性的影响，为探索SEPW1基因在猪肉质性状方面的功能奠定基础。利用实时荧光定量PCR检测SEPW1基因在大白猪各组织中的表达量，构建空间表达谱；通过PCR技术克隆得到6个逐级缺失的SEPW1基因启动子片段，构建6个双荧光素酶报告载体，通过检测各载体的双荧光素酶活性获得SEPW1基因的核心启动子区域；对核心启动子区进行生物信息学分析，发现潜在的SP1转录因子结合位点；通过过表达、抑制表达、定点突变及凝胶迁移试验（EMSA）确认SP1转录因子结合位点的存在及其对SEPW1基因转录活性的影响。结果显示，SEPW1基因在所检测的4月龄大白猪12个组织中均有表达，其中在腓肠肌及心脏中的表达量较高。双荧光素酶活性显示，猪SEPW1基因5'侧翼区-443~-231 bp为其核心启动子区，且-378~-306 bp存在1个潜在的SP1结合位点。过表达和抑制表达SP1基因结果显示，转录因子SP1能够促进SEPW1基因的转录；定点突变及EMSA试验确认，转录因子SP1可直接与SEPW1基因启动子区的SP1结合位点（-348~-339 bp）相结合。综合以上结果表明，转录因子SP1可直接靶向SEPW1基因的启动子区并促进SEPW1基因的转录。     

牛GDF9基因5'侧翼区克隆及生物信息学分析

生长分化因子9(GDF9)是转化生长因子B(TGF-β)超家族的一个新成员,对哺乳动物卵泡的发育有重要的调控作用.本研究克隆了牛GDF9基因5,侧翼区1 370 bp的基因组序列,生物信息学分析表明,该区域的平均GC含量为38.5%,利用CpG岛在线预测软件CpGProD分析表明,牛GDF9基因5'侧翼区没有CpG岛;利用Promter在线工具分析发现牛GDF9基因可能存在2个启动子位点,一个在翻译起始密码子前353bp处,另一个在翻译起始密码子前683 bp处;利用TFSiteScan在线程序分析发现该区域有98个潜在的转录因子结合位点,其中包括一些真核生物启动子的核心元件.如1个TATA-bo、4个GC-box等,表明该区域是转录因子结合位点比较密集的区域.     

牛Ankrd2基因启动子遗传多态性及启动效率分析

采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术,检测462头中国西门塔尔牛Ankrd2基因启动子区域的单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点,分析了SNP位点与牛肉质和胴体性状的关联性,利用生物信息学网站和软件对启动子序列进行预测分析;另一方面,采用点突变构建含有SNP位点不同基因型的双荧光素酶报告基因载体,分别瞬时转染293T细胞和牛胎儿成纤维细胞,测定荧光素酶的相对活性并进行统计学分析。结果显示:牛Ankrd2基因启动子区域(-2101～+436 bp)中存在1个SNP位点:g.-171G>T,该位点在检测的牛群体中仅存在2种基因型:GG和GT,其中G为优势基因,且该位点对牛肺和气管重影响达到显著水平(P<0.05),当G突变为T时,启动子序列减少2个ZF5转录因子结合位点,增加了1个FACB转录因子结合位点,pGL4-Ankrd2-TT启动子启动效率极显著低于野生型载体pGL4-Ankrd2-GG(P<0.01)。结果表明,在中国西门塔尔牛群体Ankrd2基因启动子区存在g.-171G>T,位点与牛胴体性状存在相关性,且该位点可能通过改变转录因子结合位点,从而影响基因的启动子转录活性。     

牦牛FKBP6基因启动子区克隆、鉴定与分析

本研究旨在了解牦牛FKBP6基因5′调控区和启动子区特征,为探讨牦牛和犏牛睾丸组织中FKBP6基因差异表达机制提供依据。利用克隆测序获得牦牛FKBP6基因5′调控区序列,采用生物信息学方法分析其序列特征;采用双荧光素酶报告基因系统鉴定牦牛FKBP6基因核心启动子区,利用生物信息学软件预测与精子发生有关的转录因子结合位点。通过克隆测序和序列拼接获得了1 354bp的牦牛FKBP6基因5′调控区序列,与普通牛的一致性为99.71%;牦牛FKBP6基因5′调控区序列含有潜在的启动子区、典型的CAAT-Box和CpG岛,但未见TATA-Box;荧光素酶活性分析发现,牦牛FKBP6基因的核心启动子区位于5′调控区的-263~-167nt区域,含有CAAT-Box、E-Box、CTCF和CREB等与精子发生相关的转录因子结合位点。牦牛FKBP6基因核心启动子的鉴定和精子发生相关转录因子结合位点的发现为进一步研究牦牛睾丸组织中FKBP6基因的表达调控奠定了基础。     

北极狐TYRP1基因启动子活性及转录调控区域分析

通过分析调控北极狐毛色基因TYRP1启动子核心区域及转录因子,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据,并为狐狸毛皮品质分子育种和彩色毛皮新材料的创制提供思路。通过基因组测序技术获得了北极狐TYRP1基因启动子序列,并利用生物信息学方法对北极狐TYRP1基因核心启动子区域和转录因子结合位点进行预测;以北极狐基因组DNA为模板,PCR扩增北极狐TYRP1基因不同长度的启动子缺失片段克隆至pGL3-Basic载体,将重组质粒瞬时转染到A375和293T细胞,利用双荧光素酶基因检测仪进行活性验证。结果表明,成功构建了9个含有不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶活性检测发现北极狐TYRP1基因-699/+35区域为核心启动子区域,-699/-93区域存在着TYRP1基因正调控元件。生物信息学预测分析发现该区域存在4个转录因子结合位点;利用重叠延伸PCR技术成功构建了4个突变载体,经双荧光素酶活性检测发现4个突变载体活性均显著下降(P0.05),表明这4个转录因子是北极狐TYRP1基因转录调控的正调控元件。本研究确定了北极狐TYRP1基因启动子核心区域-699/+35,Sp1(-656/-646)、CREB(-598/-589)、Sp1(-539/-530)和Sp1(-163/-154)为北极狐TYRP1基因转录的正调控元件。     

牛GDF5基因启动子的克隆与序列分析

旨在了解生长分化因子5(GDF5)可能的调控序列。本研究通过基因组比对,扩增了牛GDF5基因5′侧翼区,并通过产物纯化、连接、转化及测序比对,确定了2043bp的启动子序列。同时综合考虑已经证实的人GDF5基因启动子结构及应用启动子在线分析软件,对该序列进行分析。结果发现,牛GDF5基因5′侧翼区没有CpG岛,序列比对发现,牛和人GDF5基因启动子区域同源性为78%;牛GDF5基因启动子没有TATAbox或CAATbox结构,其转录起始位点位于翻译起始密码子ATG上游-359bp位置,其潜在的转录因子有AML-la,Ap-1,AmL-la,CdxA,SRY,CdxA,TATA,AmL-la,GTATA-1,MZF1,CdxA,Nkx-2,CdxA,S8和SRY,其中Ap-1,AmL-la,SRY,Nkx-2,S8和SRY高度保守,与人的序列完全一致;推测发现牛GDF5基因启动子-457至-423bp序列中的GT重复序列可以增强启动子的活性,且最小增强子处于-458和-377bp之间。研究结果推测判定了牛GDF5基因启动子的转录起始位置、转录结合位点、活性序列及最小增强子序列,为以后深入研究GDF5基因在牛软骨细胞中的表达机制提供了理论基础。