猪skMLCK基因RNAi慢病毒载体的构建及干扰效率测定

为了构建猪骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(sk MLCK)基因有效短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体,筛选出最佳干扰效率的序列,采用RNAi技术,设计并合成3条siRNA干扰序列,插入到慢病毒穿梭质粒(h U6-CMV-puror-Ploy A)上,与慢病毒包装系统共转染293T细胞,收集病毒上清并进行病毒滴度的测定,将其转染小鼠C2C12细胞,分别用实时定量PCR和Western blot方法检测细胞中sk MLCK基因mRNA和蛋白的表达。结果显示:PCR扩增和测序分析结果显示靶向sk MLCK RNAi慢病毒载体构建成功;转染小鼠C2C12细胞后,sk MLCK基因mRNA和蛋白均受到不同程度抑制,实时定量PCR显示,抑制率分别为(29.2±4.43)%、(76.4±7.33)%、(20.0±1.8)%;Western blot显示,抑制率分别为(29.6±5)%、(42.4±1.6)%、(34.3±1.2)%。结论:成功构建猪sk MLCK基因有效shRNA的慢病毒载体,确定干扰载体-2(sk MLCKRNAi-2)具有最佳干扰效果,证实sk MLCK基因RNAi慢病毒载体能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达,为进一步研究该基因与肌肉肉质性状的关系奠定了基础。     

RNA干扰抑制ST细胞Ⅰ型干扰素受体-2表达的研究

应用RNA干扰技术建立猪睾丸(ST)细胞Ⅰ型干扰素受体-2(IFNAR-2)基因knock down模型。采用FuGENE HD转染剂将pSiCMVE1、pSiCMVE2和pSiCMVE3干扰载体分别转染ST细胞,经荧光定量PCR和Western blot分别检测IFNAR2mRNA和蛋白水平表达变化。结果显示,与对照组比,转染干扰载体组均可明显降低IFNAR2 mRNA和蛋白的表达(P0.05)。RNA干扰技术能够有效抑制IFNAR2基因的表达,为进一步研究IFNAR2基因的生物学功能提供可靠的手段,为研究IFNAR2在病毒感染中的作用奠定基础。     

敲低RACK1基因抑制C2C12细胞中MyoG和MHC基因表达

本实验旨在研究RNA干扰(RNAi)RACK1基因对C2C12成肌细胞中肌分化标志基因MHC和MyoG表达的影响。将人工合成的靶向RAKC1基因的3条si RNA(1,2,3)转染C2C12细胞,用RT-qPCR方法检测并筛选干扰效率最高的1条siRNA。将筛选出的si RNA转染C2C12成肌细胞并诱导细胞分化,通过RT-qPCR、Western blot和免疫荧光方法在mRNA及蛋白水平检测RACK1基因沉默后对MHC和MyoG表达的影响。此外,Western blot方法检测RACK1基因沉默后对PI3K/Akt和Erk/MAPK通路激活的影响。结果表明:RACK1-si RNA-2干扰效率最高,转染48 h后抑制率可达70%。随后,C2C12细胞转染si RNA-2,诱导分化48h后RTqPCR表明,MHC和MyoG的m RNA表达均显著性下调(P<0.05);诱导分化72 h后,Western blot和免疫荧光结果表明MHC和MyoG的蛋白表达明显低于对照组,但AKT和Erk磷酸化水平未见明显变化。上述结果表明,干扰RACK1能显著抑制MHC和MyoG的表达,提示RACK1正向调控C2C12成肌细胞的分化。     

丝切蛋白CFL2基因低表达对小鼠成肌细胞C2C12肌纤维信号通路关键成分的影响

探讨低表达丝切蛋白CFL2基因对小鼠成肌细胞C2C12信号通路关键成分的影响。采用RNAi技术,将猪CFL2基因真核表达shRNA重组体稳定转染至小鼠成肌细胞C2C12后提取其总RNA和总蛋白质,采用Real-time PCR和Western blot检测CFL2基因低表达后成肌细胞C2C12信号通路关键成分(MEF2C、sk MLCK、Rho A、AMPKα2、p38和Ca M)的表达情况。结果表明:在3个稳转细胞株中MEF2C、Ca M、p38和AMPKα2的mRNA表达均为极显著下调(P0.01),sk MLCK的mRNA表达为极显著上调(P0.01),其它成分不显著;MEF2C和Ca M的蛋白表达在3个稳转细胞株中均为显著或极显著下调(P0.05或P0.01),其他4种成分(p38、Rho A、AMPKα2和sk MLCK)均差异不显著(P0.05),说明CFL2低表达显著下调信号通路关键成分MEF2C和Ca M的表达,CFL2与Ca M和sk MLCK分别呈显著正相关和负相关。     

猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA真核表达载体的构建

本文旨在研究猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA在猪睾丸支持细胞（ST）中的干扰作用。利用PCR法从ST细胞基因组中扩增猪睾丸ACE启动子,构建重组质粒ACE-pIRES2-DsRed、ACE-pGL3-basic,通过红色荧光蛋白表达和双荧光素酶报告基因检测试验检测猪睾丸ACE启动子在ST细胞中的转录活性;根据SPAG6 mRNA靶序列设计合成3条siRNA序列,通过脂质体转染至ST细胞,利用实时荧光定量PCR及Western Blot检测siRNA的干扰效率;基于人miR-30a结构设计SPAG6 shRNA,构建重组载体ACE-sh-SPAG6-pcDNA3.1,Western Blot检测其对SPAG6的干扰效果。结果表明,成功构建重组质粒ACEpIRES2-DsRed、ACE-pGL3-basic,并证明猪睾丸ACE启动子在ST细胞中具有较强的转录活性;各试验组均能对靶基因SPAG6 mRNA的表达产生抑制作用,以siRNA-3的作用最佳。siRNA-3转染48 h后,SPAG6蛋白表达量显著下降（P<0.001）,成功筛选出SPAG6基因的最佳干扰序列;成功...     

靶向akirin2基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效率的测定

为了抑制C2C12细胞中akirin2基因的表达,试验采用siRNA表达载体法构建了靶向akirin2基因的RNA干扰(RNAi)真核表达载体。首先针对akirin2基因设计并合成了相应的干扰序列,退火后将其与RNAi表达载体psiRNA-h7SKGFPzeo进行连接,构建成干扰载体akirin2-pshRNA0、akirin2-pshRNA1。将构建好的载体通过Turbofect转染试剂转染小鼠成肌细胞C2C12,通过荧光定量PCR检测其干扰效率,经酶切和测序鉴定所构建的akirin2基因RNA干扰载体与设计序列完全相符。结果表明:重组干扰载体akirin2-pshRNA0和akirin2-pshRNA1构建成功。将重组RNAi载体转染C2C12细胞,与正常对照组相比,转染akirin2-pshRNA1组的akirin2基因mRNA相对表达量显著降低,表达量下调了60.62%(P0.05)。说明试验构建的靶向akirin2基因的RNAi载体akirin2-pshRNA1可以有效地抑制C2C12细胞中akirin2基因的表达。     

稳定表达猪skMLCK基因的小鼠成肌细胞株构建及鉴定

为了获得稳定表达猪skMLCK基因的小鼠成肌细胞C2C12细胞株,将猪skMLCK基因cDNA序列T-A克隆至pMD-18T载体;重组质粒经双酶切后,定向克隆至真核表达载体,获得表达重组质粒pEGFP-N1-skMLCK;经脂质体介导,重组质粒稳定转染入C2C12细胞中;通过实时定量PCR方法检测skMLCK基因的表达水平,以及其他相关基因的表达情况。结果:获得了稳定表达猪skMLCK基因的C2C12细胞株;连续培养30d后,用实时定量PCR方法检测到skMLCK基因高表达,同时发现CFL2b和MEF2C基因表达下调。试验表明稳定表达猪skMLCK基因的小鼠成肌细胞系构建成功,为猪skMLCK基因功能的进一步研究提供了前期工作基础。     

PTEN基因干扰对牛脂肪细胞凋亡的影响

实验旨在研究RNA干扰PTEN基因对牛脂肪细胞中p-Akt蛋白及凋亡蛋白Caspase-3表达的影响。将人工合成的靶向PTEN基因的3条干扰质粒Si-952组、Si-1331组、Si-1435组及阴性对照组(只加转染阴性对照质粒)和空白组(只加PBS缓冲液),在脂质体介导下转染牛脂肪细胞,用RT-qPCR方法检测并筛选干扰效率最高的1条Si RNA。Western blot法检测PTEN基因沉默后对p-Akt和Caspase-3表达的影响。结果表明:PTEN-Si-1331组干扰效率最高,转染48 h后抑制率可达85%;牛脂肪细胞转染Si-1331组Caspase-3蛋白表达水平极显著低于阴性对照组和空白组(P0.01),而p-Akt蛋白表达水平显著高于阴性对照组和空白组(P0.01)。上述结果表明,干扰PTEN基因能显著抑制Caspase-3的表达,提高p-Akt的表达,揭示低表达PTEN通过调控Akt信号通路抑制牛脂肪细胞凋亡。     

关岭牛MEF2A基因干扰载体构建及其转染对成肌细胞的影响

旨在构建肌细胞增强因子MEF2A(myocyte enhancer factor 2A)基因的重组干扰载体,探究MEF2A基因对牛成肌细胞的影响。本研究选择3头健康的3日龄雌性关岭牛,体重约为21 kg,采集背最长肌组织成功培养成肌细胞。设计MEF2A基因的4对shRNA干扰序列和1对NC阴性对照序列,将其连接至pGPU6-GFP-Neo载体上,转染重组载体至关岭牛成肌细胞。采用qRT-PCR法筛选干扰效率最佳的载体,并检测干扰MEF2A基因对肌生成因子MEF2B、MEF2C、MEF2D,周期与凋亡因子CDK2、CCNA2、BCL2 mRNA表达水平的影响;随后利用流式细胞仪与酶标仪探究干扰载体对成肌细胞增殖生长的影响,各试验组别设置3个生物学重复。同时运用在线软件预测牛MEF2A蛋白理化性质与网络谱图。结果显示,本研究成功筛选出干扰效率最佳的shRNA-MEF2A-3载体(P<0.01)。MEF2A基因被抑制后,成肌细胞中MEF2B、MEF2C与MEF2D基因表达量均极显著上调(P<0.01);CDK2与BCL2表达量皆显著下调(P<0.05),CCNA2表达量极显...     

RNA干扰的研究方法

RNA干扰(RNAi)技术是把与内源mRNA编码区同源的小片段外源双链RNA(doublestranded RNA)导入细胞中,导致特定基因表达沉默的一种技术.本文简要描述了RNAi的起源、原理、在动物方面的应用领域;主要叙述了RNAi技术的机制以及siRNA试验步骤,包括siRNA的设计、合成、检测方法等;比较了各种方法的特点.     

RNA干扰研究进展

将双链RNA导入细胞内会引起与其同源基因的沉默,这种现象称为RNA干扰(RNA interference,RNAi).作者就RNA干扰的作用机现,RNA干涉技术和RNA干扰的应用等方面的研究进展作一综述.     

RNA干扰与基因沉默

1995年康奈尔大学的Guo等在利用反义RNA技术特异性阻断秀丽新小杆线虫(C．elegans)中的par-1基因表达时，意外发现在对照组中给线虫注射正义RNA，同样也抑制了par-1基因的表达。1998年华盛顿卡耐基研究所的Fire和麻省理工学院的Mello证实了Guo等观察到的正义RNA抑制基因表达的现象，其主要原因是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA(dsRNA)，但把体外转录得到的单链RNA(ssRNA)纯化后注射到线虫体内，     

RNA干扰技术应用研究进展

RNA干扰技术作为一个强有力的反向遗传学工具,不仅为抑制基因表达提供了高效、特异性的手段,而且为基因功能研究、抗病毒感染研究和基因治疗研究提供了重要的技术方法。本文就近年来RNA干扰技术在动物抗病毒感染研究、动物基因组学研究及转基因动物等方面的应用最新进展作一简述。     

RNA干扰和病毒基因沉默

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是正常动植物体内的一种通过双链RNA来沉默基因的自然现象。细胞内存在的双链RNA(dsRNA)被特异性的内切酶切割成为一种由长约21nt～23nt的小分子干扰RNA(siRNAs),有时它在正常的细胞中就存在,这种小分子干扰RNA和一些相关蛋白质组成RNA诱导沉默复合体我们称为来发挥作用。主要通过与特定基因编码的信使RNA(mRNA)作用来高效特异地阻断特定基因的表达。RNAi具有高效性和高度特异性,可能成为阻断病毒入侵和关闭基因的新技术,在基因功能研究和疾病基因治疗中发挥重要作用。     

RNA干涉机制研究进展

RNA干涉(RNAi)是近年来的研究热点,相关综述有很多。但随着研究的不断深入,RNAi的作用机制和影响变得越来越复杂,以致难以简单而准确地定义RNAi。新的研究发现主要有:(1)RNAi在异染色质形成中有重要作用,并影响染色质修饰的分布,如组蛋白H3K9甲基化和DNA甲基化。(2)在RNAi中会产生二级siRNA,使干涉效果增强;二级siRNA为不同的Argonaute家族蛋白所结合,其作用机制更加复杂。(3)新鉴定出具有RNAi作用的小RNA,如rasiRNA和piRNA,其产生和作用机制都与dsRNA和siRNA有所不同。此外,论文还介绍了RNAi在治疗癌症和人畜传染病等方面的应用,并对应用中出现的问题进行了讨论。     

哺乳动物RNAi抗病毒机制研究进展

RNAi是由双链小RNA(siRNA)介导的以序列特异性方式诱导同源mRNA降解的一种新技术,由于其特异性和高效性,已成为当前广泛应用的特异性基因阻断技术。虽然内源性RNAi机制在果蝇、秀丽隐杆线虫、拟南芥等低等动植物中的抗病毒侵染作用已较为明确,但在高等动物尤其在哺乳动物抗病毒感染中的研究一直处于探讨阶段。近期,《Science》等顶级学术期刊上,连续发表将RNAi应用于哺乳动物病毒性疾病的治疗性研究。发现去除病毒中的抑制蛋白,乳鼠体内产生大量内源性siRNA并对病毒进行攻击,且成功抑制病毒扩增,使得乳鼠存活。研究结果均证明RNAi在哺乳动物中也具有抗病毒功能,从而为高等动物病毒病的预防及治疗开辟了一条新途径。本文简单回顾RNAi的抗病毒作用机制,叙述RNAi在哺乳动物水平上的研究情况,尤其是近期应用RNAi在小鼠以抵抗病毒对机体的感染和相关应用与安全性问题取得的新进展。     

RNA干扰的实验方法及应用

<正>RNA干扰(RNA interference,RNAi)就是把与内源mRNA编码区同源的长度为19～23bp的外源双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)导入细胞中,通过一系列细胞内反应引发细胞中相应mRNA的降解,从而导致特定基因表达沉默的一种技术;是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵,抑制转座子活性及基因表达的监控机制。     

Preliminary studies on bacterial interference of staphylococcosis of chickens

Previous studies indicated that Staphylococcus epidermidis strain 115 might be an effective interfering agent in reducing the rate of staphylococcosis in turkeys. In the present study, strain 115 was avirulent when administered to 3-day-old chicks by oral, aerosol, or intravenous route. Strain 115 adhered specifically to tracheal, lung, air-sac, and liver cells in vitro and interfered with subsequent colonization by virulent Staphylococcus aureus. In vivo colonization of lungs and livers of young chicks occurred following exposure to aerosols of strain 115. Strain 115 interfered with the in vivo colonization of lungs and livers by virulent S. aureus.