牛骨骼肌酵母双杂交cDNA文库构建

为构建应用于酵母双杂交系统的牛骨骼肌cDNA文库,利用Trizol法提取牛骨骼肌总RNA,采用SMART技术PCR扩增合成cDNA第二链片段,并与文库线性载体pGADT7-Rec共转化酵母菌Y187构建酵母双杂交文库。结果显示文库容量达到1．7×10^7cfu／mL,插入片段主要在0．5～3kb范围内,文库重组率为80％。以上结果表明该文库质量好,能够通过筛选文库得到与目的蛋白相互作用的蛋白质。     

瑟氏泰勒虫与环形泰勒虫某些特性的比较研究

通过长角血蜱和残缘璃眼蜱的交互传递试验、虫体形态学观察及过氧化物酶等同工酶的分析，对瑟氏泰勒虫及环形泵勒虫作了比较研究。结果表明，长角血蜱只能传播瑟氏泰勒虫而不能传播环形泰勒虫；同样，残缘璃眼蜱只能传环形泰勒虫而不能传播瑟氏泰勒虫。瑟氏泰勒虫以杆形和梨子形为主，其比例一般保持在６７％－９０％之间；而环形泰勒虫则主要以圆形和卵圆形为主，占总数的７０％－８５％。经聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析表明，这两个种     

ST细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为了筛选与猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）结构蛋白VP2相互作用的宿主蛋白,深入研究病毒入侵及致病的分子机制,本试验建立了ST细胞酵母双杂交cDNA文库。采用RNeasy Min Kit提取ST细胞的总RNA,反转录合成cDNA第一链之后,通过SMART技术合成了双链cDNA,并利用同源重组的方法,构建了ST细胞的酵母cDNA文库。结果显示,文库滴度为8.1×10⁸ CFU/mL,插入的双链cDNA片段大小为250~1 000 bp,平均大小约为500 bp,文库的重组率为96%。此文库可用于筛选与病毒相互作用的ST细胞宿主蛋白,为进一步阐明病毒的致病机制奠定了基础。     

金堂黑山羊卵巢酵母双杂交cDNA文库的构建和鉴定

以四川省金堂黑山羊卵巢为材料,从其卵巢组织中提取总RNA,应用SMARTTM cDNA library construction技术,构建以真核表达栽体pGAT17-Rec为基础的黑山羊卵巢酵母双杂交cDNA文库.结果表明,提取的RNA的A260/A280为1.95,28S与18s带浓度及亮度比值约为2.文库ds cDNA弥散较长,分布在0.2～3 kb,成瀑布条带状,而且在接近1 kh的区域有密集的条带,为高丰度表达基因.根据生长菌落计数,共获得1.6×106个转化子,文库插入片段大小约为0.1～2 kb.成功构建了金堂黑山羊卵巢酵母双杂交cDNA文库,为黑山羊多胎相关因子的基因筛选奠定了基础.     

梨酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

酵母双杂交是检测蛋白质之间相互作用的有效手段。构建梨酵母双杂交cDNA文库,能为利用酵母双杂交技术探究梨基因功能的互作机制提供技术支撑。本研究以沙梨主栽品种‘圆黄’梨的叶片和果肉为材料,采用Trizol法提取其RNA,利用SMART技术经LD-PCR合成全长cDNA,通过同源重组法与pGADT7载体连接,再电转化至大肠杆菌菌株。经检测,构建的cDNA文库滴度为1.76×108 cfu/mL,文库片段插入阳性率为100%,片段长度主要分布在600~1500 bp。该研究结果表明,构建的cDNA文库质量较高,完整性较好,能为后续利用酵母双杂交技术鉴定基因的互作蛋白奠定基础。     

MDCC-MSB1细胞酵母双杂交cDNA表达文库的构建与鉴定

提取生长状态良好的MDCC-MSB1细胞的mRNA,以5'端标记有生物素的Oligo dT primer为引物反转录,合成双链后连接Adapter。分级纯化后,通过BP重组反应构建入门文库,滴度为1×10⁵ CFU/mL,文库总容量为1.1×10⁶ CFU,平均插入片段长度为1190 bp,阳性重组率为100%。入门文库扩增后提取质粒,通过LR重组反应转化为表达文库,平均滴度为1×10⁵ CFU/mL,文库总容量为1.2×10⁶ CFU,平均插入片段长度为1087 bp,重组率为100%。构建的表达文库具有较高的质量,为研究鸡传染性贫血病毒的受体及其细胞嗜性奠定了基础。     

南山牧场乳牛瑟氏泰勒虫病的防治报告

南山牧场乳犊牛的奇生虫病主要是蜱及蜱传梨形虫病，严重威胁着牧场养牛业的发展．历年来，我场奶犊牛因该病引起死亡达15％以上，尤其是疫区权力评中队的犊牛年平均发病率为45．2％，患病死亡率达98．6％．1993年始，我们与北京农业大学专家一道，对该病的发生和诊断进行了试验，现报告如下．1流行病学调查传播梨形虫病的中间宿主一蜱，主要是血蜱属的三宿主蜱—长角血蜱，它的成虫、若虫、幼虫都寄生于中体，成虫在2月份开始增多，4～7月份为高峰．若虫在2月份出现，高峰期3～6月，幼虫在4月份出现，高峰期8～10月．奶犊牛发病始于每年5月…     

牛源犬新孢子虫酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

旨在构建酵母双杂交牛源犬新孢子虫cDNA表达文库,进而为研究新孢子虫功能结构以及为其入侵宿主致病机理研究提供良好的试验体系。体外培养牛源犬新孢子虫延边株,纯化并提取虫体总RNA,应用SMART技术合成双链cDNA(ds cDNA)。利用CHROMA SPINT+TE-400Columns纯化柱纯化ds cDNA,并与线性化的p GADT7-Rec共转化酵母菌菌株Y187,以同源重组的方式在酵母细胞内构建牛源犬新孢子虫酵母双杂交cDNA表达文库。结果显示,文库容量为5.78×108cfu/m L,随机挑取23个单克隆进行菌落PCR检测,插入的双链c DNA片段大小为400~4 000 bp,平均长度在2 000 bp左右,文库重组率为100%,此文库可用于酵母双杂交筛选。试验为筛选新孢子虫与宿主之间相互作用蛋白研究奠定了基础。     

瑟氏泰勒虫裂殖子侵入红细胞实验系统的研究

瑟氏泰勒虫裂殖子侵入红细胞实验系统的研究顾有方摘译卞正勤校本研究检测了在体外瑟氏泰勒虫裂殖子侵入红细胞内的适宜条件，同时也检测了有蛋白酶抑制因子时裂殖子侵入红细胞内的情况，以研究酶对瑟氏泰勒虫裂殖子入侵的影响。其方法如下：在一头４月龄摘除脾脏的荷斯坦...     

奶牛瑟氏泰勒虫病诊断和综合防制的研究

从青岛市崂山区中韩镇的奶牛分离获得瑟氏泰勒虫中韩珠，进而建立了诊断奶牛瑟氏泰勒虫病的间接免疫荧光试验；对青岛地区奶牛瑟氏泰勒虫病进行了流行病学调查、综述防制试点及推广工作，取得了显著效果。     

牦牛外周血单个核细胞抑制消减cDNA文库的构建及部分差异表达分子的克隆分析

为筛选牦牛外周血单核细胞(PBMC)差异性基因,以刀豆素A(ConA)和脂多糖(LPS)联合刺激的PBMC cDNA为实验组,未经诱导刺激的PBMC cDNA为驱动组,利用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了丝裂原诱导刺激PBMC的消减文库并对其部分阳性克隆进行了EST序列分析.从消减文库中随机挑取16个阳性克隆,进行PCR鉴定,显示克隆的重组率大于93%,插入片段大小大部分集中在200 bp～1 000 bp之间.随机挑取100个克隆进行测序及同源性分析,初步获得27条差异表达基因片段,其中24个为已知基因,3个为新ESTs序列;随机选择非重复的6个差异表达的序列设计引物,以半定量PCR方法验证其消减效率.结果显示,均从构建的消减文库中扩增到目的片段,其中5个为诱导性差异表达分子,1个为诱导特异性表达分子,说明该文库有较高的质量.本研究应用抑制消减杂交技术构建了牦牛PBMC的差异表达cDNA文库,并高通量克隆鉴定了相关功能基因片段,表明该技术手段有助于快速发现牦牛新功能基因.     

关岭自治县关岭牛瑟氏泰勒虫的分子生物学检测及不同季节感染率统计

为了掌握关岭牛瑟氏泰勒虫的感染情况,为有效防治提供科学依据,试验参考NCBI数据库中的瑟氏泰勒虫MPSP基因序列(登录号:MF996372.1)设计引物,应用PCR方法对采自关岭自治县12个乡镇规模化养牛场的262份关岭牛血液样品进行检测,并对扩增片段进行测序和序列分析。结果:(1)以顶云街道办同富养殖场3号样品为模板的扩增片段(GLT)为485 bp。基于MPSP基因构建的种系进化树分析表明,GLT与瑟氏泰勒虫中国参考株MF996372、MG664538聚为1支,与其他参考株在不同分支上,可判定GLT为瑟氏泰勒虫特异性基因片段。(2)统计分析结果表明:关岭自治县关岭牛瑟氏泰勒虫夏季感染率为5.10%,冬季感染率为0.95%,夏季感染率明显高于冬季节。     

猪小肠上皮细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为了更系统的研究病毒在猪肠道内侵入及致病的分子机制,本试验以猪小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC)为模型,应用RNeasy Min Kit从猪IEC中提取细胞总RNA,反转录后,利用SMART技术合成双链cDNA(ds-cDNA),通过同源重组的方法构建猪IEC酵母双杂交cDNA文库。结果显示,文库的滴度为8.4×10⁸ CFU/mL,插入的ds-cDNA片段大小为0.5~2.0 kb,平均长度约为1.1 kb,文库重组率为100%。此文库为筛选与猪腹泻病毒相互作用的宿主蛋白及进一步阐明病毒的致病机制奠定了基础,为研制有效的药物或疫苗提供了依据。     

猪外周血单个核细胞cDNA酵母表达文库的构建及与猪瘟病毒E2蛋白相互作用细胞蛋白的筛选

为研究猪瘟病-毒(CSFV)蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用,本研究通过SMART技术合成猪外周血单个核细胞(PBMC)双链cDNA,以携带与载体pGADT7-Rec重组位点同源序列的特异引物经long-distance PCR扩增双链cDNA.纯化双链cDNA并与载体pGADT7-Rec共转化酵母菌株Y187,经同源重组构建PBMC cDNA酵母表达文库.以CSFV E2蛋白为诱饵进行酵母双杂交筛选,得到阳性克隆根据序列比对分析结果,进一步进行共转化验证.结果显示筛选到17个与CSFV E2蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,基因注释(GO)分析表明这些蛋白分别参与免疫、代谢、细胞生长与增殖、生物调节等过程,为研究它们与CSFV E2的相互作用奠定了基础.     

奶牛附红细胞体和瑟氏泰勒虫混合感染的诊疗

附红细胞体病（Eperythmzoonosis）是由专性血液寄生物附红细胞体（Eperythrozoon）引起的一种人畜共患的血液传染病。寄生于人、动物红细胞表面、血浆及骨髓内，主要临床症状为贫血、黄疸、发热等。瑟氏泰勒虫病是由长角血蜱传播的牛血液原虫病。临床上表现为体温升高，精神不振，食欲减退，贫血和体表淋巴结肿胀等。该病呈世界性分布，多发生于东亚地区，疫区内的发病率和致死率均较高，给畜牧业带来了巨大的经济损失。本文通过血涂片镜检及姬姆萨氏染色等方法，确诊一例奶牛附红细胞体和瑟氏泰勒虫混合感染病例，运用土霉素、贝尼尔等药物对该病进行治疗，收到较理想的效果，可为临床防治该病提供参考依据。