环介导等温扩增技术检测克氏螯虾样品中的副溶血性弧菌

建立了环介导等温扩增技术检测副溶血性弧菌的方法。以副溶血性弧菌tlh基因作为靶基因,设计特异性引物,建立了环介导等温扩增(LAMP)检测方法,并分别采用LAMP检测方法和国家标准方法(GB/T4789.7-2008)对克氏螯虾样品中的副溶血性弧菌进行检测。结果表明,建立的LAMP方法最低检出限为1×101 cfu/mL;对6种细菌共8株菌进行LAMP法扩增,仅3株副溶血性弧菌得到阳性扩增。建立的LAMP检测方法与国家标准检测方法检测结果一致,准确度高。     

PMA在副溶血性弧菌检测中的应用

在我国,副溶血性弧菌被认为是海产品衍生疾病的主要因素,因此急需一种能快速、灵敏、特异、准确地检测食品中副溶血性弧菌的方法。传统培养法一直是检测的金标准,但是其检测周期较长;分子生物学方法如聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR(qPCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)已被广泛用于食品中副溶血性弧菌的检测,但是这些方法不能区分死菌和活菌的DNA,容易造成假阳性。而叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,简称PMA)等核酸染料的使用可以有效地消除这一弊端。研究者们将PMA处理与PCR(qPCR)结合,应用于食品中多种食源性致病菌活菌的检测,但是关于PMA在副溶血性弧菌检测中应用的报道并不多见。因此,拟对PMA应用于食品中副溶血性弧菌检测的可行性进行分析,以便为进一步开展相关研究提供参考。     

牛溶血性曼氏杆菌可视化LAMP检测方法的建立

为建立一种能够快速、高效检测牛溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)的可视化LAMP检测法,利用LAMP引物设计软件,以溶血性曼氏杆菌保守基因lktC序列设计内引物、外引物及环引物,对其反应温度、Mg²⁺浓度、dNTPs浓度等条件进行优化,并检测了方法的敏感性、特异性及实用性。结果显示,该方法在68.2℃、6 mmol/L Mg²⁺、1.6 mmol/L dNTPs条件下达到最佳,40 min内完成检测并可通过肉眼判定结果,对细菌的最低检测限为6.7×10^-1 cfu/μL,对lktC重组质粒的最低检测限为7.9×10² copies/μL,敏感性高;与15种病原均不发生交叉反应,特异性好;对背景清晰小鼠肺组织样本检测结果显示该方法实用性良好,且优于普通PCR方法。表明该方法可快速、高效检测牛溶血性曼氏杆菌。     

副溶血性弧菌ELISA快速检测试剂盒的研制

副溶血性弧菌间接ELISA检测试剂盒的主要组成部件,应用试验结果表明该试剂盒检测低限达104 cfu/g,具有良好的稳定性和特异性;检测时间为8 h,大大缩短了检测时间,提高了检测效率,该试剂盒具有一定的实际应用价值.     

副溶血性弧菌保藏条件研究

针对副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)在低温条件下容易进入不可培养状态,难以保藏的问题,通过平板菌落计数法对副溶血性弧菌的4℃冰箱保藏条件进行了探讨。结果表明,NaCl对副溶血性弧菌4℃保藏有保护作用,其中以45 g/L NaCl保护效果最佳,而且45 g/L NaCl不影响副溶血性弧菌的生长。将副溶血性弧菌细胞浸于45 g/L NaCl溶液或以含45 g/L NaCl的培养基培养后直接于4℃保藏,保藏90 d,活细胞数仅由109下降到106。     

鲨鱼弧菌LAMP检测方法的建立

采用环介导等温扩增技术(LAMP)成功构建了一种鲨鱼弧菌的检测方法。根据鲨鱼弧菌的rpoA基因序列设计4条引物(内引物F3和B3,外引物FIP和BIP),并对LAMP扩增反应的各物质浓度和反应条件进行优化,确定最佳反应温度为65°C,最佳反应时间为55 min。该法对鲨鱼弧菌纯菌培养物的检测浓度约为2.4×102CFU/mL,结果比PCR法具有相似或更高的灵敏度,而且操作简单,反应后体系变浑浊,肉眼可辨;加入SRYB Gold荧光染料,阳性反应为绿色,阴性对照为浅橘色,更便于观察,有望发展成为快速检测鲨鱼弧菌的一种有效方法。     

实时定量PCR法快速检测水产品中的副溶血性弧菌

副溶血性弧菌是一种广泛存在于水产品中的食源性致病菌,可污染食物,引起严重的食物中毒。利用实时定量PCR方法建立一种快速检测水产品中副溶血性弧菌的方法,根据随机扩增多态性分析(RAPD)鉴定特异性片段,设计特异性引物。采用建立的实时定量PCR方法检测市售水产品20份,检出阳性食品6份,最小检测灵敏度为50 fg DNA,与传统微生物检测结果相比无显著差异。该检测方法特异性强,灵敏度高。     

副溶血性弧菌的检测研究

[目的]对toxR进行副溶血性弧菌特异性检测,探讨toxR靶基因能否准确检测副溶血性弧菌,从而消除其他研究者对该基因特异性的疑虑。[方法]采用SN/T1870—2016中副溶血性弧菌toxR的引物探针对副溶血性弧菌和其亲缘关系接近的弧菌标准菌株进行检测。[结果]采用实时荧光PCR方法证实该引物探针只能扩增出副溶血性弧菌,其他弧菌诸如溶藻弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌等未得到扩增。[结论]证实SN/T1870—2016中toxR的引物探针特异性高。该研究可为各检测机构提供数据支持,为副溶血性弧菌的检测与研究奠定更为坚实的基础。     

可视化LAMP快速检测猪伪狂犬病毒

为快速检测猪伪狂犬病毒(PRV),利用PRV DBP基因上的一段序列设计并合成3对LAMP引物,采用一种新的荧光染料——罗丹明B衍生物作指示剂,该指示剂在反应前加到反应缓冲液里,通过优化反应条件,建立了可视化LAMP快速检测PRV的方法。结果表明,63℃下恒温反应40min可得到肉眼可视结果,颜色变成蓝色判定为阳性,仍然保持紫色判定为阴性,可视化LAMP结果与电泳结果一致。建立的可视化LAMP方法可以快速、直观、准确地检测PRV。     

副溶血性弧菌分子检测与分型研究进展

副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐菌,常通过食用被该菌污染的食品导致食物中毒。该文综述了副溶血性弧菌的分子检测技术如PCR、环介导等温扩增、免疫捕获等,及分型技术如RAPD-PCR、ERIC-PCR、PFGE、核糖体分型、RFLP等,这些方法将为副溶血性弧菌食物中毒提供重要的检测与分型手段,对预防与控制副溶血性弧菌食物中毒具有重要意义。     

林麝源化脓隐秘杆菌LAMP快速检测方法的建立

根据GenBank已公布的化脓隐秘杆菌溶血素((Pyolysin,PLO)基因设计6条引物,建立一种灵敏的环介导等温扩增方法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)用于化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes)的快速检测,并对检测方法的特异性和灵敏度进行验证。对化脓隐秘杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、非O1霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单孢菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌等9株实验菌株进行的特异性试验表明,建立的LAMP方法仅对化脓隐秘杆菌的检测结果为阳性;该方法的检测灵敏度在DNA水平上可达112 fg。采用本研究建立的方法检测20份林麝临床病例样品,共鉴定出10株化脓隐秘杆菌,与API Coryne生化鉴定方法的符合率为100%。     

利用PCR技术快速检测水产品中副溶血性弧菌

[目的]对副溶血性弧菌的检测进行研究。[方法]采用聚合酶链式反应（PCR）,以标准菌株（单增李斯特菌、哈氏弧菌）作为阴性对照对3株副溶血性弧菌进行特异性扩增,扩增引物采用副溶血性弧菌如基因中的tlh-3和tlh-4,同时利用PCR对人工污染的白对虾中的副溶血性弧菌进行检出限测定。[结果]结果表明,通过PER扩增,副溶血性弧菌在约449bp处扩增出特异性条带,单增李斯特菌、哈氏弧菌均未出现任何条带,扩增片段表现出极好的特异性。菌液稀释到3．3×10^2cfu／ml时,将其污染到白对虾中作PCR仍可扩增出目的片断。[结论]该研究表明PER检测方法快捷、特异性好、敏感性高,可以作为副溶血性弧菌辅助检测方法。     

乙型脑炎病毒可视化快速检测方法的建立

利用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了简便、可靠的快速检测乙型脑炎病毒JEV(Japanese encephalitis virus)的可视化方法。根据Gen Bank数据库中JEV Henan-09-03毒株(Gen Bank ID:GQ336809.1) E蛋白序列,设计了3对特异性LAMP引物,建立Bst DNA Polymerase等温扩增体系,优化后的反应体系可高灵敏性、特异性检测JEV。本方法通过在扩增产物中加入SYBR Green I染料后用石蜡进行封闭,在可见光下根据反应液荧光的颜色深浅来判断JEV扩增阳性强弱。结果显示,该方法的灵敏度可达5copies·m L-1,且与其他病毒,如乙型肝炎病毒HBV(Hepatitis B virus,HBV)无交叉反应。     

环介导等温扩增技术在水产病害检测中的研究与应用

病害的早期诊断是水产动物病害防治中的重要环节,传统的早期诊断主要通过生化反应和血清学试验来实现,该方法耗时久,要求操作人员具备一定的专业素质。随着分子生物学技术的快速发展,一种高效、简便且特异性强的核酸扩增技术——环介导等温扩增技术(LAMP)应运而生,LAMP是基于聚合酶链式反应和探针核酸检测技术的分子检测手段,可以检测动植物体内的病原菌、病毒、寄生虫和真菌等病原生物,在水产动物病原生物检测中应用广泛,如虹彩病毒(Iridovirus)、疱疹病毒(Herpesvirus)、爱德华氏菌属Edwardsiella、弧菌属Vibrio、黏孢子虫属Myxosporea、华支睾吸虫Clonorchis sinensis等。近年来该技术被不断改进,并被广泛应用于水产养殖动物的病害检测中,具有较广阔的发展前景。     

复合探针实时荧光PCR技术快速检测海产品中 副溶血性弧菌方法的建立

副溶血性弧菌是一种食源性致病菌,海产品和其制品海鲜酱油等最容易被副溶血性弧菌污染,而副溶血性弧菌寄生于鲜虾、海鲜酱油等复杂的食品基质中有时却很难被检测出。以快速检测食品中的副溶血性弧菌为目的,针对副溶血性弧菌的tlh基因,设计引物和复合探针,采用实时荧光PCR方法检测鲜虾和海鲜酱油中的副溶血性弧菌,得出以下结论,该方法检测副溶血性弧菌具有较强的特异性和灵敏度,当鲜虾(固体)中的样品菌含量为10~3cfu·g~(-1)或海鲜酱油中的样品菌含量为10~3cfu·m L~(-1)时,无需增菌培养,即可快速检出。增菌6~8 h即可检出鲜虾(固体)或海鲜酱油(液体)的1cfu的副溶血性弧菌。     

副溶血性弧菌活的非可培养状态及其复苏菌株特性的分析

将副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus BJ1.1997和Vibrio parahaemolyticus BJ1.1616分别于低温(4℃)寡营养(人工海水、陈海水)条件和低温(4℃)富营养条件(TSB-3%NaCl)下进行诱导实验。结果显示,两菌株皆可进入活的非可培养状态(Viable but Non-Culturablestate,VBNC),且进入VBNC状态的菌株对小白鼠无致病性。运用升温复苏等多种方法对已经进入VBNC状态的副溶血性弧菌进行复苏,并对复苏菌株的生长曲线、生理生化指标和毒力基因进行测定。结果表明,部分菌株复苏成功,复苏后菌株的生理生化指标和毒力基因与标准菌株基本相同,但V.pA7F(Vibrio parahaemolyticus BJ1.1997复苏菌株)的生长活性有所下降,并且其trh毒力基因和脲酶反应均为阴性。以上结论皆为研究副溶血性弧菌VBNC和食品安全控制提供理论依据。     

EMA结合PCR技术有效鉴别副溶血弧菌死活细胞

将EMA(Ethidium monoazide)选择渗透性和PCR技术相结合,建立检验副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus死活细胞的EMA-PCR新方法.研究表明,25μg/mL或更高质量浓度的EMA可以抑制2.0×107 CFU/mL的副溶血弧菌死细胞DNA的扩增,未经EMA处理的对应样品PCR反...     

副溶血性弧菌7种保藏方法比较

采用7种不同方法对副溶血性弧菌的保藏效果进行研究,以菌种的保藏时间、存活率、生物学特性及毒力指标比较保藏效果.结果表明:保藏时间由长到短依次为:冷冻真空干燥保藏法＞-20℃脱脂牛奶保藏法＞室温液体石蜡保藏法＞4℃液体石蜡保藏法＞-20℃甘油保藏法＞室温斜面保藏法＞4℃斜面保藏法.7种方法保藏前后,副溶血性弧菌革兰氏染色,氧化酶,0 NaCl、4％ NaCl及10％ NaCl盐度生长试验,TCBS培养基上生长性状及溶血性试验等基本生物学特性均无影响.冷冻真空干燥法毒力稳定,其他保藏方法超过12个月后毒力出现不同程度的下降.采用室温斜面法保藏2个月,菌种生物学特性和毒力均稳定,操作最简便,适宜短期保藏;采用冷冻真空干燥法保藏24个月以上,或采用-20℃脱脂牛奶法保藏20个月,菌种生物学特性均稳定,这2种方法适宜长期保藏.