海南菜豆上粉虱传双生病毒的分子检测

为了解粉虱传双生病毒在海南的发生情况,从海南儋州采集了3个菜豆病样,症状表现为花叶、皱缩、叶背部叶脉突起,根据粉虱传双生病毒基因组DNA基因间隔区及外壳蛋白基因保守序列设计的简并引物,对这3个样品进行了PCR检测,从其中两个样品中扩增到预期大小为522 bp的DNA片段。PCR产物经克隆后进行序列测定,BLAST分析结果表明,该序列与与印度绿豆黄花叶病毒豇豆分离物(GenBank登录号:AF481865)的同源性最高,为65.9%,说明海南菜豆中存在着粉虱传双生病毒的侵染。     

侵染浙江丽水亚洲百合的Potyvirus病毒分子鉴定

从浙江丽水的亚洲百合病叶中得到两病毒分离物G和X,电镜观察病组织汁液中含有大量线状病毒粒子,病叶细胞质中存在着柱状内含体.按照Potyvirus成员和百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)的已知基因序列设计特异性引物,经RT-PCR扩增分别得到1692 nt和1469 nt两个片段,包含NIb、CP和3'-URT,3'-端含poly(A).将CP基因序列与侵染百合和郁金香的10个Potyvirus分离物进行同源性比较,结果表明G、X与LMoV的同源性分别为85.9%～99.4%、86.1%～99.2%(核苷酸)和87.0%～96.7%、89.9%～97.8%(氨基酸),两分离物均为LMoV.系统进化树分析显示G和X分别处在LMoV的两个群体中,同源性较低,不表现地域相关性及寄主相关性.     

猪乙脑病毒河南分离株CSF.ZMD-3的分离鉴定及分子进化分析

采集河南省规模化猪场流产母猪死胎脑脊液作为样本,通过细胞盲传培养分离乙型脑炎病毒流行毒株,对新分离的病毒进行分子生物学鉴定,获得1株分离株并命名为CSF.ZMD-3。DNA序列测定及比对分析该分离株与已报道毒株基因的序列同源性,确定该分离毒株为乙脑病毒。使用MEGA3.1软件对CSF.ZMD-3毒株主要结构蛋白E蛋白的基因序列进行分子进化分析,确定CSF.ZMD-3为基因Ⅲ型乙脑病毒。     

香料烟粉虱传双生病毒的分子检测

发生在保山香料烟生产区粉虱传双生病毒病,已严重影响到了香料烟的品质和产量。本研究利用PCR技术快速检测香料烟植株及田间其它植物如胜红蓟、赛葵及菜豆等、以及病毒介体的带毒情况。对部分样品的PCR检测及序列分析表明,感染香料烟双生病毒有中国番茄黄曲叶病毒、番茄黄曲叶病毒、云南烟草曲茎病毒、烟草曲茎病毒以及云南烟草曲叶病毒等,且一些样品存在复合侵染现象。本研究为掌握病害发生流行的基本规律,监控病害在香料烟上的发生流行提供了依据。     

侵染云南烟草的粉虱传双生病毒卫星分子基因组结构特征

对侵染云南烟草的粉虱传双生病毒致病性相关分子DNA β进行PCR扩增和克隆.对9份采自不同时间和地区的样品中的DNA β分子的全基因组序列分析发现,9个DNA β都具有典型双生病毒DNA β卫星分子的基因组结构特征:在互补链上编码1个大小约为118个氨基酸的βC1蛋白,含有1个卫星分子保守区(Satellite conserved region,SCR)和1个A富含区.核苷酸同源性分析显示,9个分离物的DNA β分子中,7个分离物的DNA β属于TYLCCNV伴随的DNA β分子,1个属于MYVYNV伴随的DNA β分子,2个属于TYLCTHV伴随的DNA β分子,1个属于TbCSV伴随的DNA β分子.系统进化分析发现,这些DNA β卫星分子具有明显的种类和地理分布差异,但没有因寄主和采集时间的不同而表现出明显的差异.     

马铃薯X病毒的分子鉴定与检测技术

为建立快速、灵敏、特异的马铃薯X病毒(PVX)分子鉴定与检测技术,利用反转录—聚合酶链式反应(RT—PCR)技术扩增得到了PVXcp基因,并进行序列测定,同时采用RT—PCR方法和核酸斑点杂交(NASH)方法对PVX进行了分子检测。结果表明:利用PVXcp基因序列及蛋白氨基酸序列分析可准确鉴定PVX,并可分析各分离物间的分子差异。利用PVX特异性引物和DIG标记的PVXcp基因采用RT-PCR技术和NASH技术可对PVX进行准确的检测,其特异性及灵敏度均优于传统方法。     

保定地区一种新辣椒病毒病的鉴定

从保定东郊温室大棚中典型花叶症状的甜椒病株上得到1个病毒分离物(BD),经枯斑三生烟分离纯化3次后,并保存在茄门甜椒上。通过酶联免疫方法、鉴别寄主反应、电镜观察测定等,确定保定分离物是辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)。用Trizol提取病叶总RNA,反转录为cDNA,通过2对特异性引物,分别扩增出病毒外壳蛋白基因片段和与病毒复制相关蛋白基因片段。保定分离物的病毒外壳蛋白基因,与5个PMMoV分离物核甘酸同源性为94.5%~100%,而与3个TMV分离物核苷酸同源性为65.4%~67.7%,从而进一步验证了保定分离物为PMMoV。     

一例鸡传染性法氏囊病病毒的分子鉴定

发现一例疑似鸡传染性法氏囊病,利用SPF鸡蛋将传染性法氏囊病料进行病毒增殖,使用PCR技术扩增出IBDV的结构蛋白vp3基因。测序分析结果表明,IBDV vp3长为831 bp,推导其编码277个氨基酸;其与超强毒株日本OKYM和超强毒株香港HK46同源性较高,在核苷酸水平上为98.9%与97.5%,在氨基酸水平上为96.9%和96.2%;对该IBDV进行遗传进化树分析,结果显示,与超强毒株日本OKYM和超强毒株香港HK46位于同一进化分支。因此,从分子水平说明该病毒属于IBDV。     

2008年侵染江苏省番茄的粉虱传双生病毒发生分布

2007年底在江苏省兴化市保护地栽培番茄上发生了一种危害异常严重的病毒病,其病原初步鉴定为粉虱传双生病毒(Whitefly-transmitted geminivirus,WTG),为明确其在江苏省的发生情况及危害程度,2008年作者在省内各地展开调查,共采集病样115份并对其进行了分子鉴定.检测结果表明:2008年该病在南京、苏州、常州、徐州、泰州和盐城等地均有发生,已遍布于苏南、苏中、苏北;与2007年的发生情况相比,呈明显的蔓延态势.对其中17份代表性分离物的部分序列进行了序列测定,序列分析结果显示这些分离物的序列之间有着98.2%～100.0%的同源性,BLAST分析显示其与番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)同源性最高(超过99.0%). 发生情况及危害程度,2008年作者在省内各地展开调查,共采集病样115份并对其进行了分子鉴定.检测结果表明:2008年该病在南京、苏州、常州、徐州、泰州和盐城等地均有发生,已遍布于苏南、苏中、苏北;与2007年的发生情况相比,呈明显的蔓延态势.对其中17份代表性分离物的部分序列进行了序列测定,序列分析结果显示这 分离物的序列之间有着98.2%～100.0%的同源性,BLAST分析显示其与番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf     

水稻叶部一种植物线虫的形态和分子鉴定

【目的】旨在明确河南省开封市祥符区部分水稻长势弱,叶尖表现灰白干枯、扭曲干尖等症状的病因,为进一步研究水稻上该病害的发生危害规律和防治提供科学依据。【方法】通过改良贝尔曼漏斗法和直接浸泡法分离采集水稻地上部的线虫,挑取单条雌虫在胡萝卜愈伤组织上进行单雌扩繁,采用形态学和分子生物学相结合的方法对纯化培养的水稻线虫KF-1群体进行了种类鉴定。【结果】形态学结果表明待鉴定线虫与水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi Christie, 1942)的形态特征较一致。rDNA的ITS和28S rRNA基因中D2-D3区序列比对结果表明,待鉴定线虫与GenBank中水稻干尖线虫序列具有高度相似性,最高分别达到100%和98.98%。基于rDNA-ITS和28S D2-D3区序列构建的系统进化树结果与已知鉴定结果相一致,待鉴定线虫与其他水稻干尖种群位于同一高度支持的分支。【结论】通过形态和分子鉴定,确定了造成河南开封市祥符区部分水稻叶尖干枯的病原为水稻干尖线虫,这是河南东部地区首次发现该线虫的发生危害,应采取相应措施避免该线虫病害的进一步扩散蔓延。     

猪流行性乙型脑炎病毒种猪精液分离株的鉴定及进化分析

利用RT-PCR技术对河南省某规模化猪场乙脑疑似病例的种猪精液进行分析,从部分样本中扩增出与流行性乙型脑炎病毒(JEV)M基因和E基因具有高度同源性的预期产物.在3日龄乳鼠脑内接种种猪精液上清,10 d左右即出现典型神经症状,并且病死鼠脑组织RT-PCR结果均为阳性.用病死鼠脑组织研磨上清接种BHK-21细胞,感染60...     

江苏省蚕豆上菜豆黄花叶病毒的分子鉴定

为掌握江苏省豆类作物上的病毒病种类,本研究于2018年对江苏省蚕豆作物病毒进行了调查,累计采集田间疑似病样55份,为明确其中伴随的病毒种类,我们对田间采集的疑似病样提取总RNA后进行了分子检测,结果发现,在用菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus,BYMV)检测引物进行RT-PCR扩增时有16份样品扩增到1条525 bp左右的条带,与目的片段大小一致,说明其中可能伴随有菜豆黄花叶病毒的感染。为进一步确定这一结果,我们针对BYMV CP基因设计了引物,以阳性样品RNA为模板进行RT-PCR,结果发现均扩增到预期大小的目的条带,对该片段回收、克隆并测定碱基序列,结果发现其CP基因碱基序列全长819 bp,编码1个由273个氨基酸组成大小约20 800的蛋白质。BLAST分析结果显示其与BYMV同源性最高(AB439731,99%),表明其属于BYMV的一个分离物。利用MEGA软件对其进行系统进化分析,结果发现这些分离物与日本的蚕豆分离物(AB439731)同源性最高,其次是澳大利亚的蚕豆分离物(HG970867)和中国青海的菜豆分离物(9-16)。这些结果表明江苏蚕豆上检测到的病毒是菜豆黄花叶病毒的一个分离物,这是该病毒在江苏侵染蚕豆的首次分子鉴定报道。     

昆明麝香石竹斑驳病毒分离物的鉴定与提纯及高效价抗血清的制备

对引起云南鲜切花麝香石竹植株叶斑驳、花朵变小的病毒分离物应用酶联免疫吸附测定（ELISA）和电子显微镜技术（IEM）检测,直径大约28nm,经TAS-ELISA测定仅与CarMV标准抗体反应为阳性。鉴定为麝香石竹斑驳病毒（Carnation mottle virus ,CarMV）的分离株。对病株检测筛选后进行分离纯化,将提纯后的CarMV制备兔抗血清获得高效价的抗体,间接ELISA测定为1：10240。     

大麦黄矮病毒合肥分离物的鉴定及CP基因进化分析

[目的]为了明确合肥地区大麦黄矮病毒株系种类及分子变异情况。[方法]利用生物学手段和RT-PCR方法鉴定了2009年采自合肥地区的19个分离物,并测定了分离物的外壳蛋白基因（CP基因）的序列。[结果]合肥地区的12个分离物被鉴定为BYDV-PAV,CP基因序列比对发现核苷酸一致性为95.8%～99.7%。系统进化树分析得知,12个合肥分离物序列聚类到一个分支上,它们与中国分离物PAV-CN（AY855920）的CP基因亲缘关系最近。[结论]掌握合肥地区大麦黄矮病毒的株系分布及分子变异情况,对指导该地区小麦黄矮病的抗性育种和防治工作有着非常重要的意义。     

滇重楼辣椒轻斑驳病毒分离物的鉴定及全基因组序列分析

滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis)是多年生草本植物,其药用部位为地下根茎,是一种重要的中药材。为明确侵染滇重楼的病毒病原,对采自云南省曲靖市的滇重楼进行透射电镜观察、DASELISA和RT-PCR技术检测。在透射电镜下观察到杆状病毒粒子,大小为(200～300)nm×(20～36)nm。对采集到的7份病样进行DAS-ELISA检测,结果表明,其中5份病样呈阳性。通过RT-PCR技术扩增、克隆获得1个全长为6 357 bp的曲靖分离物PMMoV-QJ的全基因组序列。将PMMoV-QJ的全基因组序列与国内外已经报道的10个PMMoV分离物进行同源性分析比对,其同源性为99.42%～99.81%。基于全基因序列的系统发育分析表明,PMMoV-QJ与韩国分离物亲缘关系密切。本研究明确了该分离物的亲缘关系,从分子水平鉴定该分离物,为后续滇重楼病毒病的预防提供理论依据。     

富贵竹中杆状DNA病毒湖北分离物的分子鉴定

 【目的】证明湖北发病富贵竹上是否存在杆状DNA病毒属（Badnavirus）病毒,分析来自富贵竹及其它作物Badnavirus病毒不同分离物间的分子差异。【方法】通过分段克隆测序的方法获得湖北富贵竹中 Badnavirus病毒基因组全序列,利用BLAST工具及其它生物学软件进行序列分析。【结果】富贵竹Badnavirus病毒湖北分离物基因组为环状结构,全长7 522 bp;基因组正链包含7个ORFs,推测其编码蛋白的分子量分别为17.58、14.93、214.77、11.86、11.31、16.12和11.00 kD。获得的基因组与福建富贵竹斑驳病毒（Dracaena mottle virus , DrMV）大小仅相差9个核苷酸,两者基因组核苷酸序列一致率为99.7％,ORFs 1～3编码氨基酸序列的一致率分别为99.3%、100%、99.2%,而与其它已报道的14种Badnavirus病毒分离物间的核苷酸全序列一致率为32.0%～44.0%。【结论】叶片表现褪绿斑驳等症状的湖北富贵竹中存在Badnavirus病毒,该病毒与DrMV为同种病毒,已报道的富贵竹中Badnavirus病毒分离物间分子差异非常小,这与已报道的其它作物中Badnavirus病毒不同分离物间存在非常大的分子差异不同。     

山东省辣椒主要病毒种类的分子检测与鉴定

【目的】鉴定山东省辣椒上的主要病毒种类,明确该地区辣椒上的主要病毒病原。【方法】2014—2015年,在山东省临沂、日照、青岛、烟台、潍坊、淄博、济宁、菏泽、聊城、德州共10个市(区)采集253份疑似感病的辣椒植株叶片,提取叶片总RNA和总DNA,利用双生病毒的通用引物(PA/PB)、马铃薯卷叶病毒属通用引物(POL-F/POL-R)及已报道侵染辣椒的主要病毒的检测引物对样品进行PCR、RT-PCR分子检测与鉴定,将扩增得到的目的条带经凝胶回收试剂盒回收纯化后连接到pMD18-T载体上,再送至公司进行克隆测序。分别将所得的PMMoV、PeVYV和BWYV序列在NCBI上利用BLAST进行检索,利用DNAStar软件中的Megalign将所得序列与Gen Bank中已登录的世界各地有代表性的序列进行同源性比对,利用软件MEGA 5.05的Clustal W法进行多序列比对分析以及邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统进化树,系统进化树中各分支置信度(Bootstrap)进行1 000次重复分析。【结果】PMMoV、CMV总检出率分别为61.66%、60.08%;TMGMV、BBWV-2、BWYV、TMV发生也比较普遍,检出率为41.90%、34.78%、33.20%和24.90%;PCV-2、ToMV、TYLCV、PVY、MABYV、PeVYV、PCV-1、ChiVMV、AMV发生侵染现象较少,检出率分别为11.86%、9.88%、9.09%、6.72%、5.53%、3.56%、3.16%、0.79%和0.40%;未检测到Ca CV、PSV、Chi RSV、TSWV和To MMV。通过对病毒复合侵染现象进行分析发现,病毒复合侵染率高达89.92%,其中3种病毒复合侵染现象最多,所占比例达28.63%,4种病毒复合侵染率为25.00%,2种病毒复合侵染率为21.77%,5种病毒复合侵染率为13.31%,一个辣椒样品最多可同时感染6种病毒,侵染率为1.21%;对山东省10个地区的辣椒病毒检测,结果表明在辣椒上检出病毒种类最多的为临沂、济宁,检测到12种病毒,其次是烟台、聊城,检测到11种病毒,潍坊、菏泽检测到9种病毒,青岛、德州检测到8种病毒,日照检测到7种病毒,淄博检测到6种病毒,日照地区辣椒病毒复合侵染率最高,为100%,菏泽地区复合侵染率最低,为69.23%。分别根据PMMoV的部分CP基因序列、PeVYV部分Rd Rp、CP、MP基因序列以及BWYV部分CP、MP基因序列构建系统发育树,结果表明本研究PMMoV山东分离物SD60与中国贵州分离物的亲缘关系最近,PeVYV山东分离物SDRZ31-1与意大利IT83分离物的亲缘关系最近,BWYV山东分离物SD与韩国分离物LS的亲缘关系最近。【结论】在山东省采集的253份辣椒样品可被15种病毒侵染,PMMoV、CMV为主要病毒种类;在山东新检测到的病毒有MABYV、PeVYV、BWYV、PCV-1和PCV-2;明确了山东省主要辣椒产区病毒病发生情况以及病毒种类的主次关系。     

山东寿光黄瓜上瓜类褪绿黄化病毒的分子鉴定

2016年,本研究在对山东黄瓜病毒病调查时发现当地黄瓜上出现一种叶片表现黄化植株伴有轻微矮缩的病害,为明确其中伴随的病毒种类,我们对田间病样进行了采集,提取总RNA后利用瓜类病毒引物进行RT-PCR检测,结果发现在利用瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)引物检测样品时,田间采集的25份疑似病样中13份能扩增到400 bp左右的目的条带。为进一步确认,我们又针对CCYV的外壳蛋白基因(CP)设计了特异性引物,对13份阳性样品进行检测,结果均能扩增到目的片段,对获得的CP基因片段进行克隆并测定序列,序列分析结果显示其CP基因序列全长753 bp,编码1个由250个氨基酸组成的分子量28 700的蛋白质。进一步序列分析结果显示其与CCYV已报道分离物有很高的同源性,并聚类到同一个大的分支,其中与日本分离物、希腊分离物及中国其他地区分离物相对近缘,聚类到一支,而与伊朗分离物近缘关系相对较远。这些结果说明山东黄瓜黄化病样上检测到的病毒为瓜类褪绿黄化病毒,这也是该病毒在山东侵染黄瓜的首次报道。     

进境美国大豆幼苗中菜豆荚斑驳病毒的检测与鉴定

从进口美国大豆中挑选具有典型斑驳症状的种子,在隔离温室内种植.出苗后,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)进行菜豆荚斑驳病毒(bean pod mottle virus,BPMV)的血清学检测.对BPMV血清学反应阳性的幼苗进一步采用反转录(RT)PCR方法和测序方法进行鉴定.结果从大豆幼苗中筛选并鉴定出菜豆荚斑驳病毒.