昆虫热休克蛋白Hsp70的研究进展

热休克蛋白Hsp70诱导性显著,合成量多并具有高度的保守性。Hsp70表达于所有的活体细胞中。Hsp70具有分子伴侣、抗细胞凋亡功能,参与免疫反应、抗氧化功能,可以提高细胞对环境胁迫或伤害的耐受性。文章对Hsp70的特性以及其在昆虫学中的研究意义、研究现状及前景进行了综述。     

酵母双杂交筛选小麦TaMBD2互作蛋白

为探讨小麦甲基结合域蛋白(TaMBD2)在植物生长发育过程中的调控功能,以TaMBD2基因的全长cDNA为模板,构建诱饵载体pGBKT7-TaMBD2,利用酵母双杂交系统从小麦cDNA文库中筛选TaMBD2互作蛋白。结果共筛选到91个菌斑显蓝色的克隆,对其进行菌液PCR检测并测序,然后在NCBI上进行BLAST比对分析,共获得8个可能与TaMBD2互作的蛋白,分别为二磷酸核苷激酶(NDPK)、ENTH结构域蛋白、SIAN蛋白、Agenet结构域蛋白、C2H2型锌指蛋白、磷酸激酶和2个假定蛋白,其中最有可能的TaMBD2互作蛋白为NDPK。这些候选蛋白主要参与细胞信号传导、抗逆、能量代谢和蛋白质运输等。其中,检测结果中参与植物抗逆胁迫的蛋白质为主要互作蛋白,所占比例为54.9%;参与蛋白质运输的互作蛋白所占比例为25.3%,其余互作蛋白所占比例较小。因此,推测TaMBD2可能主要参与植物对干旱、低温和高盐等非生物胁迫逆境的响应及调控。     

小麦TaDREB6转录因子互作蛋白的筛选

 【目的】利用酵母双杂交技术从小麦cDNA文库中筛选TaDREB6互作蛋白,进一步研究DREB介导的小麦抗逆机制。【方法】以小麦的cDNA为模板扩增得到TaDREB6,构建小麦cDNA文库和pGBKT7-TaDREB6诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaDREB6以及pGADT7和cDNA文库混匀转入AH109酵母感受态细胞,在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp营养缺陷型培养基上,30℃培养3—5 d,挑取平板上直径大于2 mm的菌落,进行显蓝筛选。【结果】对筛选到的102个候选阳性克隆进行测序,在NCBI上进行BLAST比对分析,获得与能量代谢、抗逆和防御、转运、转录和翻译、信号转导以及生长发育等相关的候选蛋白。【结论】筛选得到候选蛋白的功能预测表明TaDREB6可能参与了多条信号转导途径,在抗逆境调控中具有重要作用。     

细粒棘球绦虫Hsp70基因的克隆、表达及抗体制备

【目的】克隆细粒棘球绦虫( Echinococcus granulosus , E.g)热休克蛋白家族基因Hsp70,在原核细胞中表达、纯化Hsp70蛋白并制备其特异性抗体。【方法】 从包囊中分离原头蚴,提取RNA,RT-PCR扩增EgHsp70基因的cDNA,将其构建至原核表达载体pMAL-p2x,转化大肠杆菌BL-21菌株。通过改变诱导温度、IPTG浓度和诱导时间筛选出EgHsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件。并用麦芽糖亲和层析法纯化该蛋白。纯化蛋白经皮下多点注射免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA和Western blotting检测血清效价和特异性。【结果】 RT-PCR扩增获得EgHsp70基因的cDNA,酶切和测序结果表明EgHsp70基因已克隆入pMAL-p2x。表达条件优化实验结果筛选出Hsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件为：当A600为0.6时,以0.3 mmol•L-1 IPTG于30℃条件下诱导表达4 h。SDS-PAGE显示Hsp70融合蛋白相对分子质量约为68.6kD,经麦芽糖亲和层析法纯化获得了Hsp70融合蛋白,其表达量为2.5 mg•L-1。Western blotting 检测证明制备的抗血清与EgHsp70融合蛋白、原头蚴粗提抗原、E.granulosis虫体蛋白和E.granulosis虫体表面蛋白均能特异性结合,ELISA检测表明获得的抗血清效价达到 1﹕256 000。【结论】在大肠杆菌中表达并纯化获得了EgHsp70融合蛋白,并制备了高效价的兔抗EgHsp70蛋白抗血清,为研制包虫病疫苗及相关诊断试剂奠定了基础。     

小麦蛋白激酶TaMAPK2互作蛋白的筛选与验证

【目的】利用构建的干旱胁迫处理的小麦cDNA文库,通过酵母双杂系统筛选与小麦TaMAPK2互作的蛋白,并对其进行验证分析。【方法】以小麦cDNA为模板克隆得到TaMAPK2,构建pGBKT7-TaMAPK2诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaMAPK2质粒以及pGADT7和小麦cDNA文库共转化酵母AH109菌株感受态细胞,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade营养缺陷型培养基上30℃培养3-5 d,挑选单克隆于YPDA培养基中培养,吸取1 μL各候选克隆的菌液点至于SD/Raf/Gal/x-gal平板上培养,筛选蓝色单克隆。将筛出的单克隆经测序、序列比对分析,初步获得与TaMAPK2互作的候选蛋白。采用双酶切的方法构建pGADT7-HSP90以及pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90双分子荧光互补表达载体,将重组载体质粒pGADT7-HSP90和pGBKT7-TaMAPK2共转化AH109酵母感受态细胞,利用酵母双杂交的方法验证TaMAPK2与候选蛋白HSP90的相互作用;采用PEG-Ca2+介导法将双分子荧光互补表达载体pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90共转化小麦原生质体细胞,激光共聚焦显微镜下观察相互作用产生的YFP荧光信号。根据HSP90的保守序列设计特异引物,在SYBR Green Ⅰ的检测模式基础上,构建HSP90的实时荧光定量PCR检测体系,检测HSP90在不同胁迫处理以及不同组织的小麦植株中的表达量。【结果】通过对候选蛋白的初步分析表明这些候选蛋白主要参与植物体的信号转导或免疫过程,表明TaMAPK2在植物的逆境信号转导、基因转录调控过程中发挥着重要作用。通过酵母双杂交显蓝系统和双分子荧光互补技术（BiFc）进一步确认HSP90与TaMAPK2的互作关系。HSP90定位在细胞核、细胞膜以及细胞质中,且在植物的根茎叶中均有表达,在根中的表达量最高。通过实时荧光定量PCR分析显示,HSP90基因受到高温、低温、高盐和ABA胁迫后表达量上调。【结论】HSP90作为分子伴侣,在降解这些受损或异常蛋白以及调控抗逆相关转录因子表达的过程中发挥着重要的作用。非生物胁迫会引起植物体内一些受损或异常蛋白聚合物的积累,HSP90能通过折叠已损坏的蛋白底物以及构象的维持来保持细胞的完整性。表明在植物逆境信号转导过程中,TaMAPK2功能的发挥可能需要HSP90蛋白的参与。     

拟南芥NBS1互作蛋白的筛选和鉴定

【目的】筛选拟南芥中NBS1的互作蛋白，探究NBS1蛋白的新功能，为后续研究奠定基础。【方法】利用酵母双杂交技术筛选拟南芥c DNA文库，对得到的序列进行BLAST比对、亚细胞定位分析和基因本体注释。【结果】共有221个阳性克隆，测序后通过BLAST比对得到97个与NBS1互作的蛋白，包括膜蛋白、转运蛋白和折叠蛋白等，它们主要定位于细胞质、细胞核和叶绿体等，主要富集于4个分子功能、5个细胞组分和13个生物过程。【结论】拟南芥中与NBS1互作的蛋白在刺激响应、信号转导和细胞代谢等方面发挥着重要作用，也证明NBS1是一种多功能蛋白，但其功能及分子机制还需进一步研究。     

5个品系罗非鱼热休克蛋白Hsp70基因序列比对分析

采用RT-PCR技术,对美国尼罗、埃及尼罗、美国奥利亚、中国奥利亚、奥尼杂交罗非鱼(埃及尼罗♀×美国奥利亚♂)5个品系罗非鱼热休克蛋白Hsp70基因进行扩增并克隆测序,最终获得5个品系罗非鱼Hsp70基因完整编码区(code sequences,CDS)cDNA序列,全长均为1923 bp,编码640个氨基酸,含有Hsp70家族3个签名序列IDLGTTYS、IFDLGGGTFD和VVLVGGSTRIPKIQK,以及C末端保守序列EEVD,核定位信号标签KRKHKKDISQNKRALRR;Dank特征基序DLGTT-S-V;胞质Hsp70特征基序EEVD;靠近C末端的GGMP4肽序列;2个糖基化位点NKSI和NVSA.对5个品系罗非鱼Hsp70基因序列比较分析发现,它们之间共有12个核苷酸位点发生转换,但氨基酸序列完全一致.研究结果为深入研究不同品系罗非鱼的抗逆机理以及指导罗非鱼抗性育种奠定了可行性支撑基础.     

2株微孢子虫热激蛋白Hsp70的ORF研究

为探讨微孢子虫的起源、分类地位及亲缘关系,在系统发育分析的基础上,对家蚕微孢子虫(Nosema.bombycis)和柞蚕微孢子虫(N.antheraeae) Hsp70基因的ORF序列进行克隆、测序,同时将2种微孢子虫的Hsp70基因的ORF序列翻译成氨基酸序列,利用Expasy蛋白质数据库的分析工具和DNAstar软件对其功能进行理论分析和预测.结果表明:家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫的Hsp70氨基酸序列在N端均有一个高度保守的基序GIDLGTT,另外还有被作为线粒体Hsp70标志的2个保守的基序;氨基酸序列相似性比较结果发现,家蚕微孢子虫广东株Hsp70的蛋白氨基酸序列和家蚕微孢子虫日本株的相似性最近,约为96％.系统发育分析发现,微粒子属和变形虫属有较近的亲缘关系.功能预测表明,2种微孢子虫在信号肽剪切位点、跨膜结构域及糖基化位点、二级结构、亲水性、柔韧性等方面均存在异同.     

真菌无毒基因克隆与抗性蛋白互作研究

无毒基因（avirulence genes, Avr）是病原物遗传因子,能诱发寄主植物产生抗病性。真菌Avr基因的克隆、编码产物结构和功能分析,以及与寄主抗性蛋白的互作机制等方面的研究对于深入了解植物的抗真菌病害分子机理具有重要意义。其编码AVR蛋白（又可以称为效应子,effector）通常富含半胱氨酸,效应子通过吸器或侵入丝被分泌到寄主细胞内促发抗性反应。在抗性反应过程中,效应子能直接或间接地被植物细胞相应的抗性蛋白识别,这种识别机制与效应子和抗性蛋白的区段相关。以几个真菌病害为例,综述了近年来有关无毒基因克隆、表达、以及与抗性蛋白的互作机制等方面的主要研究进展,以期为相关研究的深入提供参考。     

用基因型与天气互作选择小麦品种

性能优良的作物品种应该适应气候不同的地区，但基因型与天气互作常常限制着对亚区的适应性。我们的目的在于将成对品种间的基因与天气互作效应定量化，然后在规定的置信范围内鉴定出新品种比老品种增产的亚区。以天气变量与新、老品种间产量差异（Ｄ）的回归来定量基因型与天气互作效应，天气变量来源于冬小麦品种性能试验结果。假设以预测值Ｄ估计某一设想群体在特定地点－年份生能试验中的平均数Ｅ（Ｄ）。如果Ｅ（ＤＳ）９５％的     

利用 GST pull-down 联合质谱技术鉴定H7N9 禽流感病毒 PA-X 的互作蛋白

[目的]为探究H7N9亚型禽流感病毒(AIV)PA-X蛋白的功能,采用GST pull-down联合质谱技术筛选与鉴定与PA-X相互作用的宿主蛋白.[方法]构建PA-X的重组表达载体pGEX-4T-PA-X,转化大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白,并利用GST亲合树脂进行纯化得到GST-PA-X融合蛋白.利用GST pull-down技术,将GST-PA-X和GST对照蛋白分别与A549细胞裂解液总蛋白进行体外孵育,得到的蛋白复合物经SDS-PAGE分离后进行质谱检测分析.[结果]经GST pull-down筛选与质谱分析鉴定后得到39个高可信度的可能与PA-X互作的候选蛋白质.通过GO注释和KEGG等通路富集分析发现,这些蛋白主要参与RNA的代谢及加工、mRNA翻译及运输、多肽生物合成及基因表达的转录后调节等生物学过程.对其中评分最高的蛋白Hsp70-2与PA-X的相互作用作进一步验证,免疫荧光试验结果表明Hsp70-2与PA-X可以在细胞浆中共定位.[结论]利用GST pull-down联合质谱技术筛选到39种与PA-X互作的候选蛋白,且经免疫荧光试验证明候选蛋白Hsp70-2与PA-X存在共定位,为深入探讨PA-X在AIV生命周期中的作用机制奠定基础.     

小麦黄花叶病毒编码VPg蛋白N端结构是VPg与核仁蛋白Fibrillarin互作区域

小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus,WYMV）属于马铃薯Y病毒科大麦黄花叶病毒属成员,其基因组是由两条正义单链RNA组成,共编码10个蛋白。其中,VPg（Viral protein genome\|linked）作为病毒末端结合蛋白,与病毒基因组RNA 5’端共价连接。利用软件分析WYMV VPg蛋白氨基酸序列发现其N端具有核定位信号（NLS）序列,C端具有核输出信号（NES）序列。通过激光共聚焦显微镜观察VPg与GFP融合蛋白在烟草细胞中的表达情况发现,GFP\|VPg主要定位于细胞核中。利用eYFP（n）标记核仁结构蛋白Fibrillarin与VPg进行双分子荧光互补实验发现,VPg与Fibrillarin互作且定位于细胞核中。根据VPg结构特点构建一系列缺失突变体与Fibrillarin的互作实验验证了它们之间的互作区域发生在N端NLS区域。     

小麦蓝矮植原体RNA沉默抑制子互作蛋白的筛选与分析

【目的】揭示小麦蓝矮植原体(WBD phytoplasma)的致病机理及其与寄主的互作关系,为植原体病害防治提供理论依据。【方法】以SWP16为诱饵,将SWP16构建到诱饵载体pBT3-STE和pBT3-SUC上,在小麦酵母双杂交膜系统cDNA文库中筛选与SWP16互作的蛋白,并确定最佳的筛库条件。通过α-半乳糖苷酶活性检测试验对筛选到的互作蛋白进行二次验证,并运用Uniprot对其进行Gene Ontology（GO）注释分析。【结果】以pBT3STE-SWP16作为筛库的诱饵蛋白,确定20 mmol/L 3-AT为筛选文库的最佳浓度,从小麦cDNA文库中筛选到20种互作蛋白,包括Rieske 蛋白、细胞色素b5、CASP蛋白等。经过复筛和α-半乳糖苷酶活性检测试验进一步验证了互作关系,其中14种互作蛋白参与运输、pH调节、光合作用、内质网应激反应、蛋白质泛素化等生理过程;18种互作蛋白存在于线粒体、内质网、细胞膜、细胞质、叶绿体和细胞壁等6种细胞组分中;20种互作蛋白的分子功能主要包括几丁质酶活性、反转运蛋白活性、脱水酶活性、转移酶活性和转录因子活性等。【结论】筛选获得20种与小麦蓝矮植原体效应蛋白SWP16互作的蛋白,有助于推动小麦蓝矮植原体与寄主互作关系的研究。     

瓜实蝇热激蛋白基因hsp70的克隆及序列分析

[目的]克隆分析瓜实蝇热激蛋白hsp70基因序列特征,为进一步研究瓜实蝇的热适应性机制及制定综合防治策略奠定基础.[方法]根据NCBI数据库中已报道的昆虫hsp70基因保守序列,设计合成扩增瓜实蝇hsp70基因部分片段的简并引物,并利用RACE-PCR扩增其全长序列.[结果]克隆获得瓜实蝇hsp70基因cDNA全长序列(获取号:KM112021)2271 bp,含1911 bp的开放阅读框,编码636个氨基酸,具有真核生物hsp70基因家族的3个明显基序标签,同时在C-末端具有EEVD基序,推测其属于胞质型热激蛋白.BLAST分析结果表明该序列与双翅目实蝇科昆虫hsp70基因高度相似,最高相似度达91％.氨基酸序列系统发育分析结果显示,瓜实蝇与双翅目实蝇科昆虫聚类为一个分支,证实hsp70基因的高度保守.[结论]瓜实蝇hsp70基因具有真核生物hsp 70基因家族的特征,序列表现为高度的保守性,可作为今后研究瓜实蝇抗逆性机制的一个参数指标.     

玉米大斑病菌热激蛋白Hsp70的鉴定和结构分析

【目的】对玉米大斑病菌Hsp70(Setosphaeria turcica Hsp70,StHsp70)基因家族进行结构鉴定和功能分析,为进一步阐明StHsp70在玉米大斑病菌生长发育和致病过程中的作用奠定基础。【方法】利用玉米大斑病菌基因组数据库获得StHsp70基因家族成员,利用生物信息学方法进行理化性质、亚细胞定位、系统进化、保守基序和结构域分析,构建三级结构模型,并预测启动子等顺式作用元件。【结果】StHsp70基因家族包括11个成员,分别为StHsp70-1～StHsp70-11,多数定位于细胞质,其次为内质网、线粒体和细胞核。系统进化分析结果表明,StHsp70家族成员可分为7类,其中Class A～F分别与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）热激蛋白SSA、 SSB、 SSC、KAR2、SSE、SSZ高度同源,而Class G在酵母中未发现其同源蛋白。结构预测分析发现,StHsp70家族成员都含有保守基序Motif 5,而Motif 6只存在于Class A～D中,Class G仅含有2～4种基序,与其他StHsp70家族成员存在显著差异。N端的N...     

基于Hsp70基因的马梨形虫分类学定位分析

 【目的】为了进一步确定马泰勒虫的分类学定位。【方法】根据GenBank上登录的马巴贝斯虫Hsp70基因序列（AB248743.1）,设计引物TeHsp70F, TeHsp70R,以马泰勒虫基因组DNA为模板进行扩增,获得全长为1 920 bp的核酸片段。将该基因序列与GenBank中23种已知虫种的相应序列进行分析比较。【结果】该片段编码639个氨基酸,其疏水性氨基酸达到208个,极性氨基酸167个。同一性分析显示,该基因片段与报道的马巴贝斯虫Hsp70基因（B. equi  BAF02625.1）亲缘关系最近,其次是小泰勒虫(T. parva  XP764717.1)和环形泰勒虫(T. annulata AAA30130.1),而与感染马属动物的另一个虫种驽巴贝斯虫(B. caballi BAF02619.1)亲缘关系较远。【结论】马泰勒虫Hsp70基因的克隆及系统发育分析显示,之前被定名为马巴贝斯虫（B. equi）的虫种隶属于泰勒虫虫种。本试验为马巴贝斯虫正确更名为马泰勒虫（T. equi）的分类地位提供了又一佐证。     

小麦根际细菌的互作效应及其对小麦生长的影响

TN05、TP36、TK19是从小麦根际分离的分别具有高效固氮、解磷、解钾功能的细菌。为研究这些菌株之间的相互作用,首先进行单独培养,然后以相等的细胞数目进行两两混合培养。设置6种不同的接菌处理,通过盆栽试验研究单接种和混合接种对小麦生长的影响。结果表明:2种菌株混合培养时,TP36促进了TN05和TK19的生长,TN05和TK19之间存在相互抑制作用;混合接种TP36+TK19,对盆栽小麦促生长的效果最好,与其他处理间的差异达到5%显著水平。