苹果GMP、GME和GGP基因的克隆与表达分析

【目的】克隆苹果GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-mannose pyrophosphorylase,GMP)、GDP-甘露糖-3′,5′-表异构酶(GDP-mannose-3′,5′-epimerase,GME)和GDP-1-半乳糖磷酸酶(GDP-L-galactose-1-phosphate phosphorylase,GGP)的基因序列并分析其表达特性,探讨GMP、GME和GGP基因在抗坏血酸(Ascorbic acid,AsA)合成过程中的作用。【方法】以‘嘎啦’苹果幼果为材料,分别运用RT-PCR和PCR法克隆GMP、GME和GGP基因的cDNA和gDNA全长序列,对其序列及编码产物进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR,分析以上基因在苹果不同组织(幼叶、成熟叶、衰老叶、花、幼果、成熟果和根)中的表达情况。【结果】RT-PCR法克隆及序列分析显示,GMP基因的cDNA全长为1 280bp,编码361个氨基酸,gDNA序列中含有3个内含子;GME基因的cDNA全长为1 323bp,编码376个氨基酸,gDNA序列中含有5个内含子;GGP基因的cDNA全长为1 677bp,编码446个氨基酸,gDNA序列中含有6个内含子。基因表达的实时荧光定量PCR分析表明,GMP、GME和GGP在苹果不同组织中均有表达,在叶片中的表达量高于其他组织,且表达量随着叶片的生长逐渐升高;在花、幼果和成熟果中,GMP、GME和GGP的表达量差异不明显。【结论】克隆获得了苹果的GMP、GME和GGP基因,其在苹果不同组织的生长过程中有不同的表达特性,但GME的表达水平远远低于GMP和GGP,这在一定程度上表明,在苹果AsA的生物合成过程中,GMP、GGP较GME有更重要的作用。     

苹果黑星病菌的分子检测

【目的】建立苹果黑星病菌(Venturia inaequalis(Cooke)Wint)的分子检测方法,以提高检测精确度,缩短检测时间。【方法】根据苹果黑星病菌与其他苹果病原真菌核糖体基因转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS)序列间的差异,设计了1对特异性引物320A/320B,用于苹果黑星病菌的分子检测,对特异性引物扩增条件进行了优化,并验证和检验了引物的特异性和灵敏度。【结果】特异性引物的扩增条带约为320bp,优化的反应体系为:2μL MgCl2(25mmol/L),2.5μL 10×buffer,3μL dNTP(2.5mmol/L),1.2 μL引物320A/320B(10μmol/L),0.5μL聚合酶(5U/μL),1μL模版DNA(30ng/μL),加ddH2O至总体积25μL;反应程序为:94℃3min;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;72℃延伸10min。利用该对特异性引物对包括苹果黑星病菌在内的26个苹果病原菌菌株基因组DNA进行的PCR扩增表明,只有苹果黑星病菌能扩增到1条约320bp的特异性条带,其他菌株及阴性对照的扩增产物均未检测到特异性条带。对接种苹果黑星病菌的苹果组织的检测表明,该对引物能特异性地检测到苹果黑星病菌的存在,其对苹果黑星病菌基因组DNA检测的灵敏度为100fp/μL。【结论】利用设计的特异性引物320A/320B,参考正交试验优化的体系和程序,结合简单的SDS法提取苹果黑星病菌基因组DNA,在1个工作日内即可完成对该病原菌的分子检测。     

苹果Ty1-copia类逆转座子LTR10序列及其在苹果属植物中的遗传多样性分析

应用改良的Pearce方法分离苹果Ty1-copia类逆转座子RNaseH-LTRs,分离到的RNaseH-LTR_(10)序列已在GenBank注册(登录号DQ534515),该序列长度为299 bp。分析结果表明其5′端为含有终止密码子的RNaseH基因,PPT(polypurinetract)之后是3′-LTR,PPT起始于终止密码子内10 bp处,3′-LTR的起始标志末端倒转重复序列(inverted repeat,IR)TG紧随其后。LTR_(10)的正链和反链均含有多个启动子的特征结构TATA box和CAAT box,α-淀粉酶启动子的保守序列及受不同胁迫条件作用的调控元件,如AuxRE、ABRE、HSE等。利用A-SAP技术研究了LTR_(10)逆转座子在苹果属8个野生种和22个栽培品种中的遗传多样性,多态性片段比例为86.5%;品种长祝较祝光少1条约400 bp的特异性扩增条带。     

银杏核糖体DNA内转录间隔序列初步分析

为研究银杏Ginkgo biloba种内核糖体DNA内转录间隔（ITS）区序列的多样性，以具有代表性的10个银杏嫩叶样本为材料，提取基因组DNA后用特异性引物进行PCR扩增，并直接测定其ITS区序列。结果表明，银杏ITS区（内含5．8S）总长度为1224～1226bp，其中ITS-1长度为821—823bp，5．8S长度为162bp，ITS-2长度为241bp。在全序列范围内，可变位点有28个，占总核苷酸的2．3％，但简约信息位点仅6个，变异量仅有0．5％。银杏的不同样本之间ITS区序列表现出高度一致。     

5种七彩神仙鱼5S rDNA序列的比较

采集鳍条,设计引物,提取了5种(黑格尔、盖子红、鸽子红、天子蓝、红点绿)七彩神仙鱼(Symphysodon)的5S r DNA,分析了其序列。结果表明:5种七彩神仙鱼均具有201 bp和401 bp 5S r DNA结构单元,而黑格尔(野生)、盖子红和鸽子红分别具有300,299,338 bp 5S r DNA结构单元。其编码区高度保守,而非转录间隔区差异显著,特别是黑格尔(野生)300 bp、盖子红299 bp和鸽子红338 bp的非转录间隔区。5种七彩神仙鱼G+C碱基的含量很高。红点绿、盖子红、鸽子红和天子蓝4个人工品种与野生品种黑格尔的亲缘关系分别为97.53%、90.12%、88.89%和85.19%,其中红点绿与黑格尔的亲缘关系最近。     

一个新的枳NAC基因cDNA全长的克隆及其亚细胞定位分析

以拟南芥的NAC1 cDNA序列作为模板,对柑橘EST数据库进行同源检索筛选,利用生物信息学方法克隆了柑橘NAC1基因的cDNA序列。以枳(Poncirus trifoliata)花的cDNA为模板,根据以上cDNA序列设计特异性引物,利用5'RACE和3'RACE技术,分别获得了NAC1基因的5'和3'末端,序列拼接后获得枳的NAC1 cDNA全长,命名为Pt-NAC1。Pt-NAC1全长为1351 bp,含有1个1047 bp完整的开放读码框(ORF),5'末端起始密码子ATG起始于25 bp,3'末端非翻译区为280 bp。该cDNA推导编码348个氨基酸,与苹果、拟南芥、杨树中相应序列的同源性分别为64.8%、57.0%、61.3%。生物信息学分析结果表明:Pt-NAC1 cDNA序列中有miRNA164的识别位点,还有高度保守的NAC结构域。构建Pt-NAC1亚细胞定位载体35S-GW-GFP-FJ619349,用基因枪转化洋葱表皮细胞,亚细胞定位结果表明:Pt-NAC1均定位于细胞膜中。     

苹果砧木‘SH6’叶绿体基因组序列特征和比较分析

【目的】为了解析苹果矮化中间砧‘SH6’叶绿体基因组特征及其进化关系。【方法】以苹果矮化中间砧‘SH6’为试材,通过HIFI测序,利用Organelle＿PBA软件进行叶绿体基因组从头组装,分析其叶绿体基因组特征。【结果】结果表明,‘SH6’叶绿体基因组大小为160 069 bp,具有典型的四分结构,包括大单拷贝区域、小单拷贝区域和两个反向重复区域,长度分别为88 184 bp、19 181 bp、26 352 bp和26 352 bp。在‘SH6’叶绿体基因组中,分别注释了蛋白质编码基因、tRNA和rRNA,其数量分别为86、36和8。此外,整合已发表的‘国光’、河南海棠、2个野生苹果和桃(Prunus persica)的叶绿体基因组数据来构建系统发育树,发现苹果中间砧‘SH6’与欧洲森林苹果聚在一枝上。【结论】推测苹果矮化中间砧品种‘SH6’与欧洲森林苹果关系较为密切。     

苹果NADP依赖的苹果酸酶基因克隆、序列和表达分析

【目的】克隆苹果（Malus×domestica B.）中苹果酸代谢的关键酶基因MdNADP-ME,进行序列特征分析,研究MdNADP-ME在苹果中组织表达的情况。【方法】利用RT-PCR技术获得苹果MdNADP-ME1,2,3全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用荧光实时定量PCR技术研究MdNADP-ME1,2,3的组织表达。【结果】测序结果显示,获得的3个NADP-苹果酸酶基因（MdNADP-ME1、MdNADP-ME2 和 MdNADP-ME3; GenBank 登录号为JX971883、JX971884和JX971885）,其ORF分别为1 512、1 782和1 926 bp,推测其分别编码503、593和641个氨基酸的多肽。氨基酸序列和结构分析显示,这3个基因均含有5个保守的氨基酸区域（motif I-V）,含有2个功能结构域：malic和NAD_bind_1_malic_enz。进化树分析结果显示,MdNADP-ME1 和MdNADP-ME2属于双子叶植物细胞质NADP-ME型,MdNADP-ME3属于双子叶植物质体NADP-ME型。荧光实时定量PCR结果表明,MdNADP-ME1-3在被检测的组织中均有表达,但表达差异明显。【结论】MdNADP-ME1-3属于植物NADP-ME家族,结构高度保守,并且在苹果的不同组织中有不同表达模式。     

黄瓜黑星病菌核糖体基因ITS区段的克隆及序列分析

为了探讨枝孢霉属的系统发育情况,采用真菌核糖体基因转录间隔区域(ITS)通用引物,PCR扩增3株来自不同地方的黄瓜黑星病菌核糖体基因的ITS序列,并对PCR产物进行测序和序列分析。结果表明:3株黄瓜黑星病菌之间同源性为100%,ITS全长463bp,其中ITS1长154bp,5.8S rDNA长159bp,ITS2长150bp,各碱基的个数分别为G 119个、C 118个、A 120个、T 106个,GC含量为51.2%。利用MEGA4软件中的NJ法和ME法,对3个样品序列以及GenBank中登陆的枝孢霉属其他25个种构建ITS聚类分析树状图,NJ法和ME法构建的结果基本相同,枝孢霉属可以分为5个聚类组,所测的3个样品和Cladosporium cucumerinum在一个聚类组中。     

苹果HYL1基因在干旱中的表达与功能分析

【目的】分析干旱处理下苹果HYL1基因(MdHYL1)在苹果中的表达情况,并初步分析过量表达MdHYL1转基因苹果根系的生长情况,以了解MdHYL1在干旱中的功能特性。【方法】从金冠苹果中克隆出MdHYL1基因,对其进行干旱下的表达分析、系统进化分析和组织特异性表达分析;利用Gateway技术构建植物过表达载体pGWB414-MdHYL1,通过根癌农杆菌介导法转化苹果无性系GL-3,经卡那霉素筛选,采用PCR和RTqPCR技术鉴定阳性转基因株系,并对转基因株系的根系生长情况进行观测。【结果】MdHYL1包含长1 479bp的完整开放阅读框,编码492个氨基酸,位于chr15染色体上;系统进化树分析表明,苹果MdHYL1与梅PmHYL1、桃PpHYL1蛋白的关系最近;组织特异性表达分析表明,MdHYL1基因在楸子各组织器官中的表达量为叶茎花根果实;干旱处理下MdHYL1基因的表达量显著上调,而转基因植株鉴定结果表明,MdHYL1基因已成功转入苹果植株中,3个过表达MdHYL1转基因株系的根系较未转基因株系(对照)明显增多。【结论】MdHYL1基因能够响应干旱胁迫,且转基因苹果根系更发达,表明其可能在苹果耐旱过程中起重要作用。     

CRISPR-Cas9技术介导蔬菜作物遗传改良研究进展

在植物中,CRISPR-Cas基因组编辑技术是一种改变基因功能并改良作物品种的新技术。与传统育种相比,CRISPR-Cas是一种操作简单、低成本、高效精准的技术,并且脱靶风险较低。蔬菜作物富含膳食纤维、维生素和矿物质,对人类健康至关重要。然而,随着气候环境的变化,生物和非生物胁迫对蔬菜的生产构成严重威胁,影响品质和产量。在综述中,概述了CRISPR技术发展史、CRISPR-Cas工具箱的组成、现有Cas蛋白的变体、CRISPR-Cas元件转化到植物中的方法以及基因编辑系统在蔬菜作物遗传改良应用中的具体案例,最后提出了CRISPR-Cas技术在蔬菜育种中的挑战和应用前景。     

珠眉海棠(Malus zumi Mats)盐应答MzDREBb基因的克隆与功能研究

通过microarray(微列阵芯片)分析,从珠眉海棠盐胁迫cDNA文库中分离得到盐诱导的MzDREBb基因全长cDNA序列,研究苹果属植物DREB转录因子在胁迫中的作用。结果表明:MzDREBb全长1 185 bp,开放阅读框共714 bp,5''-UTR和3''-UTR的长度分别是121和350 bp;MzDREBb编码237个氨基酸,有一个AP2/ERF结构域;系统分类将MzDREBb归入DREB家族的A-5亚组;MzDREBb定位在细胞核中,具有转录激活活性;半定量RT-PCR表明MzDREBb基因受到盐诱导。超表达MzDREBb基因的拟南芥耐盐能力增强。以上结果表明MzDREBb基因在盐胁迫应答中起重要作用。     

茶炭疽菌中CRISPR/Cas9敲除系统构建

【目的】以调控茶树炭疽病菌(Colletotrichum camelliae)中的植物真菌毒素(Solanapyrones)合成的CcSOL4为例，构建CRISPR-Cas9的基因敲除载体系统，为CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术在茶炭疽菌中的应用奠定基础。【方法】通过对转录因子CcSOL4的基因序列分析，选择5个靶点以PCBC载体为模板扩增目的片段，再与表达载体PKSE401发生重组构建基因标记载体。以携带Cas9编码基因的PKSE401双元双靶点载体系统为骨架，以PCBC载体为模板扩增相应的sgRNA,运用Overlapping PCR以及Golden Gate Cloning技术构建针对炭疽病的双靶点和三靶点CRISPR/Cas9编辑载体。【结果】双靶点载体片段及三靶点载体片段扩增后大小为650～750 bp,将上述PCR片段连入载体PKSE401,双靶点载体1Sol4和2Sol4经阳性鉴定得到650 bp片段，三靶点载体3Sol4经阳性鉴定后得到1 200 bp的片段。【结论】重组载体构建成功，并建立了茶炭疽菌C.camelliae的CRISPR/Cas9敲除体系。     

苹果光响应转录因子MdHY5表达及蛋白互作分析

【目的】克隆苹果光响应过程中关键的bZIP（basic-leucine zipper）转录因子MdHY5,并进行表达分析及蛋白互作检测,为阐述苹果中MdHY5在光信号过程中的功能及作用机制奠定基础。【方法】对苹果中具有bZIP保守结构的基因设计半定量引物进行表达分析,筛选具有光响应的bZIP转录因子。对光响应的bZIP家族基因进行BLAST比对,根据同源比对分析将目的蛋白命名为MdHY5,同时对cDNA序列设计引物进行克隆;利用MEGA5软件将MdHY5蛋白与拟南芥基因组中所有的bZIP转录因子家族成员进行聚类分析,同时对蛋白进行保守结构域分析;取苹果各组织材料进行MdHY5时空表达分析;通过对MdHY5启动子序列进行预测分析,并结合拟南芥同源基因芯片数据,进一步利用RT-PCR与半定量PCR检测MdHY5对不同光质的表达响应。将MdHY5连接到原核表达载体PGEX-4T-1上,利用IPTG对转化的大肠杆菌BL21融合蛋白进行诱导表达、蛋白杂交检测,并进行蛋白纯化;利用pull down试验验证MdHY5与MdCOP1蛋白的互作。【结果】通过光响应分析,在苹果中筛选到一个bZip转录因子家族成员,聚类分析显示MdHY5基因与拟南芥AtHY5同源性最高,该基因位于苹果基因组12号染色体上,基因编号为MDP0000586302,与拟南芥AtHY5结构相似,MdHY5也含有4个外显子,3个内含子。该基因cDNA序列长度为1 112 bp,其中5′非编码区长度为214 bp,3′非编码区长度为403 bp,开放阅读框长度为495 bp,编码一个含有164个氨基酸残基的蛋白。蛋白保守域分析显示,MdHY5蛋白C端含有一个典型的亮氨酸拉链结构（bZIP domain）,其中在bZIP结构域的N端含有一个核定位信号区域（NLS domain）。时空表达分析显示MdHY5在各组织中均表达,其中叶片中表达水平最高,花和种子中表达水平较低。利用PLACE对启动子进行了顺式作用元件分析发现,MdHY5启动子上含有G-box、GT-1-box、I-box等多个光响应的作用元件,而定量表达分析显示MdHY5能够被白光、蓝光、紫外光诱导,而红光对MdHY5表达没有明显影响。将构建好的融合蛋白表达载体转化BL21并进行蛋白诱导,菌体经超声波破碎后显示,融合蛋白主要在上清中存在。将诱导的MdHY5-GST蛋白分别与MdCOP1-HIS及pET-HIS蛋白孵育进行pull down试验,结果显示,MdHY5在体外能够与MdCOP1蛋白互作。【结论】MdHY5为光诱导的bZIP转录因子,是拟南芥光形态建成关键转录因子AtHY5的同源基因,与AtHY5具有类似的基因与蛋白结构,在叶中表达量最高,同时对多种光质具有表达响应,能够与MdCOP1互作。     

CRISPR-Cas9系统在蔬菜育种上应用研究进展

由规律成簇间隔短回文重复序列(clusteredregularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein)组成的CRISPR-Cas系统是细菌一种重要的获得性免疫系统。经改造的CRISPR-Cas9系统不仅能对基因组进行单个位点的特异性识别,还可对基因组的多个位点同时修饰,实现目的基因的插入、缺失。经过几年的发展,已在番茄、马铃薯、甘蓝、油菜等蔬菜中成功应用,创造了很大的应用价值。主要对CRISPR-Cas9系统原理及以番茄为主等蔬菜应用研究进展进行了综述,以期为蔬菜改良育种研究提供参考。     

CRISPR-Cas9系统在蔬菜育种上应用研究进展

由规律成簇间隔短回文重复序列(clusteredregularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein)组成的CRISPR-Cas系统是细菌一种重要的获得性免疫系统。经改造的CRISPR-Cas9系统不仅能对基因组进行单个位点的特异性识别,还可对基因组的多个位点同时修饰,实现目的基因的插入、缺失。经过几年的发展,已在番茄、马铃薯、甘蓝、油菜等蔬菜中成功应用,创造了很大的应用价值。主要对CRISPR-Cas9系统原理及以番茄为主等蔬菜应用研究进展进行了综述,以期为蔬菜改良育种研究提供参考。     

苹果U6启动子的克隆及功能分析

【目的】U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件,其可能存在物种特异性因子,且长度不同转录活性存在差异。迄今在苹果（Malus×domestica）上对U6启动子尚缺乏研究。因此,筛选出转录活性高且片段大小合适的苹果U6启动子,可以优化苹果CRISPR/Cas9基因编辑体系。【方法】利用软件DNAMAN以及启动子元件在线分析网站PLACE和plant CARE对苹果U6启动子进行比对分析;克隆并构建U6启动子驱动萤火虫荧光素酶基因（Firefly luciferase,LUC）的融合表达载体,利用农杆菌介导的瞬时转化法分别转染苹果愈伤组织和本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片;通过检测荧光素酶活性对各U6启动子进行转录活性比较。【结果】苹果基因组中共检索到6条U6 snRNA（E-value<3e ^-40）,分别位于第6、7、9、10、15和17号染色体上,取5′端27 bp snRNA及其上游1 500 bp作为候选U6启动子。序列比对结果显示,苹果U6启动子与拟南芥相同,均具有两个保守的元件,包括上游序列元件（Upstream sequence element,USE）和TATA-Like box。瞬时转化后荧光素酶活性检测结果显示,10号染色体上的U6启动子转录活性最高,10号染色体上5′端截短的U6启动子（长度分别为1 500、959、275和116 bp）中275 bp的启动子活性最强。另外,在苹果愈伤组织中,苹果U6启动子的转录活性要显著高于拟南芥U6启动子。【结论】从苹果基因组克隆6条U6启动子,并筛选出一条转录活性高且片段长度较短的U6启动子。     

5种苹果属植物GAI基因的克隆及生物信息学分析

【目的】研究DELLA家族的成员GAI在调控植物株型形成方面的生物学功能。【方法】从5种苹果属植物(‘国光’、‘武乡海棠’、‘SH6’、‘比利时垂枝’、‘比利时直立’)中分离得到GAI基因,应用多种生物学工具分析其序列特征。【结果】序列分析表明,GAI的CDS序列长度为1 875bp,编码624个氨基酸;GAI的基因组序列长度与其对应CDS序列长度相同;GAI蛋白具有亲水性,主要定位于细胞质;5种苹果属植物的GAI序列相似性极高,都具有DELLA家族和GRAS家族特有的典型结构。【结论】试验结果暗示这5种苹果属GAI基因可能在苹果株型形成方面发挥重要功能。     

丝克高粱rDNA ITS区的RFLP分析

对检疫性杂草丝克高粱及其5个同属近似种假高粱、明福1号、拟高粱、苏丹草和黑高粱的rDNA内转录间隔区(ITS)进行PCR扩增及测序,并利用限制性内切酶XceⅠ对这些近似种的PCR产物进行酶切分析.结果表明:各个种间均有XceⅠ酶切位点,其中假高粱、明福1号、拟高粱、苏丹草及黑高粱5个种的酶切图谱完全一致,而丝克高粱的酶切图谱与其5个同属近似种的酶切图谱不同.假高粱、明福1号、拟高粱、苏丹草及黑高粱的rDNA PCR扩增产物可以切出4条带,大小约为670、530、190、150 bp;而丝克高粱只能切出2条带,大小约为670、190 bp,这与其5个同属近似种在rDNA ITS区有2个XceⅠ酶切位点,而丝克高粱只有1个酶切位点的结果相一致.因此,利用XceⅠ就可以把丝克高粱与其5个近似种区分开.     

巴西橡胶树HbCXE1基因克隆及其生物信息学分析

采用PCR和RACE技术从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的乳管细胞中克隆到一条CXE羧酸酯酶蛋白家族基因HbCXE1,该基因cDNA全长1272 bp,含有一个长951 bp的阅读框,编码含316个氨基酸的HbCXE1蛋白。生物信息学分析表明,HbCXE1蛋白理论分子量为35.5437 ku,理论等电点为5.94,HbCXE1蛋白与蓖麻、杨树、葡萄、苹果、拟南芥的CXE蛋白同源性分别为75.08%、62.81%、62.31%、59.43%、57.68%。HbCXE1蛋白具有羧酸酯酶蛋白家族的特征结构,有一个保守的催化基团,由分布于一级结构基序中的不同位置的3个保守氨基酸[丝氨酸（位于保守的G-X-S-X-G结构域中间）、天冬氨酸/谷氨酸、组氨酸]组成,一个保守的氧离子洞HGG结构域,有8个β-折叠结构,5个α-螺旋结构,因此HbCXE1蛋白属于羧酸酯酶蛋白家族,可能参与橡胶树乳管细胞的防卫反应。