鸡circ＿DNAJC3的鉴定及功能预测

【目的】鉴定鸡circ＿DNAJC3并预测其功能,为进一步研究其在细胞生物学过程中的作用奠定基础。【方法】通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、Sanger测序、亚细胞定位、RT-qPCR和生物信息学软件鉴定鸡circ＿DNAJC3的环状结构及其稳定性、解析其在细胞中的位置和在不同组织中的表达水平、并预测其功能和可能的作用方式。【结果】鸡circ＿DNAJC3由外显子2至4构成稳定的共价环状结构,共311 bp;具有物种保守性;在细胞质中显著性富集（P<0.05）;在回肠、胸腺、脾脏、盲肠中高表达（P<0.05）而在下丘脑和小脑中低表达（P<0.05）;其可能互作的RNA结合蛋白为AGO2、CELF2、PTBP1和HNRNPC;可能与gga-miR-132b-5p发生互作,其靶基因可能通过钙离子信号通路参与细胞增殖、分化、凋亡及代谢。【结论】揭示了鸡circ＿DNAJC3真实存在,可能与RNA结合蛋白和gga-miR-132b-5p互作参与调节细胞生物学过程。     

牛FoxO1基因CDS区克隆及其在脂肪细胞分化过程中的表达分析

本试验旨在克隆牛叉头转录因子O1(Forkhead box O1,FoxO1)基因编码区序列并探究其在牛脂肪细胞分化过程中的表达规律。利用PCR扩增牛FoxO1基因CDS区序列,通过生物信息学方法预测牛FoxO1的理化特性和功能,并运用实时荧光定量PCR技术检测牛脂肪细胞不同分化阶段FoxO1和脂肪标志基因PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、FABP4和LPL的表达规律。结果显示,牛FoxO1基因的CDS区全长1 998 bp,编码665个氨基酸,其蛋白分子式为C₃₀₁₆H₄₇₁₁N₈₇₁O₉₇₉S₃₅,理论等电点为6.38。预测发现,FoxO1与脂肪生长发育调控蛋白AKT1、AKT2、AKT3、SIRT1、PRKACA、CDK2和MAPK8等之间存在紧密互作关系。系统进化树结果显示,牛FoxO1进化保守,与亲缘关系较近的绵羊和山羊物种同源性最高。检测牛脂肪细胞不同分化时期基因的时序表达,结果显示,与分化第0天相比,牛FoxO1基因在第6天表达量达到峰值(P<0.01...     

针叶树G ID1同源基因分离鉴定与功能预测

GID1作为赤霉素(GA)受体蛋白,是GA信号通路的重要组成部分,其编码基因GID1在被子植物中已经被广泛克隆,但在针叶树种中的研究十分滞后。为了分离针叶树GA受体GID1基因并推测其功能,本研究以拟南芥GID1s序列为探针,在油松高质量参考转录组内筛选并鉴别出了油松GID1直系同源基因;基于该基因序列同源克隆了樟子松、白皮松、赤松GID1基因,通过BLAST获得了日本落叶松、火炬松、白云杉与挪威云杉的GID1-like基因;对针叶树GID1基因进行序列保守性、蛋白结构和组织表达活性分析。结果表明:针叶树种很可能只含有一个GID1基因,该基因在针叶树中具有很高的保守性;虽然与被子植物GID1之间的序列一致性较低,但其保持GA亲和活性所必需的氨基酸残基十分保守,与其下游DELLA蛋白相互作用的功能域与结构同样十分保守,推测其在针叶树GA信号转导中具有受体功能;表达分析显示GID1在挪威云杉不同组织和油松雌雄球花不同发育阶段间表达较为稳定,表明GID1可能广泛参与这些组织的发育过程,针叶树GA信号调控通路中GA受体的转录调控可能并不是核心调控机制。研究结果为GID1基因在针叶树生长发育过程中的分子调控机制研究奠定了基础。      

波形纤维蛋白在前体脂肪细胞分化中的表达

采用免疫组化 (HIGH- SABC)法对前体脂肪细胞分化中波形纤维蛋白的表达进行了定性和定量检测 ,并结合计算机图像分析系统对细胞形态参数值 (细胞总面积、胞核面积、细胞周长、等效直径及胞核质比 )进行了分析。结果表明 :(1)波形纤维蛋白参与前体脂肪细胞分化的全过程 ,而且其表达具有明显的时间依赖性——随分化的进行呈下降的趋势 ,染色模式为细胞质 ;(2 )在前体脂肪细胞积聚脂滴向脂肪细胞分化的过程中 ,细胞总面积、胞核面积、细胞周长和等效直径总的呈上升趋势 ,胞核质比呈下降倾向。     

鸡传染性支气管炎病毒地方-分离株S1基因克隆和基因型鉴定

利用ＩＢＶ全长Ｓ１基因特异性引物,以纯化的３个标准株Ｍ４１、Ｈ５２、Ｔ和６个地方分离株（ＱＤ、ＺＺ、ＧＺ、ＧＪ、ＤＬ和ＹＣ）的基因组ＲＮＡ为模板,用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出预期大小约１．７３ｋｂｃＤＮＡ片段,经ＢＡＭＨＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切插入到质粒ｐＵＣ１８中,并在大肠杆菌ＪＭ８３中实现了克隆。对６个分离株的Ｓ１基因ＰＣＲ产物进行ＨａｅⅢＲＦＬＰ分析,表明ＱＤ、ＴＪ属于Ｍ４１基因型,ＺＺ和ＧＺ与Ｔ基因     

鸡脂肪源间充质干细胞的分离与鉴定

【目的】建立鸡脂肪源间充质干细胞的分离与鉴定方法.【方法】用I型胶原酶消化法分离天露黄鸡脂肪间充质干细胞(AMSCs),CCK-8检测细胞生长活力,RT-PCR鉴定其特异性标记物,化学法对其进行成脂和成骨分化诱导.【结果和结论】原代及传代的细胞呈成纤维细胞样形态,并能传代至10代,其活力无明显变化;细胞生长曲线呈S型;RT-PCR检测显示AMSCs的特异性标志物CD71、CD44和CD29表达呈阳性,而属于造血干细胞的特异性标志物CD34和CD45呈阴性;AMSCs通过不同诱导液被成功诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,在成脂分化过程中有脂滴形成,油红O染色呈阳性,过氧化物酶体增殖物激活受体基因γ(PPARγ)和脂肪酸基因(FAS)的mRNA表达量升高;在成骨分化过程中有钙结节形成,茜素红染色呈阳性,碱性磷酸酶(ALP)活性检测对照组与诱导组比较差异显著(P﹤0.05),ALP基因和骨形态发生蛋白基因(BMP2)的mRNA表达量升高.研究表明,鸡AMSCs具有分化为多种细胞的潜能.     

番茄NAC家族基因的鉴定及其功能预测

利用生物信息学方法对番茄NAC转录因子家族成员、序列、保守区、分子量、等电点等基本信息进行分析,结果显示,番茄NAC家族包含101个蛋白质,分为12亚族(I~XII)。功能预测显示,20个NAC基因可能与植物抗逆相关,8个NAC基因可能与植物所参与的渗透胁迫和衰老有关,24个NAC基因可能与发育相关。该研究为番茄NAC转录因子家族基因功能分析提供信息基础,从而对番茄品种的改良提供候选基因。     

HOPX基因过表达对鸡前脂肪细胞增殖的影响

【目的】构建鸡HOPX基因（homeodomain only protein X）全长编码区（coding region sequence, CDS）的真核表达载体,转染鸡原代前脂肪细胞,探讨HOPX基因过表达对鸡原代前脂肪细胞增殖的影响。【方法】利用Primer Premier 5.0软件设计鸡HOPX基因CDS区上、下游引物,以AA肉鸡腹部脂肪组织的cDNA为模板,采用PCR扩增、克隆鸡HOPX基因全长CDS区,并将其亚克隆至真核表达载体（pCMV-HA vector）,获得HOPX基因的真核表达载体pCMV-HA-HOPX。采用双酶切鉴定、测序及Western blotting方法分析鉴定pCMV-HA-HOPX。采用胶原酶法分离培养12日龄AA商品肉仔鸡腹部脂肪组织原代前脂肪细胞,瞬时转染pCMV-HA-HOPX,转染6 h时后消化细胞,按照每孔50 000个细胞数接种12孔培养板,并在细胞贴壁0、24、48和72 h,分别采用显微镜观察和CCK-8细胞增殖检测试剂盒分析HOPX基因过表达对鸡原代前脂肪细胞增殖的影响;同时,利用TRIzol法提取组织和细胞总RNA,并反转录合成cDNA,采用Real-time RT-PCR方法分析细胞增殖标志基因Cyclin D1和PCNA的mRNA表达。【结果】测序结果显示,鸡HOPX基因的全长CDS区大小为222 bp,与NCBI发布的鸡HOPX基因mRNA序列（NM_204556）一致;利用HA标签抗体的Western blotting分析显示,真核表达载体pCMV-HA-HOPX能够表达出预期大小的蛋白分子（约9.5kD）,表明鸡HOPX基因的真核表达载体pCMV-HA-HOPX构建成功。显微镜观察发现,转染pCMV-HA-HOPX载体的细胞（HOPX过表达组）在细胞贴壁后培养24和48 h的细胞数量低于转染pCMV-HA vector空载体（空载体对照组）的细胞数量;CCK-8检测分析发现,转染pCMV-HA-HOPX载体细胞的吸光度值（OD值）在细胞贴壁后培养24、48和72 h都极显著低于空载体对照组（P＜0.01）。与细胞增殖检测结果相一致,细胞增殖标志基因表达检测分析发现,在细胞贴壁后培养24 h后,HOPX过表达组细胞Cyclin D1基因的mRNA表达量显著低于空载体对照组（P＜0.05）;在细胞贴壁后培养48 h时,HOPX过表达组的PCNA基因的mRNA表达量显著低于空载体对照组（P＜0.05）;在细胞贴壁后培养72 h时,HOPX过表达组的PCNA和Cyclin D1基因的表达量均极显著低于空载体对照组（P＜0.01）。【结论】HOPX基因过表达在体外抑制鸡原代前脂肪细胞的增殖。     

芦笋提取物抗氧化和抑制3T3-L1前脂肪细胞分化活性研究

目的 研究芦笋提取物的抗氧化能力和抑制3T3-L1前脂肪细胞分化的活性。方法 采用乙醇回流提取,通过酸碱处理,制备得到芦笋提取物;利用紫外分光光度法测定提取物中的酚酸含量（以没食子酸计）;采用DPPH法测定提取物清除自由基的活性;通过CCK8法及油红O染色法分别检测芦笋提取物对3T3-L1前脂肪细胞存活率及分化率的影响。结果 芦笋提取物中以没食子酸计的酚酸含量为0.5308 mg/mg;测得提取物清除自由基活性强弱与剂量成正相关,当其浓度达到2 mg/mL时,其对DPPH的清除率可达89.68%;在10~200μg/mL的测定浓度范围内,提取物对3T3-L1细胞生存率无明显影响,对3T3-L1细胞的分化有明显抑制作用,且呈剂量依赖性。结论 芦笋提取物具有较好清除自由基的活性,且活性强弱呈剂量依赖关系;芦笋提取物具有抑制前脂肪细胞分化的能力,且随剂量升高而增大。     

瘦素对鸡原代前体脂肪细胞增殖分化的影响

【目的】探究不同浓度瘦素对鸡原代前体脂肪细胞增殖分化的影响。【方法】以12日龄科宝肉鸡腹部脂肪为材料进行原代前体脂肪细胞培养,细胞铺板24 h后,试验组细胞以添加了0、50、200、800 ng/m L瘦素的培养基进行培养,每隔24 h换一次液,至72 h。采用CCK8法绘制对照组和瘦素处理组细胞的生长曲线,油红O提取比色法测定脂肪含量变化,Real-time PCR方法检测前体脂肪细胞分化过程中关键基因PPARγ和SREBP1c的表达。【结果】CCK8法与油红O提取比色法表明,0~800 ng/m L瘦素对鸡前体脂肪细胞的增殖分化无显著影响(P0.05),Real-time PCR结果表明不同浓度的瘦素处理对前体脂肪细胞内脂肪分化关键基因PPARγ和SREBP1c的表达无显著影响(P0.05)。【结论】本试验证明0~800 ng/m L瘦素对鸡前脂肪细胞的增殖和分化无影响。     

贵州地方白羽鸡种MSTN基因SNP位点快速筛查及其蛋白功能预测

[目的]明确贵州地方白羽鸡种肌肉生长抑制素(MSTN)基因的多态性,筛选出改良白羽鸡肉质品质的分子遗传标记,为选择培育优良肉质鸡种提供参考依据.[方法]以兴义矮脚鸡白羽品系、罗曼蛋鸡及兴义矮脚鸡白羽品系与罗曼蛋鸡杂交的自交后代(F2)为研究对象,提取3个鸡种的血液基因组DNA构建DNA混合池,PCR扩增MSTN基因全部外显子序列,直接测序筛选SNP位点并进行生物信息学分析,探究SNP位点突变对MSTN基因mRNA二级结构及编码蛋白结构和功能的影响.[结果]在鸡MSTN基因第1外显子(Exon-1)筛查到6个SNPs位点,分别为G51A、A60G、G195C、A234G、C297T和C324T,且6个SNPs位点均为同义突变.在A234G位点处检测到兴义矮脚鸡白羽系和F2代存在多态性,但罗曼蛋鸡未发生变异;在C297T位点处检测到罗曼蛋鸡存在多态性,以C为优势等位基因,而兴义矮脚鸡白羽品系和F2代均未发生变异;G51A、G60A、G159C和C324T等4个SNPs位点在3个鸡种中均存在多态性.A234G位点突变对鸡MSTN基因mRNA二级结构稳定性无影响,G51A位点突变致使MSTN基因mRNA二级结构最小自由能降低但未改变其构象,A60G、G195C、C297T和C324T等4个SNPs位点突变均引起MSTN基因mRNA二级结构和最小自由能的改变.鸡MSTN基因编码蛋白为不稳定的脂溶性蛋白,存在信号肽,但不存在跨膜区域,其二级结构由无规则卷曲、β-折叠和α-螺旋组成,且以无规则卷曲占比最高.[结论]MSTN基因在贵州地方白羽鸡种中的多态性较丰富,其中A60G、G195C、C297T和C324T等4个SNPs位点突变会导致基因mRNA二级结构的构象发生改变,可作为改良白羽鸡肉质品质的分子遗传标记进一步研究.     

Commitment of mouse fibroblasts to adipocyte differentiation by DNA transfection

Cells of the mouse cell line 3T3-F442A can be induced by various hormones to differentiate into adipocytes, whereas cells of 3T3-C2, a subclone of 3T3, cannot. However, transfection of DNA from uninduced 3T3-F422A cells into 3T3-C2 cells permits recovery of 3T3-C2 transfectants that differentiate into adipocytes in the presence of insulin. DNA isolated from human fat tissue, when transfected into 3T3-C2 mouse cells, also gives rise to mouse transfectants that are induced to differentiate into adipocytes by the addition of insulin. Apparently, transfection of a trans-regulatory gene (or genes) from 3T3-F442A or human fat cells into 3T3-C2 cells is sufficient to commit 3T3-C2 cells to adipocyte differentiation.     

Association of polymorphisms in adipocyte fatty acid binding protein gene with fat-related traits in chicken

PCR-SSCP analysis was used to detect polymorphic sites in chicken adipocyte fatty acid binding protein (A-FABP) gene. Six Chinese local breeds, Beijing-You chicken, Dwarf chicken, Taihe silky chicken, Chongrenma chicken, Xiayan chicken, Luyuan chicken and an introduced foreign breed, Arbor Acre broiler, were used as test populations. Three PCR-SSCP loci were detected. Statistical results showed that frequencies of genotypes and alleles were significantly different in the test populations. Sequence analysis revealed that C → T, G → A, and C → T transitions were responsible for the polymorphisms. Some fat-related traits such as body weight, content of intramuscular fat (IMF) and percentage of abdominal fat (AFP) were measured in Dwarf chickens and male Beijing-You chickens. We found out that chicken quality was significantly related to different genotypes in these two populations. __________ Translated from Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2007, 38(6): 526–532 [译自 : 畜牧兽医学报]     

植物血凝素对鸡免疫功能的影响

选用罗曼蛋公鸡270羽,随机分为9组,连续3次肌肉注射不同剂量植物血凝素(PHA)后,对其血清蛋白、免疫器官指数及新城疫的攻毒保护效果进行检测.结果表明:肌注2.4 mg/kg.bw PHA组与对照组相比,可显著提高鸡的血液生化指标(P<0.05),极显著提高对鸡新城疫的保护率(P<0.01);肌注1.2 mg/kg.bw PHA组与对照组相比,可显著提高胸腺指数和新城疫攻毒保护率(P<0.05).     

鸡肉蛋白营养与功能特性的研究进展

对鸡肉蛋白营养组分,酶解特性,鸡肉蛋白对鸡肉制品风味、色度、嫩度、凝胶性、保水性和乳化性的影响以及鸡肉蛋白结构与物理特性的相关性进行了综述,并对鸡肉研究与发展趋势进行了展望.     

鸡新城疫病毒地方野毒株的分离鉴定与致病性试验

从某一疑似新城疫病例的蛋鸡群中分离到一株病毒，经HA和HI试验、血清中和试验和动物回归试验。最终确认所分离毒株为新城疫病毒。经对分离株的MDT、ICPI和IVPI等致病指数的测定，表明该毒株为新城疫强毒株。     

circRIPK2在鸡骨骼肌细胞增殖分化中的调控作用

目的 探索circRIPK2在鸡骨骼肌生长发育中的功能及作用机制。方法 依据反向剪切位点设计收敛、发散引物,并结合Sanger测序验证circRIPK2的环形结构。利用RT-PCR探究不同发育时期circRIPK2的表达水平。通过构建过表达载体,结合EdU、流式细胞术和RT-PCR,探究circRIPK2对鸡原代成肌细胞增殖分化的影响。结果 PCR电泳结果及Sanger测序证明circRIPK2环化位点真实存在。RT-PCR结果表明,和对照组相比,过表达circRIPK2后,对细胞增殖有抑制作用的标记基因p21的mRNA表达上调20%,对细胞增殖有促进作用的标记基因Cyclin B2、Cyclin D1、Cyclin D2和PCNA的mRNA表达分别下调39%、22%、29%和45%;肌分化标记基因MyHC、MYOG和Myomaker的mRNA表达分别上调了39%、56%和25%。EdU检测细胞增殖和流式细胞术检测细胞周期变化的结果表明,circRIPK2抑制细胞增殖进程。结论 circRIPK2可能通过抑制成肌细胞增殖、促进成肌细胞分化,从而影响鸡骨骼肌的生长发育过程。     

FoxO3转录因子在鸡卵巢组织中的表达鉴定

[目的]明确FoxO3转录因子在不同日龄鸡卵巢组织中的表达模式及其具体定位情况,为后续开展家禽卵泡激活及发育调控等相关机理研究提供科学依据.[方法]在GenBank中搜索鸡与其他物种(鸭、鹅、老鼠、猪、牛及人类)的FoxO3氨基酸序列,通过LaserGene分析鸡FoxO3氨基酸序列与其他物种FoxO3氨基酸序列间的亲缘关系及同源差异情况;利用RT-PCR鉴定FoxO3基因是否在鸡卵巢组织中表达,再采用实时荧光定量PCR检测不同发育阶段鸡卵巢组织中FoxO3基因的表达水平,最后以免疫荧光检测FoxO3蛋白在鸡卵巢组织中的定位情况.[结果]鸡与鸭和鹅的FoxO3氨基酸序列相似性分别为92.7%和95.3%,基于FoxO3氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示鸡与鸭和鹅的亲缘关系较近,说明FoxO3基因的进化相对较保守.在不同发育阶段的鸡卵巢组织中均能检测到FoxO3基因表达,且FoxO3基因在0日龄鸡卵巢组织中的相对表达量最高,显著高于在其他发育阶段的相对表达量(P<0.05).在0日龄鸡卵巢组织中未检测到FoxO3蛋白,但在21日龄和成年鸡的卵巢组织中均能检测到FoxO3蛋白;在21日龄鸡卵巢组织中FoxO3蛋白主要定位在原始卵泡细胞周围,在卵泡内部没有表达;而在成年鸡卵巢组织中FoxO3蛋白仅定位于大卵泡细胞边缘,小卵泡细胞内并未发现FoxO3蛋白.[结论]由于鸡和哺乳动物的FoxO3氨基酸序列高度同源,且FoxO3蛋白在鸡卵巢组织中的定位与在哺乳动物卵巢组织中的定位相似,说明FoxO3在鸡卵巢组织中发挥着与哺乳动物相似的功能,即在卵泡激活与成熟过程中发挥重要作用,因此通过调控FoxO3能有效提高鸡的繁殖性能.