H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及在E.coli中的表达

选择一株H5N1亚型高致病性禽流感病毒株A/Goose/Guangdong/1/96(简写为GD/1/96),根据测得的NS基因序列,设计一对特异性引物NS1U/NS1L,RT-PCR方法扩增该毒株的NS1基因。将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体PET-32a( ),并进一步酶切分析和序列测定,鉴定出NS1基因的阳性重组子。阳性质粒转化E.coliBL 21(DE3)感受态细胞,在IPTG诱导下,经SDS-PAGE和Western-blotting分析鉴定,成功的在细菌包涵体中表达出45 kD的NS1融合蛋白。重组蛋白经Ni-NTA His.Bind Resins纯化。     

H9N2亚型禽流感病毒NS1A融合基因的克隆表达及抗体的制备

应用重叠PCR的方法获得NS1A融合基因片段,并将融合基因片段成功地插入pET-20b原核表达载体,将阳性重组质粒转化表达受体菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达。进行表达产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting检测,结果表明NS1A融合基因获得高效表达,薄层扫描分析表明表达蛋白占菌体蛋白的15%。大量培养NSIA工程菌,用侧带法纯化蛋白后对日本大耳白兔进行常规免疫,应用间接ELISA测定抗体的效价达1∶25 600,为下一步NS1A融合基因真核表达产物的检测奠定基础。     

H5N1亚型禽流感病毒M2基因的原核表达及纯化

将含缺失跨膜区M2蛋白重组质粒pGEXsM2的大肠杆菌，用终浓度为0．6mmol／L IPTG在37℃下诱导表达，获得可溶性表达的融合蛋白；在Western blot试验中，M2特异性单克隆抗体14C2与目的蛋白发生反应，在35kD处有一条特异性条带，表明表达的重组M2蛋白具有免疫学活性；表达产物使用GST亲和吸附柱进行纯化，获得了大量的目的蛋白及微量的GST蛋白，使用分光光度仪确定纯化后M2蛋白的浓度约为5．6mg／mL。本实验为进一步研究M2生物学特性、建立M2特异性抗体的间接ELISA检测方法及研制M2亚单位疫苗奠定了基础。     

H9N2亚型禽流感病毒M1基因在大肠杆菌中的原核表达

采用RT-PCR技术扩增禽流感病毒M1基因,将M1结构基因克隆于pMD18-T载体.测序结果表明,插入的片段为M1目的基因.切下目的基因M1,重组到含有谷胱苷肽(GST)的融合蛋白原核表达载体pET-32a(+),获得的重组质粒经PCR、酶切以及序列分析鉴定表明,M1基因插入的位置、大小和读码框架均正确,证明成功构建融合表达载体pET-32a-M1.构建好的重组质粒经1 mmol/L IPTG诱导,在大肠杆菌BL21中得到大量表达,经过6h表达量达到高峰.融合蛋白M1的分子质量为29.8 ku,以包涵体形式存在.Western-Blot及ELISA分析表明,融合蛋白能够与M1单克隆抗体发生特异性反应,说明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性.     

H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆及原核表达

据GenBank收录的H9N2亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因序列设计并合成引物,以H9N2亚型禽流感病毒RNA为模板,用R1PCR方法扩增了预计约1700bp的HA基因,将此扩增产物克隆进pMD18-T载体,采用限制性酶切及序列测定鉴定阳性重组克隆子结果表明HA基因长为1683bp。基于HA信号肽在表达中的负作用,研究通过基因工程手段缺失HA蛋白位于起始的信号肽的编码户列,获得了缺失HA蛋白信号肽的HA基因,将其亚克隆到pGEX-KG中,与GST融合表达。SDS-PAGE显示：融合表达的蛋白分子量乡为90kDa。     

H5N1 和 H9N2 亚型禽流感病毒HA基因的原核表达

采用自行设计的引物,通过PCR的方法,分别从pMD-HA5和pMD-HA9中成功扩增出AIV 0025(HSN1)株和KMⅢ(H9N2)株的血凝素(hemagglutinin,HA)基因,然后分别亚克隆到pET-32a( )、pET-28a( )表达载体中,构建并筛选出阳性重组子,分别标记为pET32-HA5、pET28-HA9.将阳性重组质粒转化进B121(DE3)宿主菌中,通过改变IPTG浓度和诱导时间,使重组蛋白获得表达,并确定了最佳诱导条件为IPTG终浓度1.0 mmol/L、诱导时间4～5 h.经SDS-PAGE和 Western-blotting 分析表明,重组蛋白相对分子质量约为85 000和63 000,主要存在于包涵体中,具有良好的免疫学活性.     

H9N2亚型禽流感病毒NS1基因的原核与真核表达

【目的】构建H9N2亚型禽流感病毒(AIV)NS1基因的原核和真核表达载体,将其分别在大肠杆菌和293细胞中进行表达,为进一步研究NS1蛋白的功能及其与宿主的相互作用,以及鉴定禽流感疫苗免疫禽和野毒感染禽ELISA诊断试剂盒的制备提供理论依据。【方法】用RT-PCR方法扩增H9N2亚型AIV的NS1基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中构建NS1基因的原核重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达;同时,将NS1基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建NS1基因真核重组质粒,将其瞬时转染293细胞,48h后收集感染细胞,对大肠杆菌表达产物和293细胞表达产物进行Western-blotting分析。【结果】成功构建了NS1基因的原核表达载体pET-32a-NS1和真核表达载体pEGFP-C1-NS1。Western-blotting结果表明,大肠杆菌和293细胞的表达产物均能检测到特异性条带(大肠杆菌的表达产物在约44ku处出现阳性条带,293细胞表达产物在约55ku处出现特异条带)。【结论】NS1基因在大肠杆菌和293细胞中得到成功表达,获得的NS1蛋白具有良好的抗原活性。     

禽流感病毒H5亚型HA1基因的原核表达及纯化

根据已报道的禽流感病毒H5 亚型HA1基因设计1对引物,利用RT-PCR技术扩增目的基因片段,将扩增片段插入到pPROEX-HTb表达载体上,并对重组表达质粒进行 PCR酶切鉴定,通过序列测定验证读码框,并在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中进行表达.结果表明:扩增出的1 000 bp的基因片段在大肠埃希氏菌中成功表达,...     

H9N2亚型禽流感病毒ns1基因的融合表达

禽流感病毒（AIV）非结构蛋白NS1在病毒粒子中不存在，因此，可以通过检测NS1抗体来鉴别禽流感病毒感染鸡群和免疫鸡群．将ns1基因和T4噬菌体soc基因在大肠埃希氏菌中融合表达，融合蛋白可以作为鉴别禽流感免疫鸡群和感染鸡群的检测抗原．采用RT-PCR方法扩增禽流感病毒H9N2的ns1基因（654bp）；将该片段克隆至pSOC质粒soc基因3’端，成功构建了重组质粒pSOC-NS1，用该重组质粒转化EcoliB121（DE3）感受态细胞，以终浓度1mmol／mL的IPTG诱导表达．SDS-PAGE结果表明pSOC-NS1融合蛋白相对分子质量约39000．Western-blot证实，表达产物与AIV H9N2病毒感染的小鼠血清具有良好的反应性．     

猪细小病毒NS1基因的原核表达

根据GenBank发表的猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)中国株基因序列设计引物,通过PCR方法扩增到了PPV LJL12株NS1全长基因,将其克隆到原核表达载pET30a( )上,成功构建原核表达载体pET30a-NS1,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞.经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot分析.SDS-PAGE电泳显示NS1在大肠杆菌中得到成功表达,重组蛋白大小约为86 ku,与预期大小相符;Western blot分析表明,该蛋白能与PPV阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有良好生物学活性.NS1在大肠杆菌中成功表达,具有免疫原性,可作为鉴别诊断抗原用于PPV的临床检测.     

H5亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及在原核细胞中的表达

以RT-PCR方法从H5N1亚型禽流感病毒A/DKZJ/12/00(H5N1)中获得禽流感病毒NS1的部分基因,将目的基因定向克隆到原核表达载体pET-32a,将测序和酶切验证正确的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,蛋白质电泳表明该蛋白得到了可溶性的表达,表达蛋白的分子量27 kD;Western-blot分析表明,该蛋白可以与禽流感H5阳性血清反应,具有良好的免疫原性.     

H9N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆表达及反应原性分析

【目的】对H9N2亚型猪流感病毒NS1（nonstructural protein 1）基因进行原核表达,获得纯化表达产物,以期为检测猪流感抗体的 ELISA试剂盒的研制奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增了猪流感病毒（H9N2）的NS1基因,将其克隆于表达载体pET-28a（+）上构建成重组质粒pET-NS1,转化受体菌E.coli BL21-DE3感受态细胞,经酶切鉴定及序列分析,筛选出正确重组质粒转化子。【结果】经终浓度5 mmol•L-1乳糖诱导,SDS－PAGE电泳结果显示,重组蛋白NS1得到大量表达,分子质量约为26kD。经Western-blotting分析,表达蛋白能与阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应;ELISA检测显示,在被检血清稀释1 280倍时,阳性血清的OD650值大约是阴性血清的3倍,差异明显。【结论】重组蛋白NS1表达量高,易于纯化并且具有良好的血清学反应的特异性。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的表达及纯化

利用PCR方法从含禽流感病毒HA基因的质粒T-HA上扩增HA基因,再将其克隆到原核表达载体pET28a中,用E.coliBL21(DE3)原核表达,SDS-PAGE和Western-blot对表达蛋白进行鉴定。Western-blot结果表明,表达产物具有免疫学活性,蛋白的分子量约为60kD,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理,表达蛋白能与H5亚型AIV阳性血清特异性反应,具有良好的抗原性。ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV血凝素抗体具有良好的灵敏性。     

H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化

为制备H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组HA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HA,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将重组质粒pCAMBIA1300-HA通过电转化法导入根癌农杆菌EHA105中,筛选出阳性菌落并侵染水稻愈伤组织。经过暗培养、潮霉素筛选、分化、生根、成苗,采用CTAB法提取水稻叶片DNA,PCR鉴定结果显示,HA基因已插入到水稻基因组中,重组HA基因大小为4 660 bp。将阳性植株移植到大田中,4个月后收获水稻种子,提取水稻胚乳蛋白,Western blot鉴定结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达。重组HA蛋白通过Q阴离子层析、疏水层析和凝胶过滤层析三步分离纯化,其纯度达到90%以上。最后将纯化后的重组HA蛋白与ISA 50V佐剂混合并乳化制成疫苗,免疫小鼠,小鼠血清具有较高的特异性抗体水平,表明重组HA蛋白免疫原性较好。综上,成功构建了H5N1亚型禽流感病毒HA重组蛋白的水稻表达系统,并分离纯化获得了高纯度和免疫原性良好的重组HA蛋白...     

H9N2亚型AIV NS1基因的克隆及其在杆状病毒系统的表达

应用DNAStar软件,参照Genbank中注册的AIV H9亚型毒株NS1基因序列,设计了一对引物,用RT-PCR方法成功地扩增出带双酶切位点的H9亚型AIV的NS1基因,通过BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切位点将NS1基因插入转移质粒载体pFastbacHTa中,获得重组转移载体pFastbacHTa-H9NS1并将其转化DH10Bac细胞,与Bacmid发生位点特异性转座作用,得到重组穿梭载体Bacmid-H9NS1,再将其转染昆虫细胞sf9,PCR鉴定证实该基因正确地插入到病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下游,经过SDS-PAGE和WesternBlot检测,H9 NS1基因在sf9细胞中得到了表达,H9 NS1大小约为28kD,而且表达的产物具有特异免疫学反应性。     

H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白在原核系统中的表达

应用带有His6尾的pET原核表达系统对禽流感病毒血凝素蛋白进行表达,将禽流感A/Turkey/Wisconsin/66(HgN2)的HA基因克隆至原核表达载体pET-30a中,经酶切、PCR扩增和测序分析确证其插入,并且阅读框正确,获得重组质粒pET30a-H9.将此重组质粒转化到宿主菌BL21中,用诱导剂异丙基硫代...     

禽流感病毒PA基因的原核表达载体的构建及鉴定

以重组质粒pcDNA-PA为模板扩增PA全基因,并构建原核表达载体pGEX-6p-1-PA。根据GenBank公开发表的禽流感病毒PA基因的序列设计引物,用PCR方法从重组质粒pcDNA-PA中扩增禽流感病毒的PA基因,将该基因定向插入到原核表达载体pGEX-6p-1中,然后将连接产物转化宿主菌DH5α,挑取阳性克隆进行PCR和BamHⅠ、NotⅠ双酶切鉴定并测序。测序结果表明,禽流感病毒PA基因全长2151 bp,编码717个氨基酸,原核表达载体pGEX-6p-1-PA已构建成功。从而为禽流感蛋白PA的表达及其多克隆抗体的制备奠定了基础。     

H9N2亚型禽流感病毒NA基因的原核表达及其免疫反应性分析

采用PCR方法扩增H9N2亚型禽流感病毒A/Ck/GS/2/99株NA基因(1 400 bp),克隆至pET-28a(+)载体上,构建重组原核表达载体pET-NA,转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,以终浓度0.8 mmol/L的IPTG诱导表达8 h.表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析表明:该载体能高效表达NA蛋白,相对分子质量约52KD,纯化产物能与N2亚型的AIV鸡血清发生特异性反应.     

禽坦布苏病毒NS1基因的原核表达

根据GenBank中登录的禽坦布苏病毒(avian Tembusu virus,ATMV)WR株非结构蛋白NS1基因设计特异性引物,采用RT-PCR方法从禽坦布苏病毒WR株核酸中扩增其NS1基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上构建原核表达重组质粒pGEX4T-NS1,进行条件优化诱导表达,将表达的目的蛋白经SDSPAGE分析。结果表明,分子量约为62kD的重组目的蛋白得到表达。     

鸡细小病毒NS1和VP2蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】原核表达鸡细小病毒(ChPV)的NS1和VP2蛋白,制备其多克隆抗体,为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立血清学诊断方法提供物质基础。【方法】通过合成ChPV GX-Ch-PV-21毒株的NS1和VP2蛋白基因序列,构建原核重组表达载体pET-32a-NS1和pET-32a-VP2,将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌transsetta感受态细胞进行原核表达,优化表达条件,以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳和免疫印迹(Western-blotting)方法鉴定NS1和VP2蛋白的表达情况。将表达产物免疫无特定病原体(SPF)鸡获得多克隆抗体,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法测定其效价,以Western-blotting和间接免疫荧光试验(IFA)对多克隆抗体进行鉴定。【结果】SDS-PAGE分析显示,NS1和VP2蛋白条带大小分别约为104和87 kD,与预期条带大小相符。对重组质粒pET-32a-VP2和pET-32a-NS1进行最佳诱导条件筛选,结果显示NS1蛋白表达的最佳诱导条件为异丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)终浓度1.0...