团头鲂主要组织相容性复合体Ⅰ类基因全长cDNA的克隆及组织表达分析

为了解团头鲂MHCⅠ类基因的结构,采用cDNA末端快速扩增（Rapid-amplification of cDNA ends,RACE）技术,首次成功克隆了团头鲂“浦江I号” F₀基础群体及选育F₈世代的MHCⅠ类基因,共获得3条cDNA全长序列。序列全长为2 040～2 079 bp,含有87~102 bp的5′-UTR,1 035～1 044 bp的编码区（包括信号肽,alpha 1、alpha 2和alpha 3三个结构域,跨膜区和胞质区）及911~946 bp的3′-UTR区,分别编码347、344个氨基酸。F₈世代序列的核苷酸/氨基酸的同源性很高,为89.0%/93.0%,而与F₀世代的同源性较低（75.3%~77.0 % 和71.1%~71.4%）,呈现出明显的分子多态性。分析表明,团头鲂具有经典的MHCⅠ类分子的空间结构,与人类HLA-A2的抗原肽结合区的晶体结构相比,二者的差异主要集中在5个(I~V)区上。在Neighbor-joining(NJ)法构建的分子进化树中,团头鲂与草鱼的亲缘关系最近,与鲑鳟鱼类、爬行类、鸟类、哺乳类及人类的亲缘关系则渐远。RT-PCR组织表达分析表明,团头鲂MHCⅠ类基因在所检测的的8个组织中均表达,在鳃、头肾和血液中有较强的转录本,中等强度表达于肝脏和脾脏,在后肾、肠和肌肉中表达较弱。     

黄鳝抗菌肽hepcidin基因cDNA的克隆及表达分析

根据已知鱼类抗菌肽hepcidin的同源性设计简并引物,利用同源克隆结合RACE法从黄鳝(Monopterus albus)肝脏中扩增得到了黄鳝hepcidin基因全长cDNA序列(GenBank accession number FJ436808).结果表明,黄鳝hepcidin基因cDNA全长712 bp,5′端非翻译区有133 bp,3′端非翻译区有306 bp,包含1个273 bp的开放阅读框,编码1个长90氨基酸的前体肽.同源性分析表明,黄鳝hepcidin推测的氨基酸序列与其他鱼类报道的hepcidin具有较高的同源性,并具有8个半胱氨酸这一典型特征,是hepcidin家族的1个新成员.采用半定量PCR法对该基因在健康成体不同组织的转录本和脂多糖(LPS)对该基因表达的影响进行了分析.结果发现,该基因在肝脏中表达量最高,其次是肾脏,在心脏、皮肤、脑、血液、小肠、脾脏和胃中的表达量较低,而在肌肉中没有检测到该基因的转录本;LPS注射24 h后,各组织的hepcidin基因表达量都有明显升高.     

黄鳝载脂蛋白apoAI基因的克隆及序列分析

以黄鳝(Monopterus albus)肝脏为研究材料,提取总RNA,利用同源克隆技术获得了黄鳝的载脂蛋白apoAI基因的部分编码区(GenBank登录号:HQ603782)和3′UTR,其cDNA序列长度为1 145 bp,其中编码区长度为772 bp,编码256个氨基酸.序列同源性分析表明,黄鳝的apoAI基因的...     

黄鳝Ⅲ型Hepcidin基因cDNA克隆及序列分析

以黄鳝为材料,提取肝脏总RNA,经RT-PCR扩增出Hepcidin基因cDNA的开放阅读框(ORF)及3′端非编码区序列(GenBank序列号FJ436807),序列分析表明,黄鳝Hepcidin含有一个273 bp的ORF,编码90个氨基酸残基,有信号肽(24个残基)、前体肽(40个残基)和成熟肽(26个残基)。在前肽部分具有前肽转化酶典型的RX(K/R)R基元。同源性比对表明,黄鳝Hepcidin与其他鱼类的同源性在40%以上,是Hepcidin抗菌肽家族的新成员。     

黄鳝雌激素受体α基因的克隆、抗体制备及初步分析

对雌激素受体α基因的氨基酸序列进行抗原性分析,筛选合适的基因片段进行克隆,经RT-PCR扩增得到大小为945bp的片段,经测序鉴定后,将该片段定向亚克隆于pMAL-c2x表达载体中,转化至TB1感受态细胞中进行诱导表达。经1mmol/L IPTG诱导4h观察到有新的重组蛋白获得了表达,采用SDS-PAGE和Western blot试验进行检测,结果表明表达的重组蛋白的分子质量约为78.1ku,表达产物占菌体总蛋白的42.3%,且具有免疫学活性。进一步纯化和蛋白酶切后,得到单一的雌激素受体α蛋白。以该蛋白免疫小鼠制备抗体,在免疫第7周时达到最大滴度1.158±0.232。将制备的多克隆抗体进行黄鳝性腺免疫组化分析,结果表明其能特异性地与卵巢中的激素受体α反应,在细胞膜上形成褐色沉淀。     

黑番鸭VIPR-1基因的克隆与多态性分析

VIPR-1基因是研究家禽就巢性状的重要候选基因,VIPR-1基因的克隆和测序能为进一步研究黑番鸭就巢性状的单核苷酸多态性奠定理论基础,为鸭分子遗传育种提供基因素材.本研究以黑番鸭基因组为模板进行PCR扩增,获取黑番鸭VIPR-1基因序列[1 864 bp(序列1)和1 673 bp(序列2)的基因片段],并进行目的基因片段克隆和测序.结果分析表明,序列1包含第5外显子(101 bp)、第5内含子(1 630 bp)及第6外显子(133 bp)的完整序列;序列2包含第12外显子(42 bp)、第12内含子(1 455 bp)的完整序列和第13外显子(176 bp)的部分序列.根据基因序列特征,对获取的2段黑番鸭VIPR-1基因序列分别设计4对引物,进行扩增序列测序比对.结果发现:在序列1第318处、454处存在C/T突变,第547处存在A/G突变,第923处存在A/T突变;序列2第89处、944处存在C/T突变,第662处存在G/A突变,第1 031处存在A/G突变,第1 334处存在A/C突变.黑番鸭VIPR-1基因序列的克隆与单核苷酸多态性SNP突变位点的发现为进一步开展VIPR-1基因的多态性与黑番鸭就巢性状相关研究奠定了基础.     

猪CSTB基因的克隆及多态性分析

[目的]利用RT-PCR方法克隆猪CSTB基因exon2序列,对所得序列进行多态性分析。[方法]以大白猪cDNA为模板,采用RT-PCR克隆方法,首次获得猪exon2序列,提交GenBank收录(GenBank登录号:DQ534493)。[结果]通过RT-PCR方法,克隆测序得到的猪CSTB基因exon2序列与人、鼠的CSTB基因exon2序列同源性分别为80.39%与72.55%。对所得猪exon2序列进行多态性分析,发现第26和78个碱基位置发生突变,分别为A→T和C→T,其中第26个碱基为错意突变,导致氨基酸的改变。[结论]CSTB基因exon2序列在猪、人和鼠上相对保守。     

猪PILRB基因的克隆及多态性分析

Ⅱ型配对免疫球蛋白样受体(Paired immunoglobulin-like type 2 receptors,PILRs)是近年发现的免疫球蛋白超家族成员之一,含有两个亚型,PILRα和PILRβ。在机体天然免疫反应中发挥重要作用,目前猪PILRB基因基因组序列尚未得到克隆、测序。研究利用PCR方法克隆猪PILRB基因部分基因组序列并分析该区域多态性。结果表明,获得猪PILRB基因序列长1 127 bp,包含完整外显子1、内含子1、外显子2、内含子2、外显子3和部分内含子3。猪PILRB基因内含子1和内含子2为研究首次克隆,全长分别为9和314 bp。在该区域共检测到15个SNPs,其中6个为中度多态位点,共形成5种单倍体型,ACACCG为优势单倍体型。研究结果为进一步揭示这些SNPs对PILRβ功能的影响及其在猪抗病育种中的作用提供基础。     

绵羊TTF-1基因的克隆及DNA多态性分析

自行设计2对引物,采用PCR方法从绵羊基因组中扩增获得2条目的片段,将其克隆转化并进行酶切鉴定及测序分析,结果表明所得序列为绵羊甲状腺转录因子-1(TTF-1)基因第1和第2外显子片段(GenBank登录号分别为DQ010919和DQ010920).分析发现,2条序列分别由318和249个核苷酸组成,编码105和82个氨基酸组成的多肽.同源性比对显示,绵羊TTF-1基因的核酸和蛋白质序列在分子进化上相当保守.利用PCR-SSCP方法对TTF-1基因在不同繁殖力绵羊品种间的DNA多态性检测表明,2个克隆片段的核酸序列在品种间无差异.     

黄鳝性腺差异表达基因的筛选和克隆

运用ACP—DDRT—PCR技术筛选和克隆了黄鳝不同发育时期性腺组织的差异表达基因。结果显示：利用2个随机ACP引物筛选到2个表达差异显著的基因,并对这2条差异表达片段进行克隆、测序分析,获得这2个基因的部分cDNA序列,长度分别为408bp和421hp。同源性分析结果显示其中一个基因与黄鲈卵巢cDNA文库中的一个基因（Gene BankNo．G0657149．1）高度同源;而另一个基因无同源性序列,视为新报道的基因。进一步半定量RT—PCR检测,结果显示：这两个基因在黄鳝卵巢和间期性腺中的表达差异显著,因此推测其在黄鳝性腺发育以及性逆转过程中起着重要作用。     

黄鳝性逆转相关基因的克隆和表达

运用cDNA末端快速扩增(Rapid-Amplification of cDNA Ends,RACE)技术和半定量RT-PCR技术,克隆了黄鳝(Monopterus albus)性腺差异表达基因(F64)的cDNA全长序列,分析了该基因于各期性腺组织的表达情况。结果表明,F64基因cDNA全长1 721 bp,含有142 bp的5’-UTR、268 bp的3’-UTR、1 311 bp的开放阅读框(ORF),共编码436个氨基酸;在线SignalP分析表明,F64亚基肽链不存在信号肽,为非经典分泌蛋白;同源性分析结果显示该基因无同源性序列,视为新报道的基因;F64在卵巢发育早期不表达,从排卵的Ⅴ期卵巢开始表达,随着卵巢的败育和精巢的发育,表达量明显升高。     

蕨麻猪生长激素基因的克隆及多态性分析

[目的]探索蕨麻猪生长激素基因与其生理学和生物学特性的关系。[方法]从蕨麻猪血液细胞中提取基因组DNA,通过PCR技术扩增出蕨麻猪生长激素基因序列,进行碱基组成多态性和突变分析。[结果]蕨麻猪生长激素（pGH）基因序列全长1671bp,有5个外显子和4个内含子。外显子1、2、3、4和5的碱基数依次是10、161、117、162和201bp,内含子1、2、3和4的碱基数分别是244、210、192和277bp。除第1外显子和第1内含子碱基剪切有明显的例外,其余全部符合GT-AG规则;蕨麻猪生长激素基因4种碱基含量依次为G〉C〉T〉A。（G＋C）含量和（A＋T）含量分别在62%和37%以上。蕨麻猪编码区第4外显子在＋1046位处A→G,为错义突变,其余均为同义突变。蕨麻猪生长激素基因编码的前体蛋白含216个氨基酸,成熟蛋白是由190个氨基酸残基组成的一个分泌性蛋白;二级结构中含有6个α螺旋结构,三级结构是结构松散的球状蛋白,含有6个α螺旋前区。[结论]为蕨麻猪生长激素基因序列的研究提供了参考依据和借鉴。     

黄鳝性腺差异表达基因的筛选和克隆

运用ACP—DDRT—PCR技术筛选和克隆了黄鳝不同发育时期性腺组织的差异表达基因。结果显示：利用2个随机ACP引物筛选到2个表达差异显著的基因,并对这2条差异表达片段进行克隆、测序分析,获得这2个基因的部分cDNA序列,长度分别为408bp和421bp。同源性分析结果显示其中一个基因与黄鲈卵巢cDNA文库中的一个基因（GeneBankNo．G0657149．1）高度同源;而另一个基因无同源性序列,视为新报道的基因。进一步半定量RT—PCR检测,结果显示：这两个基因在黄鳝卵巢和间期性腺中的表达差异显著,因此推测其在黄鳝性腺发育以及性逆转过程中起着重要作用。     

黄鳝生长激素基因cDNA的克隆及胞内真核表达载体的构建

为大量获得具有生物学活性的黄鳝生长激素,采用RT-PCR的方法从黄鳝脑cDNA中扩增得到了黄鳝生长激素基因。通过特异性的引物扩增后,将黄鳝生长激素基因ORF区域序列连接到酵母胞内表达载体pGAPZB中,构建了重组胞内表达载体pGAPZB—rfeGH。用BlnI线性化重组质粒后,电击转化毕赤酵母GS115。经过Zeocin筛选和PCR扩增转化子基因组筛选,得到了数株基因工程酵母菌,序列测定表明生长素基因已经成功的转移到酵母基因上。黄鳝生长激素胞内表达载体的构建成功为进一步研究黄鳝生长激素基因的功能和大量开发并利用奠定了实验基础。     

黄鳝性逆转差异表达基因F25cDNA的克隆和分析

首先运用组织学手段对黄鳝性腺发育过程进行观察分析,然后运用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了差异表达基因(F25) cDNA,并利用半定量RT-PCR分析了该基因于各期性腺组织中的表达.结果表明,通过光镜观察到性腺发育的8个阶段:Ⅲ～Ⅵ期卵巢、间期性腺、早期精巢和晚期精巢.基因F25在卵巢发育早期不表达,即在Ⅱ、Ⅲ期卵巢中不表达,在Ⅳ期卵巢开始表达,同时随着卵巢发育成熟、排卵、退化及精巢发育,表达量明显升高,由此推测基因F25可能在性逆转过程中起到一定的作用.基因F25 cDNA全长为1 139 bp,共编码257个氨基酸,在线SignalP分析表明,基因F25肽链不存在信号肽,为非经典分泌蛋白,同源性分析结果显示该基因无同源性序列,视为新报道的基因.     

鸭LXRα基因cDNA的克隆及序列分析

为鸭肝X受体α(LXRα)基因表达、结构功能及其在鸭脂代谢信号传导中的相关研究莫定基础资料,以兴义鸭肝脏组织总RNA为模板,采用RT-PCR法对LXRα基因进行扩增测序,分析其序列特征.结果表明:鸭LXRα基因扩增产物克隆拼接的cDNA序列全长为1412 bp(GenBank登录号:FJ966078),编码区(CDS)长1230 bp,包含起始密码子ATG和终止密码子TGA,编码409个氨基酸残基的LXRa锌指蛋白,含有17个磷酸化位点、3个糖基化位点、2个锌指结构(P-box和D-box)和1个配体结合区(LBD),无跨膜螺旋结构,表现出典型的核激素受体超家族的结构特征.鸭LXRα蛋白与哺乳动物和鱼类的LXRα蛋白的同源性为73%～76%,与禽类的同源性高达97%左右,说明LXRα基因在系统进化过程中具有很高的保守性.     

黄鳝性逆转相关基因的表达及定位分析

为研究F25 基因与黄鳝性逆转关系,首先利用荧光定量PCR 技术对该基因在各期性腺组织中的表达量 进行分析,然后利用原位杂交技术合成cRNA 探针对F25 基因进行杂交定位分析。结果显示,F25 基因在II、III 期卵 巢中仅有微量表达,而在IV 卵巢中表达开始迅速增加,同时随着卵巢发育成熟、排卵、退化表达量也呈现不同程度 的升高,在精巢中该基因的表达量达到最大值;经定位分析发现,该基因在早期卵巢中基本不表达,在IV、V 期卵巢 中主要在体细胞中表达,而在精巢雄性生殖细胞中基本不存在F25 基因的表达,由此推测F25 基因可能在性逆转过 程中起到一定的作用,且主要作用于性腺组织中的体细胞。     

小尾寒羊M yoG基因外显子1的克隆及多态性分析

为促进畜禽育种工作的发展,采用测序法和群体遗传学方法进行数据分析,提取12月龄绵羊血液DNA,依据GenBank中羊MyoG基因序列扩增外显子1,研究小尾寒羊肌细胞生成素(Myogenin,MyoG)基因外显子在群体中的多态性。结果表明:在外显子1第211 bp位存在CT的突变,共得到AA、AB、BB三种基因型。绵羊AA、AB、BB基因型频率分别为0.529,0.353,0.118;等位基因A和B的基因频率分别为0.706和0.294;其中AA基因型频率在0.5以上,为优势基因型。纯合度(Ho)为0.584;杂合度(He)为0.416;有效等位基因(Ne)为1.712;多态信息含量(PIC)为0.330,在0.25～0.50,为中度多态。DNAStar软件对片段同源性对比分析发现其与山羊的同源性为99%,与牦牛的同源性为97%,与猪的同源性为92%。     

内蒙古绒山羊CRABP I基因的克隆及表达

【目的】克隆内蒙古绒山羊视黄酸结合蛋白Ⅰ（cellular retinoic acid binding proteinⅠ,CRABPⅠ）基因的cDNA,进行蛋白结构的预测和表达分析,为绒山羊毛和绒形成的分子机理奠定基础。【方法】利用RT-PCR方法克隆内蒙古绒山羊CRABPⅠ基因序列,利用生物信息学方法预测其蛋白结构,采用实时荧光定量PCR探讨该基因在绒山羊4个胎儿日龄皮肤中的表达。【结果】内蒙古绒山羊CRABP I基因cDNA长679 bp（JN936490）,其开放阅读框为414 bp,氨基酸序列与其它物种相比具有较高的序列相似性。CRABP Ⅰ蛋白无明显的信号肽和跨膜区域,不存在N糖基化位点和O糖基化位点;蛋白二级结构主要由α 螺旋、β折叠和少量的转角及无规则卷曲构成。胎儿皮肤中CRABPⅠ基因在 90 d 的表达量明显高于100、120和130 d（P<0.05）。【结论】绒山羊的CRABPⅠ基因cDNA中的开放阅读框（open reading frame,ORF）在不同物种间较为保守,但种属特异性集中表现在第33和123氨基酸残基处,该基因在胎儿期的90 d表达量最大。