牦牛和雄性不育犏牛睾丸中Prm1和Prm2基因表达

为探索牦牛(Bos grunniens)杂交后代(犏牛)雄性不育的分子机制,比较了牦牛及其杂交后代睾丸中两种精蛋白(Prm)基因的表达。从成年牦牛(n=13)和犏牛(n=7)睾丸中提取总RNA,定量PCR分析表明,犏牛睾丸中Prm1和Prm2基因的m RNA水平均极显著低于牦牛(P0.01),这将影响正常精子发生的过程,推测可能与犏牛雄性不育有一定关系。     

牦牛和犏牛睾丸中泛素结合酶基因Ube2n、泛素连接酶基因Trim36表达水平的比较

为探讨蛋白质泛素化与牦牛杂交后代睾丸精子发生异常的相关性,比较了参与泛素化的2种酶基因(泛素结合酶基因Ube2n、泛素连接酶基因Trim36)在成年牦牛和雄性不育犏牛睾丸中的mRNA水平。定量PCR分析显示,牦牛(n=9)睾丸中Ube2n、Trim36基因的mRNA水平分别显著、极显著高于犏牛(n=7),其中Trim36 mRNA水平相差10倍以上。研究结果提示,犏牛睾丸蛋白质泛素化水平明显下降,可能会影响精子发生过程中正常的蛋白质更新。     

牦牛与犏牛睾丸组织转录组、蛋白组比较研究进展

为了解牦牛与犏牛睾丸组织转录组、蛋白组比较研究进展,本文通过检索2012～2020年的相关文献,主要从转录、翻译水平对牦牛与犏牛睾丸组织差异分析归纳。研究发现,转录组学找到了牦牛与犏牛睾丸组织存在的差异及与犏牛雄性不育相关的基因和非编码RNA,发掘了一大批与犏牛精子发生阻滞的相关的差异表达基因;蛋白组学获得了一批表达差异明显的蛋白质,这些差异蛋白在细胞生长、细胞周期、精子发生等方面发挥重要作用。通过牦牛与犏牛睾丸组织转录组、蛋白组比较研究分析,旨在为研究牦牛与犏牛睾丸组织转录组、蛋白组比较及犏牛雄性不育提供基础资料。     

犏牛及其亲本睾丸组织中印记基因SNRPN DMR甲基化与mRNA表达差异研究

【目的】研究犏牛与黄牛、牦牛睾丸组织SNRPN基因DMR甲基化状态、mRNA表达水平的差异,为揭示犏牛雄性不育的表观遗传机制提供依据。【方法】根据黄牛SNRPN基因序列设计引物,通过克隆测序获得牦牛SNRPN基因5'端序列,采用亚硫酸氢钠测序法检测犏牛及其亲本睾丸组织中SNRPN基因5'端DMR的甲基化状态,并采用Real-time PCR检测犏牛及其亲本睾丸组织中SNRPN基因的表达水平。【结果】牦牛SNRPN基因5'端序列长为1137bp,与黄牛的同源性达98.2%;生物信息学分析发现含有YY1和SP1等甲基化敏感位点。犏牛SNRPN基因DMR的甲基化水平(42.22%)极显著高于黄牛(21.08%)和牦牛(20.81%)(P0.01)。黄牛和牦牛睾丸组织中SNRPN基因mRNA表达水平高于犏牛,但未达到显著水平(P0.05)。【结论】犏牛睾丸组织SNRPN基因DMR的甲基化水平极显著高于黄牛和牦牛,且mRNA表达水平低于黄牛和牦牛,说明犏牛SNRPN基因可能是通过DMR区的高甲基化抑制其mRNA表达来阻滞精子发生减数分裂过程。     

BMP4在牦牛和犏牛睾丸组织及支持细胞中的差异表达分析

【目的】从牦牛和犏牛睾丸组织中分离培养支持细胞，检测骨形态发生蛋白4基因（BMP4）及其受体基因在牦牛、犏牛睾丸组织及支持细胞中的表达情况，为深入研究BMP4对犏牛精子发生过程的作用提供理论基础。【方法】采集12月龄牦牛和犏牛睾丸组织，使用Trizol法提取各睾丸组织总RNA，利用RT-PCR技术检测BMP4及其受体基因（骨形态发生蛋白受体1B型(ALK6)、骨形态发生蛋白受体2型(BMPR2)、激活素A受体2A型(ACVR2A)、激活素A受体2B型(ACVR2B)）的mRNA表达水平。通过两步酶法消化睾丸组织制备细胞悬液，经差速贴壁、饥饿处理和胰酶消化分离纯化牦牛和犏牛睾丸支持细胞。采用HE染色、油红O染色、碱性磷酸酶（ALP）染色、免疫荧光染色鉴定支持细胞，用Trizol法提取细胞总RNA，RT-PCR检测支持细胞、生精细胞、间质细胞、类肌细胞标志基因和BMP4及其受体基因的mRNA表达水平。采用实时荧光定量PCR检测BMP4及其受体基因在牦牛和犏牛睾丸支持细胞中的差异表达情况。【结果】HE染色结果显示，第3代（F₃）支持细胞呈长条形或梭形。油红O染色结果显示，体外培养的细胞胞质中有明显脂滴积累，且在细胞核内可观察到支持细胞特有的双极小体结构。ALP染色结果显示，细胞不着色。免疫荧光染色结果显示，支持细胞标志蛋白GATA 结合蛋白4(GATA4）呈阳性表达。RT-PCR检测结果显示，支持细胞标志基因BMP4、SRY-box转录因子9基因（SOX9）、波形蛋白基因(Vimentin)、Wilm肿瘤抑制基因(WT1)、FAS细胞表面死亡受体基因(FAS）和胶质细胞源性神经营养因子基因(GDNF)存在明显表达，而生精细胞标志基因出局区解旋酶4(DDX4)和类肌细胞标志基因半胱氨酸的血管生成诱导剂61(CYR61)无明显表达，间质细胞标志基因细胞色素P450家族11亚家族A成员1(CYP11A1)则有少量表达。BMP4在牦牛和犏牛睾丸支持细胞中都有表达，且在牦牛支持细胞中的表达量显著高于犏牛支持细胞，而其受体基因ALK6、BMPR2、ACVR2A和ACVR2B在牦牛支持细胞中的表达量显著或极显著低于犏牛支持细胞。【结论】从牦牛和犏牛睾丸组织中分离获得支持细胞，BMP4在牦牛支持细胞中表达量较高，暗示BMP4对犏牛精子发生具有潜在调控作用。     

牦牛PRDX5基因的克隆测序及其在牦牛与犏牛睾丸中的表达差异

测定牦牛PRDX5基因序列,并比较其在牦牛和雄性不育犏牛睾丸组织中的表达差异,以探究该基因与犏牛雄性不育的关系。从牦牛睾丸组织中提取总RNA,采用RT-PCR技术克隆并测序获得牦牛PRDX5基因的c DNA序列;利用实时荧光定量RT-PCR技术检测该基因在牦牛与犏牛睾丸组织中的表达情况。结果表明:克隆获得的牦牛Prdx5序列长759 bp,包含长660 bp的CDS区,该序列与普通牛基因相差4个碱基,序列同源性为99.47%,相差的4个核苷酸导致推导的氨基酸序列存在3个氨基酸残基差异;Prdx5在牦牛和犏牛睾丸组织中均有表达,在牦牛睾丸组织中的表达量极显著高于犏牛(P0.01),是犏牛睾丸组织中表达量的6倍,提示Prdx5在犏牛睾丸组织中低水平表达可能与其雄性不育有关。     

犏牛、牦牛睾丸组织中Ghrelin 与GHSR 基因mRNA 表达水平研究

对犏牛、牦牛睾丸组织中生长素(Ghrelin)与生长激素促分泌素受体(GHSR)基因mRNA表达水平进行研究。运用荧光定量PCR方法,检测Ghrelin、GHSR基因在犏牛、牦牛睾丸组织中m RNA的表达水平差异,结果显示:在犏牛、牦牛睾丸组织中,Ghrelin基因m RNA相对表达量犏牛显著高于牦牛(分别为0.8177±0.0225、0.4656±0.0222,P0.05);GHSR基因mRNA相对表达量也是犏牛显著高于牦牛(分别为0.8622±0.0347、0.4722±0.0761,P0.05)。相对于牦牛睾丸组织,犏牛睾丸组织中Ghrelin与GHSR基因m RNA均高表达可能是犏牛雄性不育的原因之一。     

牦牛和犏牛Dmc1基因序列分析及睾丸组织转录水平研究

 【目的】研究牦牛和犏牛Dmc1基因编码区序列、结构和睾丸组织mRNA表达水平,探讨Dmc1基因与犏牛雄性不育的关系,为揭示犏牛雄性不育的分子机理提供参考。【方法】通过PCR扩增和克隆测序获得牦牛和犏牛Dmc1基因部分cDNA序列,运用生物信息学方法分析牦牛和犏牛Dmc1基因编码区序列、蛋白结构和进化关系,利用实时荧光定量PCR技术检测牦牛和犏牛睾丸组织中Dmc1基因mRNA表达水平。【结果】牦牛和犏牛Dmc1基因编码区序列全长均为1 023 bp,编码340个氨基酸,与黄牛Dmc1基因的同源性为100%,与哺乳纲其它物种的同源性在90%以上。牦牛和犏牛Dmc1蛋白含有RecA蛋白家族典型的第二结构域,且与人、鼠Dmc1蛋白结构域一致。系统发育分析显示牦牛、犏牛和黄牛首先聚为一类,后与家犬相聚;人、黑猩猩和猕猴聚为另一类,而与鸟纲动物相聚较远,与经典分类基本一致。定量结果显示犏牛睾丸组织Dmc1基因mRNA表达水平较低,与牦牛差异极显著(P＜0.01),且犏牛表现出来的减数分裂障碍表型与小鼠Dmc1基因突变或敲除的表型一致。【结论】根据生物信息学分析结果推测牛Dmc1蛋白与人、鼠一样,在精母细胞减数分裂同源重组过程中发挥着重要作用;Dmc1基因在牦牛和犏牛睾丸组织中的表达量差异极显著(P＜0.01),结合犏牛雄性减数分裂障碍表型,表明睾丸组织Dmc1基因可能与犏牛的雄性不育有一定的关系。     

牦牛和犏牛Dmrt7基因序列分析及其 在睾丸组织中的表达水平

【目的】研究牦牛和犏牛Dmrt7基因编码区序列和编码蛋白的结构,以及在睾丸组织中mRNA及其蛋白表达水平,探讨Dmrt7与犏牛雄性不育的关系,为揭示犏牛雄性不育的分子机理提供依据。【方法】利用分子克隆技术获得牦牛和犏牛Dmrt7基因编码区序列,并采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的功能位点和二级结构等方面进行了预测和分析;通过半定量PCR技术检测Dmrt7基因mRNA在牦牛各组织器官中的表达水平;利用实时荧光定量PCR技术检测牦牛和犏牛睾丸组织中Dmrt7基因mRNA表达水平;并通过western blotting检测牦牛和犏牛睾丸组织中Dmrt7蛋白的表达水平。【结果】牦牛和犏牛Dmrt7基因cDNA序列一致,包含一个长度为1 113 bp的开放阅读框,编码370个氨基酸,具有完整的DM功能域,二级结构主要以无规则卷曲、α螺旋和延伸链为主。在牦牛各组织器官中,Dmrt7基因mRNA仅在睾丸组织中特异性表达。牦牛睾丸组织中Dmrt7mRNA和蛋白的表达水平极显著高于犏牛（P＜0.01）。【结论】牦牛睾丸组织中Dmrt7基因mRNA和蛋白表达水平明显高于犏牛,且Dmrt7蛋白表达水平与其mRNA表达水平相一致。     

b-Boule基因5′调控序列的克隆与睾丸组织DMR甲基化分析

【目的】研究b-Boule基因5′调控序列的序列特征,以及牦牛、黄牛与犏牛睾丸组织b-Boule基因DMR甲基化状态的差异,为揭示b-Boule基因的表达调控和犏牛雄性不育的表观遗传机制提供依据。【方法】采用PCR扩增和克隆测序技术获得牦牛b-Boule基因5′调控序列,利用生物信息学方法分析b-Boule基因5′调控序列的序列特征,采用亚硫酸氢钠测序法检测牦牛、黄牛与犏牛睾丸组织中b-Boule基因DMR的甲基化状态。【结果】b-Boule基因5′调控序列长度为1 352 bp,核心启动子区含有SP1等甲基化敏感位点,5′端存在一个CpG岛。犏牛b-Boule基因DMR的甲基化水平(17.78%)高于牦牛(7.50%)和黄牛(6.94%)(P<0.01),特别是CpG位点33—35的甲基化水平差异更明显。【结论】犏牛b-Boule基因DMR的甲基化水平高于牦牛和黄牛,结合前期mRNA表达水平和组织学观察结果,认为DMR甲基化在b-Boule基因的表达调控中发挥关键作用,犏牛b-Boule基因可能是通过DMR区的高甲基化抑制其mRNA表达来阻滞精子发生减数分裂过程。     

牦牛和犏牛睾丸组织DDX4基因mRNA表达水平 与启动子区甲基化

【目的】了解牦牛和犏牛睾丸组织中DDX4基因mRNA表达水平和启动子区甲基化状态。【方法】采用real-time PCR技术检测牦牛和犏牛睾丸组织DDX4基因mRNA表达水平,采用克隆测序技术获得牦牛和犏牛DDX4基因启动子区序列,采用亚硫酸氢钠测序法检测牦牛和犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区甲基化状态。【结果】牦牛睾丸组织中DDX4基因mRNA表达水平极显著高于犏牛（P＜0.01）;牦牛和犏牛DDX4基因启动子区1 370 bp,含有核心启动子区（251 bp）和CpG岛（918 bp）。犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区甲基化水平（86.5%）极显著高于牦牛（67.0%）（P＜0.01）。【结论】牦牛睾丸组织DDX4基因表达水平极显著高于犏牛,获得了牦牛和犏牛DDX4基因启动子区序列,且犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区甲基化水平极显著高于牦牛（P＜0.01）。     

牦牛和犏牛DDX25/GRTH基因序列及其在睾丸组织的表达水平

为了解DDX25基因的结构、功能及对犏牛雄性不育的影响。采用RT-PCR技术克隆获得牦牛和犏牛的DDX25基因,对核苷酸序列和氨基酸序列进行生物信息学分析,运用实时荧光定量PCR技术检测睾丸组织DDX25 mRNA的表达情况。结果表明,牦牛和犏牛DDX25基因编码区序列全长均为1 452bp,编码483个氨基酸,氨基酸存在19个磷酸化位点,无信号肽。牦牛睾丸组织DDX25基因表达水平显著高于犏牛,DDX25基因在犏牛睾丸组织的低表达与其雄性不育存在一定关系,该基因可作为研究犏牛雄性不育的候选基因。     

b-Boule基因5′调控序列的克隆与睾丸组织DMR甲基化分析

 【目的】研究b-Boule基因5′调控序列的序列特征,以及牦牛、黄牛与犏牛睾丸组织b-Boule基因DMR甲基化状态的差异,为揭示b-Boule基因的表达调控和犏牛雄性不育的表观遗传机制提供依据。【方法】采用PCR扩增和克隆测序技术获得牦牛b-Boule基因5′调控序列,利用生物信息学方法分析b-Boule基因5′调控序列的序列特征,采用亚硫酸氢钠测序法检测牦牛、黄牛与犏牛睾丸组织中b-Boule基因DMR的甲基化状态。【结果】b-Boule基因5′调控序列长度为1 352 bp,核心启动子区含有SP1等甲基化敏感位点,5′端存在一个CpG岛。犏牛b-Boule基因DMR的甲基化水平（17.78%）高于牦牛（7.50%）和黄牛（6.94%）（P＜0.01）,特别是CpG位点33—35的甲基化水平差异更明显。【结论】犏牛b-Boule基因DMR的甲基化水平高于牦牛和黄牛,结合前期mRNA表达水平和组织学观察结果,认为DMR甲基化在b-Boule基因的表达调控中发挥关键作用,犏牛b-Boule基因可能是通过DMR区的高甲基化抑制其mRNA表达来阻滞精子发生减数分裂过程。     

黄牛、牦牛和犏牛b-Sycp2基因的克隆 与睾丸组织mRNA的表达水平

【目的】克隆黄牛、牦牛和犏牛Sycp2基因序列,了解牛Sycp2基因序列特征和组织表达特征,分析睾丸组织中Sycp2基因的表达水平。【方法】采用电子克隆和克隆测序技术获得黄牛、牦牛和犏牛Sycp2基因序列,利用生物信息学方法分析其序列特征;采用RT-PCR分析牛Sycp2基因的组织表达特征;采用real-time PCR技术检测黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织Sycp2基因的表达水平。【结果】①黄牛、牦牛和犏牛Sycp2基因编码区序列全长均为4 365 bp,命名为b-Sycp2,编码蛋白含有1 454个氨基酸残基,并包含卷曲螺旋结构域等典型结构域;②b-Sycp2基因在睾丸组织中特异表达,黄牛和牦牛睾丸组织中b-Sycp2基因的表达水平显著高于犏牛（P＜0.05）。【结论】成功克隆了b-Sycp2基因,b-Sycp2基因为睾丸组织的特异表达基因,且黄牛和牦牛睾丸组织b-Sycp2基因表达水平显著高于犏牛。     

Proteomic analysis of differentially expressed proteins in poplar leaves induced by Marssonina brunnea f. sp.multigermtubi

Proteomic analysis of differentially expressed proteins in poplar leaves induced by Marssonina brunnea f. sp.multigermtubi     

与黄花马蹄莲互作过程中胡萝卜软腐果胶杆菌的差异表达蛋白分析

通过病原菌胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种与黄花马蹄莲组织的离体互作,运用双向电泳技术、质谱技术及Im-ageMaster 2D platinum 5.0(GE)软件对互作过程中蛋白质差异表达进行分析。结果表明:70个蛋白点在互作中存在表达差异,占蛋白点总数的18.13%。通过质谱分析发现:2个特异表达蛋白分子伴侣DnaK和1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)均为代谢类蛋白;3个显著上调表达蛋白中ATP合酶α亚基和半胱氨酸合酶为代谢类蛋白,而β-内酰胺酶为抗生素类蛋白。     

利用双向电泳分析烯丙异噻唑诱导后水稻的蛋白质变化

本研究应用双向电泳(2-DE)技术分析了烯丙异噻唑诱导后水稻蛋白质的差异表达,所得的双向电泳图谱用PDQuest8.0.1软件进行分析,在诱导4d的双向电泳图谱上找到了10个差异表达蛋白质点,选取其中3个进行质谱(MALDI-TOF-MS)分析,将所得肽段序列在数据库搜索比对后,找到了相匹配的蛋白,它们分别具有泛醌-细胞色素C还原酶、苏氨酸肽链内切酶和苹果酸脱氢酶活性。这些蛋白可能通过提高植物的呼吸作用和启动泛肽依赖性的蛋白质降解途径的活化来参与植物的诱导抗病机制。