大白菜开花相关基因CO的BAC克隆筛选及分析

根据已经公布的大白菜CO基因(Bra008669)序列设计特异引物,采用三维PCR法筛选大白菜BAC文库,获得了3个含有CO的BAC克隆。对筛选到的3个BAC克隆进行PCR扩增,将克隆测序结果与大白菜CO基因进行序列比对,结果表明,相似性达到99.73%,且N端有保守B-BOX结构,C端有保守的CCT结构域,证明所筛选的3个BAC克隆是含有大白菜CO基因的克隆。     

基于FAE1和FAD2基因的油菜种子脂肪酸生物合成遗传调控

脂肪酸延伸酶1基因FAE1和Δ~(12)-脂肪酸脱饱和酶基因FAD2是植物脂肪酸生物合成途径中的两个关键酶基因,在同一甘蓝型油菜品种CY2中对这两个关键酶基因进行单表达和双表达遗传调控获得五种不同类型的具有相同遗传背景的转基因株系。本研究分析比较了种植于相同环境条件下的五类转基因株系及野生型对照的种子脂肪酸组成和含油量,结果表明,两基因单独和双重调控可显著改变油酸、亚油酸、亚麻酸、花生烯酸和芥酸等多种脂肪酸含量,其中两个内源目标基因同时沉默种子中的油酸含量从20.5%提高到了82.8%,拟南芥FAE1基因籽粒特异表达种子中的芥酸含量由43.9%增加到了60.2%。与野生型对照相比,五类转基因种子中的十八碳不饱和脂肪酸相对比率和油酸脱饱和比例均发生了显著变化。此外,增强FAE1基因表达后种子含油量有所提高,而沉默两个目标基因的表达则使种子含油量降低,表明两个关键酶基因调控对油脂合成与积累也产生一定影响。     

大白菜叶片毛刺基因BrLt的EST-SSR定位

本研究以叶面光滑无毛刺大白菜‘501’为母本,叶面有毛刺‘601’为父本构建了F2代作图群体及其F3家系,其表型鉴定结果表明,大白菜叶片毛刺性状是由单显性基因(BrLt)控制的(χ2=3.86,P0.05)。通过分离群体分组分析(BSA)法,筛选出与BrLt基因连锁的1个SSR标记cnu_m400a,以及基于表达序列标签(EST)序列的2个EST-SSR标记,sau_um072和sau_um160。以139株F2个体为作图群体,并以cnu_m400a为锚定标记,将BrLt基因定位于芸薹种A6连锁群。sau_um072、sau_um160和cnu_m400a位于BrLt基因的同一侧,遗传距离分别为2.7cM、3.3cM和7.2cM。BrLt基因的定位将为图位克隆该基因以及研究大白菜叶片毛刺的形成机理奠定基础。     

CRISPR-Cas9系统敲除亚麻FAD2基因表达载体的构建

CRISPR/Cas9系统是一种新型基因编辑工具,准确编辑目标基因,广泛应用于动植物的基因编辑中。本实验构建了油用亚麻品种‘陇亚10号’FAD2基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体,以CRISPR/Cas9基因编辑技术为切入点,根据Gene Bank中公布的FAD2基因序列(DQ222824.1)在FAD2基因外显子部分运用sg RNA在线设计软件CRISPR-P 2.0对亚麻FAD2基因做脱靶分析,在外显子区域选取2个片段作为靶序列进行敲除。以潮霉素作为筛选标记,采用Golden Gate cloning法构建针对‘陇亚10号’FAD2基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体,命名为p YLCRISPR/Cas9-FAD2。将pYLCRISPR/Cas9-FAD2载体导入农杆菌并检测其稳定性,保存菌种以便后期利用农杆菌介导法转化‘陇亚10号’,为深入研究亚麻FAD2基因的功能提供参考。     

大白菜抗根肿病基因定位及连锁标记挖掘

为了明确抗根肿病大白菜材料G6所含抗病基因,开发连锁标记,以高感根肿病的大白菜高代自交系G4、高抗根肿病的大白菜高代自交系G6、G4和G6杂交得到的F_1及F_1自交构建的F_2分离群体为材料,通过人工接种、表型鉴定和遗传学分析,发现该抗病材料中的根肿病抗性由显性单基因控制。进一步扩大F_2群体数量对根肿病抗性基因的初定位,筛选与其连锁的分子标记,利用JoinMap 4.0软件对多态性标记进行连锁分析,获得了5个与大白菜抗根肿病基因连锁的InDel标记,其中最近的两侧标记为BrID10727和BrID10867,与抗病基因的遗传距离分别为4.6,2.5 cM,抗病基因定位在大白菜染色体A08上。此外,经验证发现基于Crr1基因序列新开发的多态性标记BrID10381不在新定位抗根肿基因初定位区间内,因此,可以推断新定位抗根肿基因位点与Crr1并非同一位点,且标记BrID10381可以用于Crr1基因的分子标记辅助选择。     

茶树功能基因分离克隆研究进展

茶叶是世界上最流行的无酒精饮品之一,具有许多生理保健作用。在包括中国在内的许多国家,茶树是重要的木本经济作物之一,它含有许多有价值的次生代谢产物。最近十多年来,茶树分子生物学研究是茶叶科学中最活跃和进展最快的一个领域。分离和克隆重要的茶树功能基因,对揭示茶树优质、高产和抗逆的分子机理,对采用基因工程技术进行茶树遗传调控等都有重要意义。本文介绍了茶树功能基因分离克隆的研究进展,并对今后茶树功能基因的研究提出了展望。     

抗病大白菜新品种胶白8号

胶白8号是青岛市胶州大白菜研究所选育的一代杂交秋白菜新品种.该品种已在全国大面积推广、种植,具有很强的适用性和抗逆性.2002年通过农业部蔬菜品质监督检验测试中心检测,胶白8号高抗病毒病和霜霉病,抗软腐病.2003年通过北京市农作物品种审定委员会审定(京审菜2003003号)     

藜麦FAD2基因鉴定及生物信息学分析

脂肪酸去饱和酶(FAD2)是植物亚油酸合成途径中的关键酶,在植物不饱和脂肪酸合成中起着重要作用。本研究基于藜麦基因组数据库,筛选得到3个FAD2基因成员,包含有典型的脂肪酸去饱和酶结构域。通过生物信息学分析,FAD2蛋白等电点(pI)为8.89～8.97,均属于碱性蛋白质,氨基酸序列长度在369～382之间,分子量范围为44.09～44.62 kD,为亲水性蛋白,亚细胞定位于内质网中。系统进化树分析表明,藜麦FAD2基因家族成员处于同一个亚支,与大豆的亲缘关系最近。启动子元件分析结果显示,FAD2基因启动子含有多个参与干旱、低温、光照、抗逆以及多种激素响应的顺式作用元件和转录因子结合位点,暗示藜麦FAD2家族成员参与多种防御和应激反应。本研究通过生物信息学分析了FAD2基因家族,对进一步研究FAD2基因的功能提供参考。     

水稻落粒基因SH8的精细定位与克隆

落粒性是水稻的重要性状之一,是野生稻种子传播和后代繁衍的重要保障,但是容易落粒在栽培稻的生产中会造成产量损失。目前,在水稻中已经克隆了一些落粒相关基因,但是这些基因并不能解释水稻落粒的全部表型变异。本研究从白谷(Pei-kuh)和普通野生稻(W1944)构建的重组自交系中选取落粒性强且不含有SH4基因的材料E6-5,与Pei-kuh进行杂交构建分离群体,将以前检测到位于8号染色体的落粒QTL精细定位于26.4 kb的区间内,并把该位点的落粒基因命名为SHATTERING8(SH8)。该区段共有4个编码基因,Pei-kuh和E6-5的测序比对发现LOC＿Os08g41950基因在编码区有3个碱基的差异,同时实时定量PCR分析表明该基因在离层部位表达,因此我们把LOC＿Os08g41950作为SH8的目标候选基因。为了验证LOC＿Os08g41950是否参与水稻落粒的调控,我们利用来自E6-5的LOC＿Os08g41950编码序列构建了过表达载体并遗传转化Pei-huh。落粒表型鉴定结果表明,与Pei-huh相比,转基因植株的落粒性明显增强,不仅种子脱落所需的拉力值显著降低,而且还具有更光...     

鸭梨多酚氧化酶基因cDNA全长的克隆和生物信息学分析

为了从分子水平深入了解鸭梨多酚氧化酶结构特点,基于已知的鸭梨多酚氧化酶基因cDNA片段序列设计引物,以鸭梨果实总mRNA为模板,对该基因cDNA 5’端和3’端未知序列进行了RACE扩增,最终获得鸭梨多酚氧化酶基因cDNA全长序列。该序列长度为2126 bp,开放性读码框位于136~1917 bp之间,可编码593个氨基酸残基。对该基因所翻译的氨基酸序列进行生物信息学分析,结果表明基因编码的多酚氧化酶属酪氨酸酶超级家族成员,三级空间结构为可溶性球状蛋白,不具备跨膜结构,在细胞中的定位应该位于类囊体腔中。这些生物信息的获得将为今后应用生物技术开展鸭梨多酚氧化酶的调控从而抑制鸭梨果实褐变提供十分重要的参考资料。     

苎麻COMT基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR法结合cDNA末端快速扩增（RACE）法从苎麻中克隆了与木质素合成相关的COMT基因的全长cDNA序列。所获得的COMT基因全长1318bp,包含一个开放阅读框1098bp,编码365个氨基酸。序列相似性检索结果表明,苎麻COMT全长cDNA与杨树COMT基因的序列同源性达82%,其编码的氨基酸序列与杏的COMT氨基酸序列同源性最高,达93%。同时还检索到该氨基酸序列包含一个O-甲基转移酶的保守结构。     

猪MAPK12基因cDNA的克隆及序列分析

目的 克隆新的猪MAPK12基因全长ORF，分析其生物特性，为进一步研究该酶的功能提供信息资料。方法：以已报道的人及小鼠MAPK12基因cDNA序列为依据，利用电脑克隆策略获得的ESTs设计引物，RT-PCR技术扩增新的猪MAPK12基因ORF序列，将PCR产物直接进行序列测定。分析此蛋白的特性并预测其结构。结果 分离的ORF全长1101bp，编码367个氨基酸，与人鼠氨基酸序列92%同源；利用生物信息学软件分析出此蛋白的理化特性并预测了其一级、二级和高级结构。结论 研究分离的基因片段可命名为猪ERK6，通过分析，获取了该酶的基本信息特征，并与现有的报道结果进行对比分析，为进一步开展猪MAPK12基因的结构功能、表达调控的相关研究奠定了基础。     

富有柿果实ACC合成酶3′末端的cDNA克隆

利用3’RACE的方法对柿果实ACC合成酶基因的3’末端进行扩增,扩增产物克隆到pMD18－T Vector载体上,转化到大肠杆菌感受态细胞DH5a,蓝白斑筛选重组质粒,并对插入片段进行序列测定。结果表明,3’RACE产物长912bp,开放阅读框内核苷酸序列编码251个氨基酸,此氨基酸序列含有ACC合成酶中3个高度保守区,GenBank中登录的DK－ACS1（登录号AB073005）序列只有一个的氨基酸不同。终止子后面的3’非编码区的长度为155bp,其中只有一个核苷酸与DK—ACS1的3’序列非编码区不同。序列分析结果显示,克隆的片段含有5’端GSP Inner Primer和3’端为RACE Inner Primer的引物。     

白菜低温要求型晚抽薹性的相关序列克隆与分析

为了阐明低温要求型晚抽薹的分子机制,本研究利用易抽薹大白菜BY和晚抽薹芜菁"M.M"杂交获得的81个DH系群体为试材,从中选择了6个极早抽薹和6个极晚抽薹的株系分别组成早抽薹池和晚抽薹池.以两池和双亲为样本,以无低温和3～5℃处理25 d后获得的mRNA为模板,反转录为cDNA,利用256对AFLP引物组合进行cDNA-AFLP分析,筛选与晚抽薹性相关的特异片段.对其中3条差异表达、且丰度较高的cDNA片段进行了克隆测序.序列测定和Blast分析表明,p65m47 cDNA片段与C2结构域蛋白基因有80%的同源性,期望值为7e-17,C2结构域蛋白在细胞的信号转导中起着很重要的作用;p66m55 cDNA I片段与拟南芥AT1G32530 cDNA有85%的同源性,期望值为5e-36,它编码蛋白结合位点/泛素连接酶/锌指结合蛋白;p66m55 cDNA Ⅱ片段与拟南芥AT1G65590 cDNA有87%的同源性,期望值为4e-37,它编码B-N-乙酰已糖胺水解酶.     

羊驼垂体催乳素（PRL）基因全长cDNA的克隆及序列分析

[目的]获得并分析羊驼PRL基因cDNA全序列结构,为研究羊驼催乳素（PRL）的各种生物学作用和生产应用提供理论依据。[方法]根据已知的不同哺乳动物的PRL基因cDNA序列,设计羊驼PRL引物,运用RT-PCR方法和cDNA末端快速扩增（RACE）技术获得羊驼PRL基因cDNA全序列。[结果与结论]羊驼PRL基因cDNA序列全长959bp,编码区为687bp,编码229个氨基酸的PRL前体蛋白。预测羊驼PRL蛋白质的空间结构类似人生长激素（GH）,但在81位（成熟肽为51位）为蛋氨酸可能导致蛋白空间结构的不同而影响羊驼PRL的功能;序列比对结果表明,羊驼PRL的 cDNA序列与大多数哺乳动物相似。构建的基因进化树分析结果显示,羊驼PRL与骆驼的亲缘关系最近;同多数哺乳动物一样,羊驼PRL进化速度极缓慢,没有发生人、灵长类、啮齿类、反刍动物的“episodic”式进化。     

荷斯坦奶牛IFN-γ基因的克隆、序列分析及表达研究

利用RT-PCR技术从荷斯坦奶牛外周血淋巴细胞总RNA中扩增IFN-γ(ccIFN-γ)基因,克隆至pMD18-T载体进行测序。测序结果表明,ccIFN-γ基因全长501bp,编码166个氨基酸,其中前23个氨基酸残基构成信号肽序列,后面147氨基酸残基构成成熟肽,其中含有2个潜在的N-链糖基化位点。二级和三级结构预测发现,ccIFN-γ蛋白分子中存在7个的α-螺旋,中间由无规卷曲连接,折叠成由α-螺旋包绕的中空状结构。将ccIFN-γ成熟肽编码区序列进一步克隆至pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。经SDS-PAGE分析,表达出与预期大小(20.6KDa)相符的重组蛋白,占菌体蛋白18.6%。Western blot检测证实表达的融合蛋白为牛IFN-γ,这为进一步开展重组ccIFN-γ生物学活性的研究奠定了基础。     

红果醋栗RrFAD2基因的克隆与表达分析

本研究克隆到红果醋栗(Ribes rubrum L.)脂肪酸脱氢酶2(co-3 fatty acid desaturase,FAD2)基因cDNA全长序列,命名为RrFAD2,GenBank登录号为MT795718。RrFAD2全长1470 bp,开放阅读框序列全长1152bp,编码383个氨基酸。生物信息学分析表明,RrFAD2蛋白具有6个跨膜结构域,分子量为43.92 kD,等电点为8.93。利用荧光定量PCR分析RrFAD2基因在红果醋栗不同组织和种子发育中的表达。结果表明该基因在根、茎、叶、花、果实、种子中都表达,在种子中表达量最高,花和根中最低,具有组织特异性。在种子发育过程中,RrFAD2基因的表达先上升后下降,而种子成熟的晚期(花后80 d左右)表达量达到最高。该研究为解析红果醋栗RrFAD2基因功能和研究醋栗不饱和脂肪酸合成提供理论参考。     

南方根结线虫延长因子2基因cDNA全长克隆和序列分析

以南方根结线虫为材料,根据同源序列法分别进行3′末端和5′末端的RACE,获得延长因子基因2 cDNA全长。此cDNA全长序列为2434 bp,包括2334 bp的完整ORF,编码一含777个氨基酸的多肽。该基因命名为Mi-eft2,其推导蛋白MI-EFT2的编码氨基酸与秀丽隐杆线虫的Ce-eft1,Ce-eft2,Ce-eft3,Ce-eft4基因的推导蛋白的同源性分别为26.7%、86.9%、13.8%和8.9%。蛋白功能分类预测MI-EFT2是一种在蛋白质延长过程中起作用的GTP水解酶,与真核生物的延长因子2功能相同。     

鸡Muslin cDNA克隆与序列分析

基于电子延伸序列,本试验克隆并分析了鸡Muslin基因。肌肉组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD19-T连接后转化E.coliDH5α,检测阳性克隆并测序;克隆的Musclin基因与人、大鼠、小鼠同源性分别为74%,73%,70%,推测的氨基酸序列同源性分别为58%,54%,50%,氨基酸序列含有"KKKR"结构和与小鼠ANP,BNP,CNP蛋白的同源性区域。试验成功克隆了鸡Musclin基因并注册GenBank(EF551041)。