康宁木霉AS3.2774纤维素酶CBH Ⅱ基因的cDNA克隆

采用植物叶总RNA提取试剂盒提取康宁木霉AS3.2774总RNA,根据GenBank已发表的纤维素酶CBH Ⅱ基因序列(DQ504304)设计并合成了1对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增得到康宁木霉CBH Ⅱ基因cDNA,并成功转入大肠杆菌。序列测定结果表明,该基因序列与GenBank发表的康宁木霉CBH Ⅱ基因序列同源性达到99.86%。     

一株驴源奇异变形杆菌的分离鉴定与毒力基因检测

为探明山东聊城地区某驴场驴驹腹泻并死亡的原因,试验采集死亡驴驹的肝脏、脾脏、肾脏等组织病料,采用RT-PCR方法检测病料中的马轮状病毒和马冠状病毒病原,并对病料中的细菌进行分离纯化,通过革兰氏染色、形态特征观察、生化鉴定和16S rDNA基因序列分析对分离菌进行鉴定,并进行药敏试验、毒力基因检测及小鼠致病性试验。结果表明：病料中马轮状病毒、马冠状病毒检测均为阴性,从肝脏组织中分离出一株细菌,该菌在SS琼脂培养基、LB琼脂培养基、血琼脂培养基、MAC琼脂培养基上均能生长,经镜检确定为短杆状或球杆状的革兰氏阴性小杆菌,生化特性与奇异变形杆菌相符。该菌16S rDNA基因序列与GenBank中的10株奇异变形杆菌的核苷酸相似性在99.87%～100%之间,进一步确定该菌为奇异变形杆菌,命名为LC1株(GenBank登录号为ON018729)。LC1株对氨苄西林、诺氟沙星、氧氟沙星、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢噻肟、氨曲南、左氧氟沙星、丁胺卡那、大观霉素、庆大霉素、环丙沙星敏感,对红霉素、克林霉素、亚胺培南、多西环素和多黏菌素B耐药,对头孢氨苄中介。在LC1株中共检测到9种毒力基因,分别为MrpA...     

羊痘病毒PCR检测方法的建立和试剂盒的研制

根据GenBank上已发表的羊痘病毒(CPV)的全基因序列,设计并合成了一对能特异性扩增羊痘病毒的引物,扩增产物大小约为445bp。通过对PCR方法的优化,建立了检测羊痘病毒的PCR方法,并研制出检测试剂盒。同时对试剂盒的敏感性,特异性和稳定性进行了研究。实验结果表明,该试剂盒具有良好的敏感性和特异性,稳定性在-20℃至少可以保存一年。     

犬GM-CSF基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

为了研究犬粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的作用,试验根据GenBank上发表的犬(Canis familiaris)GM-CSF cDNA基因序列设计1对引物,采用RT-PCR技术,以ConA刺激的犬外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出犬GM-CSF基因。结果表明:扩增片段长为435 bp,编码144个氨基酸;生物软件分析结果表明,该序列与猕猴的亲源性更近,与已知人、马、牛、野猪、豹猫、鸡等序列的同源性较低。     

奶牛白细胞介素2基因的克隆及序列分析

根据GenBank发表的奶牛白细胞介素2(IL-2)基因序列,设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增奶牛IL-2基因,琼脂糖电泳显示扩增出的片段约为477bp。回收片段,克隆入pMD18-T载体,经菌落PCR、酶切及重组质粒PCR鉴定,测序结果显示,克隆的奶牛IL-2基因与GenBank发表的奶牛IL-2基因序列同源性为98.7%。该序列与水牛和山羊的IL-2基因序列同源性最大,在95%以上;氨基酸和抗原性比较分析显示,奶牛的IL-2与山羊及水牛的IL-2在这两方面有较高的同源性。     

牛病毒性腹泻病毒和牛冠状病毒双重纳米RT-PCR检测方法的建立及应用

本文建立了一种同时检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛冠状病毒(BCoV)2种病原的双重纳米RT-PCR方法.采用BVDV 5'-UTR基因序列(GenBank登录号:AB040132.1)和BCoV的N基因保守序列(GenBank登录号:KX982264.1)设计出一对BVDV特异性引物和一对BCoV的特异性引物,结...     

1株高致病性血凝性脑脊髓炎病毒的分离与鉴定

利用细胞培养方法从临床表现神经症状的死亡仔猪脑组织内分离获得1株病毒,同时对该病毒进行电镜负染观察、昆明种小鼠致病性试验、RT-PCR检测和部分基因测序分析。电镜观察可见细胞培养物中有大量的直径约115 nm的冠状病毒样粒子;接种病毒的小鼠均出现典型的神经症状,死亡率100%;血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)特异性引物RT-PCR扩增结果阳性;其S基因序列与GenBank中登录的HEV-67 N相应基因序列的同源性高达99.6%。结果表明,分离的病毒为猪血凝性脑脊髓炎病毒,分离株暂命名为HEV-CC-2007。     

中国环颈雉肌苷酸相关候选基因的克隆与序列分析

为了研究腺苷酸琥珀裂解酶(ADSL)基因和次黄嘌呤核苷酸环水解酶(ATIC)基因序列和功能,采用RT-PCR法对这2种酶进行了cDNA序列克隆和分析。结果表明:克隆的基因同源性与GenBank上已发表的禽类核苷酸和氨基酸序列相比较高,与哺乳动物相比同源性较低。     

马流感病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上马流感病毒H3N8 HA和NA的基因序列,设计并合成了扩增HA和NA基因RT-PCR引物及NA基因荧光定量RT-PCR引物探针,经条件优化,建立的HA和NA RT-PCR方法检测下限为10 TCID50;荧光PCR方法检测下限为0.1 TCID50。对H5、H7、H9、H3N1、H3N2、Pi等6种病毒核酸进行扩增,发现具有良好的特异性,显示建立的方法具有高效、快速、特异、灵敏的特点,可用于马流感病毒的检测和监控。     

貉GAPDH基因的克隆与序列分析

根据哺乳动物的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glycera ldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)氨基酸的保守序列,参考犬的GAPDH基因序列,设计一对特异性引物,采用RT-PCR技术,从貉的肝脏中扩增出一段长271 bp的序列。对其序列分析表明:该基因序列与GenBank中已发表的犬的GAPDH基因(GenBank序列号:AB028142,AB038240)同源性为100%。本试验成功地克隆了一段貉GAPDH基因,证实了貉亦存在GAPDH基因且高度保守。     

1株基因Ⅶ型新城疫病毒的生物学特性研究及全基因组序列分析

为研究当前流行的新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）基因型、致病性及其与传统新城疫病毒疫苗株（La Sota等）的核苷酸差异,试验从某发病鸡场病死鸡体内分离到1株疑似NDV毒株,经红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）初步确定为鸡源NDV。参照GenBank公布的NDV F基因部分片段（登录号：JF950510.1）设计1对引物,通过RT-PCR技术扩增分离株的F基因并克隆、测序,测序结果与NCBI中NDV F基因序列进行比对,构建系统进化树并分析其基因型;通过测定鸡胚平均致死时间（MDT）、1日龄鸡脑内致病指数（ICPI）和6周龄鸡静脉致病指数（IVPI）判断病毒致病性;参照GenBank公布的NDV全基因组序列（登录号：JF950510.1）设计9对引物对分离株进行全基因组序列测定,并分析其基因组结构。结果表明,RT-PCR扩增得到F基因长约500 bp,基于F基因构建的系统进化树显示分离株为基因Ⅶ型NDV;MDT、ICPI和IVPI分别为52.8 h、1.675和2.46,表明分离株属于强毒株。全基因组序列分析显示,分离株全基因组全长15 192 bp,与传统La Sota株基因组相比,序列多出6个碱基,核苷酸序列同源性82.8%。本研究成功分离到1株基因Ⅶ型NDV强毒株,且与传统疫苗毒株La Sota的核苷酸序列同源性差异较大。     

猪A型流感病毒RT-PCR的建立及应用

根据GenBank上A型流感病毒M基因的保守序列,设计1对引物,建立了检测猪群中A型流感病毒的RT-PCR方法。试验结果表明,该RT-PCR方法敏感、特异,适于临床样品检测,为猪群中A型流感病毒的临床诊断和流行病学调查奠定了基础。     

禽呼肠病毒套式RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的禽呼肠病毒(ARV)基因组序列,设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为478 bp,内部引物的扩增片段大小为247 bp,建立了适合ARV快速检测的套式RT-PCR方法(RT-nested-PCR).采用该方法对REV毒株进行了检测,均能扩增到247 bp的条带,而禽流感病毒(H9亚型)...     

应用RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒的研究

根据GenBank已发表的猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)N蛋白的基因序列,设计合成1对引物,扩增片段长度为730 bp,在优化RT-PCR反应条件的基础上,建立了检测TGEV的RT-PCR检测方法,并用该方法对疑似TGEV的猪群临床腹泻疾病进行了诊断检测和分析。本研究建立的TGEV检测方法,特异、灵敏、可靠,为该病的诊断和流行病学调查研究提供了技术保障。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

参照国内外已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的ORF7的基因序列及其相关的RT—PCR检测方法设计一对引物,扩增目的片段为535bp。通过对RT—PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性试验,建立了一种PRRSV的RT—PCR检测方法。该方法具有快速、敏感、特异等优点,可用于PRRSV的检测、流行病学调查等。应用此方法对临床样品进行了检测,阳性检出率达66．79／5。     

猪圆环病毒2型山东分离株全基因组的克隆与序列分析

根据猪圆环病毒2型(PCV-2)全基因组序列,设计一对特异性引物,从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)病料中扩增出PCV-2基因组DNA,将基因片段克隆于pMD18-T载体,筛选获得含有相应片段的阳性重组质粒pMD18-T-PCV-2。对筛选出的阳性质粒进行测序。结果表明,PCV山东株的全基因组为1 767 bp,与国内外毒株核苷酸同源性高达99.6%。     

犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上发表的犬瘟热病毒融合蛋白F基因序列,设计合成了1对寡聚核苷酸引物,扩增大小为337bp的目的片段,建立犬瘟热病毒F基因的RT-PCR检测方法。结果表明,该方法具有很强的特异性和很高的敏感性,可作为犬瘟热临床快速诊断的一种方法。     

应用套式RT—PCR检测猪瘟制品中牛病毒性腹泻病毒污染的研究

为建立猪瘟制品中牛病毒性腹泻病毒（BVDV）污染的诊断方法,本研究根据GenBank公布的BVDV全基因组序列,选择BVDV保守性比较高的5′非编码区,利用Olig06．0软件设计了2对特异性引物,建立了检测BVDV的套式RT-PCR方法。该方法极大提高了常规RT-PCR检测方法的特异性和敏感性,重复性好、特异性强、敏感性高,可以准确快速检测出极低含量的BVDV,为动物与疫苗生物制品原辅料中BVDV的快速低含量检测提供了一种简单、特异、敏感、快速的检测方法。     

RT-PCR鉴别小反刍兽疫病毒疫苗株与强毒株方法的建立

根据GenBank中公布的小反刍兽疫病毒的H基因或全基因序列,利用软件Primer Premier5.0设计引物,扩增片段长度为477bp,建立区分小反刍兽疫疫苗毒与基因4系野毒的RT-PCR检测方法,并用于临床检测。结果表明,建立的RT-PCR鉴别诊断方法能特异性区分疫苗株Nigeria75/1与基因4系PPRV,与基因3系、牛瘟病毒、犬瘟热病毒等同属病毒无交叉反应;最低可以检测到浓度为7.7×10-5ng/μL的RNA模板;该方法操作简单,耗时短,可以初步用于临床鉴别诊断。