家蝇基因工程抗菌肽的研究进展

家蝇抗菌肽因具有独特的防御机制且不易产生耐药性而成为国内外科研工作者的研究热点,其在动物疫病防治上的应用也越发引人关注。利用基因工程技术获取家蝇抗菌肽能克服传统方法产量低、耗时长、无法实现大规模生产等缺点,是目前获取家蝇抗菌肽最为有效的方法。对家蝇基因工程抗菌肽的分类、编码基因的获得和表达以及生物活性方面进行了综述,以期为兽医临床早日研制出高效、低毒且不易产生耐药性的新兽药提供参考。     

家蝇抗菌肽的分离纯化及生物学活性

将诱导家蝇提取的家蝇抗菌肽提取物，经凝胶过滤层析和离子交换层析，得到具有抗菌活性的单一峰，质谱结果显示抗菌肽分离物含有4种小肽，相对分子质量678．3～1017．2。家蝇抗菌肽对革兰氏阴性菌（大肠杆菌、巴氏杆菌）的抗菌活性优于革兰氏阳性菌（金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌），对耐药性巴氏杆菌有较强的抗菌活性，对大肠杆菌的MIC为4．2～8．4mg／L，对耐药性巴氏杆菌的MIC为3．8～7．8mg／L。扫描电镜观察发现，家蝇抗菌肽通过损伤细胞壁使细胞质外流而达到杀菌的目的。家蝇抗菌肽对家兔、鸡、猪、小鼠、番鸭、鹅和家鸭红细胞无溶血反应和凝集反应。‘     

抗菌肽的研究进展

抗菌肽在动植物体内分布广泛,是天然免疫防御系统的一个重要组成部分。由于抗菌肽独特的杀菌机制,它不仅能抗多种细菌而且还能抗真菌、原虫、病毒和肿瘤细胞。鉴于抗菌肽的独特优点,抗菌肽已成为现代科学研究的热点。本文就抗菌肽的分类、抗菌机理以及应用前景进行了综述。     

抗菌肽的研究进展

抗菌肽是广泛存在于自然界生物中的具有广谱抗菌、抗病毒、抑制杀伤肿瘤细胞等作用的多肽。本文介绍了抗菌肽的结构,抗菌肽的生物学活性,抗菌肽的作用机理和作用机制,以及抗菌肽的应用和前景。     

动物抗菌肽研究进展

抗茵肽是广泛存在于植物、动物、昆虫中的一类小分子多肽,它具有广泛的抗茵活性的独特性,它极有可能成为新一代抗茵药。本文介绍了抗茵肽的分类及防御素在动物组织中的分类、分布,抗茵肽的抗茵机理及相关的研究进展。     

一种新型家蝇幼虫抗菌肽基因(MDAP-2)的真核表达及抑菌活性检测

利用毕赤酵母表达系统表达新型家蝇抗菌肽MDAP-2基因(Musca domestica antimicrobial peptide,MDAP-2),为其作为新型抗菌物质应用于临床提供实验依据。根据已有的MDAP-2的氨基酸序列,采用PCR技术扩增获得MDAP-2基因,构建真核重组表达质粒pPIC9K-MDAP-2,将线性化的重组质粒电击转入毕赤酵母(P.pastoris)感受态GS115细胞内,将PCR鉴定为阳性的重组酵母菌进行甲醇诱导表达,并采用Tricine-SDS-PGAE检测表达产物的大小,经镍柱亲和层析纯化获得纯度较高的重组蛋白,采用管碟法检测重组蛋白的生物学活性。结果显示,重组质粒pPIC9K-MDAP-2获得高效表达,蛋白分子量为7.8 kD,管碟法检测重组蛋白对大肠杆菌与沙门氏菌均具有体外抑菌活性。MDAP-2基因的成功表达为进一步研究表达产物的生物学及免疫学活性奠定基础。     

抗菌肽的研究进展

抗菌肽是一种广泛存在于生物界的抵抗病原微生物入侵的重要防御分子.它是生物先天免疫的重要防御物质,具有广谱抗菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫及抗肿瘤等生物活性,并且不易产生耐药性,是一类极具潜力的肽类抗生素.文章从抗菌肽的种类、结构特点、作用机制、基因工程等方面阐述了其研究的最新进展.     

抗菌肽研究进展

近年来 ,人们从微生物、植物和动物中分离出多种生物活性肽 ,如抗菌肽、抗氧化肽、抗高血压肽、结合矿物质的肽、神经肽、免疫肽等。在这些生物活性肽中 ,尤其抗菌肽在动物养殖和提高畜产品品质方面具有重要的潜在应用价值。1　抗菌肽的分类1.1　哺乳动物抗菌肽哺乳动物抗菌肽广泛存在于嗜中性白细胞、粘膜和皮肤等。例如 ,在猪肠中存在富含ｐｒｏ -ａｒｇ ,相对分子质量为4719ｋｕ的ＰＲ - 39肽、ＣｅｃｒｏｐｉｎＰ1、有 78个氨基酸残基的ＮＫ -ｌｙｓｉｎ、在猪白细胞中分离出 5个小分子抗菌肽 ,它们仅含16～ 18个氨基酸残基 ;在绵羊中至…     

Cathelicidins类抗菌肽研究进展

论述了动物先天免疫中的重要成分——抗菌肽家族之一的cathelicidins家族的基因结构特点及其表达；生物学活性、作用机理等方面的特点，并对其应用前景做了展望。     

抗菌肽PR-39的研究进展

抗菌肽广泛存在于自然界中,是动物先天免疫的重要组成成分。PR-39是其中一种含有39个氨基酸残基的小分子抗菌肽。文章就PR-39在结构、基因表达和调控、生物学活性等方面的研究进展及其应用前景进行了综述。     

家蝇幼虫双翅肽MdDpt I成熟肽基因的克隆与原核表达

对鸡沙门氏菌诱导家蝇幼虫构建的抑制性消减文库(SSH)中筛选得到的家蝇双翅肽I(Musca domesticaDiptericin I,MdDptI)基因进行克隆、表达,并对表达产物的抑菌活性进行初步研究。以沙门氏菌诱导家蝇幼虫cDNA为模板,采用cDNA末端快速扩增技术(RACE),对MdDptI基因进行扩增,并对扩增产物进行测序和生物信息学分析,进一步去掉信号肽并构建重组表达质粒pET-28a-MdDptI,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。借助亲和纯化获得目的蛋白,并验证目的蛋白的生物活性。MdDptI基因全长为419 bp,包含一个300 bp的完整开放阅读框(ORF),编码99个氨基酸,其cDNA序列与GenBank中登录号为FJ794602.1的家蝇双翅肽基因同源性为95%。构建了家蝇MdDptI基因的成熟肽原核表达质粒pET-28a-MdDpt-I,并获得成功表达,表达产物约为12 ku,与预期结果一致。纯化后的目的蛋白表现出一定的抑菌活性。本试验获得了MdDptI基因的全长序列,构建了原核表达载体,并成功获得表达纯化。     

家蝇抗菌肽天蚕素基因的定点突变和高效表达质粒的构建

运用反转录聚合酶链式反应 (RT PCR)技术从家蝇体内扩增出抗菌肽天蚕素 (cecropin)基因的开放阅读框(ORF) ,与pMD 18T载体重组 ,经限制性酶切片段分析和核苷酸序列分析 ,与GenBank中报道的序列一致。根据此ORF ,重新合成 1对引物 ,并在碳末端进行定点突变 ,加上Asn编码 ,使其末端酰氨化 ,再利用半嵌套式PCR扩增出家蝇cecropin基因的成熟肽 ,与双酶切的酵母表达载体pPICZαA连接 ,经PCR和双酶切鉴定 ,成功构建了分泌型表达质粒。     

家蝇胚胎细胞系染色体制作方法

[目的]探索家蝇胚胎细胞系(MDEC-07114)染色体制作的方法。[方法]以MDEC-07114细胞为材料制备染色体。实验分组:秋水仙素浓度为5、10mg/L组;秋水仙素处理时间为5、6、10h组;预固定组和直接固定组。[结果]秋水仙素浓度为10mg/L、作用时间为5h组,细胞分裂相多,染色体形态好;预固定处理后细胞分散好,染色体形态清晰。[结论]10mg/L秋水仙素作用5h,经预固定处理后制作MDEC-07114细胞染色体效果最佳。     

牛多杀性巴氏杆菌诱导家蝇幼虫抑制性消减文库的构建

采用牛多杀性巴氏杆菌针刺法诱导3日龄家蝇幼虫,提取诱导后的家蝇幼虫总RNA并分离纯化得到高质量的mRNA.运用抑制性消减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建家蝇幼虫差异表达的cD-NA消减文库,并利用反向Northern杂交技术筛选差异表达基因.结果表明,随机挑取的阳性克隆片段大小均在200～750 bp,通过反向Northern杂交共筛选出183个差异表达基因,经BLAST比对分析后鉴定出大量与家蝇免疫防御功能相关的基因和一部分无同源性基因.     

家蝇幼虫溶菌酶II基因的克隆、表达及抑菌活性研究

以本实验室构建的鸡致病性大肠杆菌诱导家蝇幼虫抑制性消减杂交文库(SSH)为基础,对家蝇幼虫溶菌酶II基因(MdL-II)进行克隆,得到全长为532 bp的cDNA片段,其开放阅读框(ORF)与GenBank中登录号为HQ897688.1的MdL-II基因全序列同源性为95%。将MdL-II ORF序列插入到pET-32a(+)表达载体中成功构建重组质粒,其表达产物经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,结果显示约在34 ku处出现表达条带且与目的蛋白大小相符。当诱导温度为37℃,IPTG浓度为0.6 mmol/L时可获得大量可溶性Trx-MdL-II融合蛋白,纯化融合蛋白并进一步检测该蛋白的抑菌活性,结果表明融合蛋白对大肠杆菌和链球菌均有抑菌作用,且对大肠杆菌的抑菌作用相对较强。     

家蝇溶菌酶1基因的克隆、序列分析及原核表达

采用cDNA末端快速扩增技术（RACE）,对鸡致病性大肠杆菌诱导家蝇幼虫抑制性消减文库（SSH）中筛选得到家蝇溶菌酶1基因（（Musca domestica lysozyme-1,MdL-1）进行扩增,测序分析得到一个全长为537bp的cDNA片段,其开放阅读框（ORF）432bp,与Genbank中登录号为AY344589．1基因同源性为96％。构建重组表达质粒pET-32a-MdL-1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,异丙基-β—D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）分析显示。表达产物大小约为34kD,与预期蛋白大小一致。结果表明,利用RACE技术克隆得到MdL-1全长基因并在大肠杆菌中获得了表达,为进一步研究该蛋白的生物学及免疫学活性奠定了基础。     

家蝇基因组文库的构建

从孵化 36 h的蝇蛆中提取基因组 DNA,用限制性内切酶 Bcl 随机酶切 ,回收 10～ 2 3kb的酶切 DNA片段 ,通过匹配粘性末端与磷酸化的 EMBL3Bam H 酶切载体臂连接 ,在体外经包装系统包装成活的重组噬菌体 ,成功地构建了家蝇基因组文库。重组噬菌体转染 KW2 51 宿主菌 ,测定文库效价为 5× 10 4 pfu/m L     

生物活性肽的研究进展

生物活性肽属于多功能因子。随着各种生物活性的不断发现,对其生理功能的不断探究,生物活性肽越来越受到人们的关注。作者对不同来源的生物活性肽,依其不同的生理功能进行了综述,以期为生物活性肽的研发提供参考。