禽流感、新城疫、传染性支气管炎三联没乳剂灭活疫苗的研制

以禽流感病毒（AIV）H5N4株，新城疫病毒（NDV）LaSota株与传染性支气管炎病毒（IBV）M41株为抗原研制了AI－ND－IB三联油乳剂灭活疫苗，并对疫苗的物理性状，安全性，免疫效力，保存期及抗体消长规律进行了检测，结果表明，疫苗在免疫后3周后6个月内，对AIV－H5N4，NDV－北京株的攻击均获全部保护，在免疫后52周内，免疫鸡箅清中AIV－N5N4，MDV，IBV的HI抗体也保持较高的水平，疫苗在4℃保存15个月，其免疫力没有下降。     

三种不同灭活方法对新城疫病毒血凝和RT-PCR试验结果的影响

为研究热灭活、甲醛、β-丙内酯(BPL)三种不同灭活方法对新城疫病毒(NDV)血凝和RT-PCR试验结果的影响,将收获的NDV鸡胚尿囊液分别用浓度为0.1%~0.5%的甲醛37℃灭活24 h或4℃灭活48 h、浓度为0.02%~0.2%的BPL 37℃灭活9 h、60℃热灭活30~90 min,并于灭活前后进行血凝试验和RT-PCR检测。结果表明,用0.02%的BPL 37℃灭活9 h或0.1%的甲醛4℃灭活48 h,不影响NDV的血凝价;采用热灭活30 min或0.02%的BPL 37℃灭活9 h,不影响NDV核酸检测。本研究可为相关病原检测以及诊断制品制备过程中灭活方法的选择提供参考。     

禽肉产品中禽流感与新城疫多重PCR-DHPLC检测方法的建立

应用多重RT-PCR反应(mRT-PCR)结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立禽产品中禽流感病毒和新城疫病毒的快速检测方法。以禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,经优化单相RT-PCR(sRT-PCR)反应体系,建立多重RT-PCR(mRT-PCR)同时检测禽流感和新城疫,其PCR扩增产物经DHPLC技术进行快速检测分析后,检测极限分别达10-0.5ELD50/0.1mL和10-1.5ELD50/0.1mL。与普通凝胶电泳比较,敏感性高2个数量级。特异性试验表明,mRT-PCR-DHPLC仅检测到禽流感病毒与新城疫病毒,而对其他5种禽类病原体和SPF鸡胚尿囊液均未检测到阳性吸收峰。所建立的方法检测不同亚型禽流感病毒29株、不同来源及不同毒力的新城疫病毒16株,结果与实时荧光定量PCR检测结果完全一致;与病原分离法同时检测人工感染鸡的组织脏器,两种方法检测禽流感的符合率为94.4%(34/36),检测新城疫的符合率为95.4%(21/22)。病原分离法的检出率虽高于DHPLC方法,但经统计学分析两者差异不显著,两种方法同时对27份进口鸡胗样品与90份棉拭子样品进行检测,阴性符合率为100%,可适用于进出口禽肉产品的检测。     

汉中市雏鸡群H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒混合感染的血清学诊断

2011年1月至5月陕西省汉中市3个县区20日龄～40日龄的雏鸡群发生了12起疫情,给养殖场(户)造成了很大损失。为明确疫病的分布和流行特点,通过流行病学调查分析、血清学检查,确诊为低致病性H9亚型禽流感和典型新城疫混合感染。     

杀毒霸对禽流感病毒、新城疫病毒的杀灭作用

采用悬浮杀灭试验，以鸡胚鸡染法，研究杀毒霸在1：3000、1：4500、1：6000、1：7500的系列浓度下，与禽流感病毒、新城疫病毒分别作用5、10分钟，对AIV、NDV的杀灭作用。1：3000、1：4500、1：600、1：7500的杀毒霸与AIV作用5分钟，其杀灭率为；100％、100％、99．99％、99．97％；1：3000、1：4500、1：6000、1：7500的杀毒霸与NDV作用5分钟，其杀灭率为：100％、99．99％、99．995％、9．9％；以上浓度的杀毒霸与AIV作用10分钟，其杀灭率为：100％、99．99％、99．98％、99．994％、99．997％。     

鸡新城疫病毒强毒Q-BS株的分离与鉴定

从2003年10月至2004年6月,在河北、辽宁、山东等地区鸡群中大规模发生以神经症状、肠道出血为主的流行性疾病。本文对从河北省某AA肉鸡场的病死鸡中分离的病毒毒株,经过实验室的系统鉴定,证实该分离株具有血凝性,且可被ND标准阳性血清所抑制和中和,不能被AI(H5亚型与H9亚型)标准阳性血清及阴性血清抑制;该分离株的毒价为109.3ELD50/0.1ml,MDT为57.6h,ICPI为1.89,IVPI为2.62,回归试验鸡的临床表现与自然病例基本一致。试验结果证明,该毒株属于嗜神经型新城疫病毒强毒株,并命名为Q-BS株。     

禽白血病病毒感染对新城疫和禽流感疫苗免疫效果的影响

为研究禽白血病病毒(ALV)感染对新城疫(ND)和禽流感(AI)疫苗免疫效果的影响,采用ELISA方法对河南省某地方品种鸡场进行ALV-p27抗原检测,同时采集试验鸡的血清样品,检测ND、AI(H_9)和AI(H_5)亚型的免疫抗体水平,并比较了ALV经种蛋垂直传播感染1日龄雏鸡和后期感染对ND、AI疫苗免疫效果影响的差异。结果表明,ALV经种蛋垂直传播感染1日龄雏鸡,能显著降低ND、AI(H_9)和AI(H_5)疫苗免疫的抗体水平,阳性试验组与阴性组相比血清中ND、H_9、H_5(Re-6)、H_5(Re-7)和H_5(Re-8)抗体效价分别降低1.71log2、2.37log2、1.59log2、1.00log2和1.79log2;鸡群后期感染ALV,对ND和AI疫苗的免疫没有明显的抑制作用,阳性试验组与阴性组相比无显著差异。     

花边鸭新城疫病毒与H9亚型禽流感病毒混合感染的诊断

为确定贵州省三穗县某养鸭场花边鸭突发疫病的病因,通过流行病学调查、临床症状、病理变化、实验室检测,确诊为鸭源新城疫病毒与H9亚型禽流感病毒混合感染。     

Development of a Duplex PCR Assay for Detection of Avian Influenza Virus and Chicken Parvovirus

In order to establish a method to simultaneously detect avian influenza virus (AIV) and chicken parvovirus (ChPV),two pairs of specific primers were designed according to the sequences of AIV M gene and ChPV NS gene in GenBank. The duplex PCR assay was established by optimizing the reaction conditions.The tests showed that this method had high specificity, could simultaneously detect AIV and ChPV and no specific band was amplified for other subtypes avian pathogenic virus. The sensitivity result showed that the lower detection limit of this method was 100 fg. The results of 159 clinical samples were consistent with the sequencing results of PCR positive product. The double PCR methods for detection of AIV and ChPV established in this study had the characteristics of good specificity and high sensitivity, which was of great significance to the prevention control of AIV and ChPV.     

MPAIV、NDV Lasota株分别与较低致病性禽源E.coli的联合感染试验

以 2× 1 0 5EID50 的低致病性禽流感病毒 ( mildly pathogenic avian influenza virus,MPAIV)、2× 1 0 6 EID50 新城疫病毒 L asota株( Newcastle disease virus Lasota strain,NDVL asota)气管内注射 1 0日龄 SPF鸡 ,2 4h后 ,同剂量、同法重复感染一次 ;48h后 ,分别气管内注射较低致病性禽病原性大肠杆菌 1 2 0( O1 8)和 1 73( O2 6 )株 ,2× 1 0 7CFU/羽 ,2 4h后同剂量、同法重复攻毒一次 ,连续观察 1 0d。结果 :MPAIV单独感染组死亡率为 53% ;NDV Lasota株单独攻毒组未见死亡 ;大肠杆菌 1 2 0株单独攻毒组死亡率为 40 % ,1 73株单独攻毒组死亡率为 7% ;MPAIV与大肠杆菌1 2 0株联合攻毒组的死亡率为 87% ,NDV L a-sota株与 1 2 0株联合攻毒组的死亡率为 40 % ;MPAIV与大肠杆菌 1 73株联合攻毒组的死亡率为 80 % ,NDV Lasota株与 1 73株联合攻毒组的死亡率为 2 0 %。     

禽流感病毒与鸡细小病毒二重PCR检测方法的建立

为建立一种能同时鉴别诊断禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）和鸡细小病毒（chicken parvovirus,ChPV）的检测方法,本研究根据GenBank中AIV的M基因和ChPV的NS基因保守序列,分别设计并筛选出两对特异性引物,用于AIV和ChPV的检测。通过优化反应条件,建立了AIV和ChPV二重PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异好,能同时检测AIV和ChPV,对其他常见的禽病病原体均未反应;该法对AIV和ChPV的检测下限均为100 fg;对159份临床样品检测结果与PCR阳性产物测序结果一致。本研究建立的AIV和ChPV二重PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高的特点,对AIV和ChPV的防制具有重要意义。     

禽流感与鸡新城疫免疫距离测定技术的初步研究

鸡禽流感与新城疫免疫评价指标对科学指导家禽疫苗免疫工作意义重大,不仅关系到家禽免疫程序制定与免疫时机把握,更直接关系到家禽的健康生产与经济效益。本文根据近几年鸡禽流感与新城疫免疫抗体监测数据,结合当前禽病的流行情况、病原变异情况、免疫情况、饲养环境变化情况等,通过测定家禽免疫HI距离,研究建立了界差率（Q）指标,同现行的抗体合格率等免疫评价指标相比,通过本指标可以对家禽免疫水平和健康状态作出科学分析和评估,对适时掌握禽流感、新城疫免疫状态和免疫时机做好二者的免疫预防工作意义重大。     

新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备

为制备新城疫病毒HN蛋白的单克隆抗体,本研究采用新城疫病毒CK/AH/100/2010作为免疫原,免疫6~8周龄BALB/c小鼠,3次免疫后取脾细胞与SP2/0融合,用血凝抑制(HI)方法检测筛选,具有HI活性的单抗有6株:PX1-PX6。6株单抗与AIV、EDS等其它具有血凝活性的病毒的交叉血凝抑制试验结果表明,6株单抗具有良好的特异性。间接免疫荧光试验结果表明,PX1、PX3可与新城疫病毒CK/GD/263/2010 HN抗原发生特异性反应,而其它单抗不反应。     

鸭新城疫病毒与番鸭细小病毒二重PCR方法的建立

根据GenBank中新城疫病毒(NDV)L基因和番鸭细小病毒(MDPV)Vp3基因的保守序列,采用Primer Premier 5.0软件设计并合成了2对引物。通过优化反应条件及特异性、敏感性评价,建立了能同时检测鸭源NDV和MDPV的二重PCR方法。该方法对鸭源NDV和MDPV的检测敏感性分别为30和16 fg。同时使用该方法对鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭圆环病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭黄病毒、沙门氏菌、大肠杆菌和禽多杀性巴氏杆菌进行检测,结果显示全为阴性。本研究建立的鸭源NDV和MDPV的二重PCR检测方法,具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于鸭源NDV和MDPV感染的快速鉴别检测。     

复方中药对免疫新城疫和禽流感疫苗三黄鸡抗体产生的影响

1 材料和方法 1.1 材料 试验在浙江省泰顺县三魁镇张逢俊鸡场进行,1日龄三黄鸡在同一条件下饲养至15日龄(在7日龄用La Sota弱毒疫苗滴鼻点眼),体重差异不显著、健康的鸡留作试验用.     

双重RT-PCR同时快速检测H5亚型禽流感病毒和新城疫病毒强毒株

本研究针对AIV H5的血凝素(HA)基因和vNDV的融合蛋白(F)基因设计两对引物,建立了单管同时检测AIVH5和vNDV的双重RT-PCR(dRT-PCR),该方法能在单一反应管内同时检测AIVH5和vNDV,不与其它亚型AIV、弱毒NDV毒株以及其它病原体发生非特异性扩增;对含有AIV H5 HA基因和vNDV F基因重组质粒DNA的最低检测限分别为20.6和406fg,敏感性与单项RT-PCR相同;从样本处理到报告结果仅需5h。对24份临床疑似样本进行检测,AIVH5均为阴性,vNDV阳性18份,PCR产物测序证明为靶基因序列,其具有vNDV F基因的特征性序列,随机选9份vNDV阳性样本接种SPF鸡胚,分离出6株vNDV,病毒分离率为6/9;对100 ELD50的AIV H5N1和100 ELD50的vNDV人工同时感染5日龄SPF鸡的脑、肝脏、肺脏和泄殖腔棉拭子进行dRT-PCR检测,AIV H5的检测率为4/5,3/5,5/5,4/5,vNDV的检测率为3/5,5/5,4/5,3/5,而对H9N2和LaSota毒株实验同时感染样本及阴性对照样本的检测均为阴性。可见本研究建立的dRT-PCR为AIV H5和vNDV诊断、监测、检疫及分子流行病学调查提供了特异性强、操作简单、检测速度快、成本低廉的新方法。     

H3N2亚型禽流感病毒及猪流感病毒感染人肺腺癌细胞后增殖的差异性变化

人肺腺癌细胞A549被H3N2亚型禽流感病毒和猪流感病毒感染后,探讨不同毒株跨种属感染人呼吸道组织的可能性和趋势性。通过观察病毒感染A549细胞后的细胞病变(CPE)、血凝试验(HA)和50%组织细胞感染量(TCID50)来比较不同毒株感染细胞后的复制差异和毒力改变,发现同一亚型不同来源的流感病毒对A549细胞感染和复制能力有较大差异,哺乳动物来源的病毒更有感染人呼吸道细胞的趋势,SW/GX/NS2783/2010有潜在的感染人细胞的能力。感染过程中的细胞因子变化和病毒基因组组成特点是进一步研究的方向,应重点关注具有跨种属感染趋势的流感病毒及其特殊分子决定簇的组成和特点。     

H9亚型禽流感与新城疫重组二联疫苗株的构建与拯救

为研制H9亚型禽流感和新城疫的重组二联活疫苗,从农业部畜禽传染病重点开放实验室2012年分离的H9亚型禽流感病毒中选取一株具有代表性的流行株A/Chicken/Jiangsu/WJ57/2012(H9N2)作为HA基因的供体.在新城疫弱毒LX株反向遗传操作平台的基础上,构建了表达该株H9亚型禽流感病毒HA基因的重组新城疫病毒基因组全长cDNA克隆pLX-H9HAo拯救出的重组嵌合体病毒rLX/H9HA经间接免疫荧光鉴定,并对其生物学特性、安全性和免疫原性进行测定.结果表明:获救的重组病毒呈典型弱毒特征,同时保持了亲本毒株的高滴度生长特性和遗传稳定性,可作为H9亚型禽流感和新城疫二联活疫苗的候选株.     

鸡新城疫病毒与传染性支气管炎病毒同胚培养的试验研究

将鸡新城疫病毒（NDV）和鸡传染性支气管炎病毒（IBV）按一定的稀释比例等量混合接种9~10日龄SPF鸡胚,让其在同一鸡胚中增殖（简称同胚培养）。试验结果表明,用5倍稀释的ND-Lasota病毒液与 5000倍稀释的IBH₁₂₀病毒液等体积混合后尿囊腔接种鸡胚,能在同一鸡胚中正常增殖,接种后96 h收毒,用红细胞凝集试验（HA）测得NDV、IBV两种病毒的血凝价分别为11 log2和12 log2,不低于各自病毒单独增殖的HA滴度,病毒的增殖基本趋于平衡。同时也证实了在合适的培养条件下,IBV对NDV的复制不会产生干扰。     

鸽新城疫病毒的分离鉴定

用SPF鸡胚从疑似鸽新城疫的信鸽饲养场分离到一株新城疫病毒。分离株利用电镜负染技术观察到典型的新城疫病毒粒子。生物学试验表明,该株病毒具有较强的毒力,最小致死量鸡胚平均致死时间（MDT）为68.4小时,1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）为1.375,6周龄雏鸡静脉接种致病指数（IVPI）为1.34,在鸡胚成纤维细胞上能引起细胞病变。动物回归试验证明,分离株能致2月龄鸽死亡。