亚洲璃眼蜱唾液腺差异表达基因文库的构建及分析

从单雌蜱克隆群中挑选未吸血雌蜱60只，随机分成两组。未吸血组直接剖取唾液腺．半饱血组于蜱吸血第5d采集，分离唾液腺。Trizol法提取总RNA，经第一链合成、LD—PCR、RasⅠ酶切、接头连接和抑制消减杂交（SSH）等步骤，获得差异表达基因的cDNA片段。将纯化的cDNA片段与pGEMT—Easv我体连接，转化DH5a，获得204个白色菌落。扩增检查表明，136个克隆含有插入片段，片段大小为250bp-850bm，测出有效序列120个。由10个cDNA片段的RT—PCR检查结果初步断定，本研究消减效果良好。由网上资源分析得：21个片段与其他蜱的基因，19个片段与按蚊、库蚊、钩虫、奥斯特线虫等其他吸血寄生虫的基因，9个与果蝇的基因具有同源性。     

小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱的分子生物学鉴定

本研究旨在建立小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱的分子生物学鉴定方法,并探讨它们的系统发生关系。在新疆、内蒙古从动物体表采集寄生蜱,形态学鉴定后,PCR扩增测序获得3种璃眼蜱的16S rRNA及线粒体色素氧化酶亚基Ⅰ基因(cytochrome oxidaseⅠ,COⅠ)序列后进行同源性分析。用Mega 5.0和Mrbayes 3.2软件分别构建系统进化树,亚洲璃眼蜱、小亚璃眼蜱样本16S rRNA序列与GenBank中已知相应蜱虫16S rRNA序列聚类,而残缘璃眼蜱COⅠ序列与GenBank中已知残缘璃眼蜱COⅠ序列聚类,与形态学鉴定结果一致。在传统形态学分类的基础上,结合分子生物学鉴定方法能简易、准确鉴定小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱。     

亚洲璃眼蜱差异表达新基因P18的克隆和鉴定

为了进行抗蜱和蜱传病疫苗的研究,本实验对亚洲璃眼蜱雌蜱吸血前后唾液腺消减文库中获取的一个全长编码基因P18进行了研究。该基因全长519bp,共编码170个氨基酸,分子量为18.36Ku,等电点为4.28。BLAST分析表明,该基因预测的氨基酸与肩突硬蜱、篦子硬蜱唾液腺的抗凝血小肽有30%～40%低度同源性。将该基因亚克隆到pET-32a( )表达载体,转化BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导,重组融合蛋白以可溶性形式高效表达。将可溶性重组蛋白免疫小鼠后获得的抗血清。经免疫印迹分析表明,该重组蛋白抗体可特异性的识别半饱雌蜱唾液腺中的天然蛋白抗原,而未吸血雌蜱唾液腺中则不显现特异条带。RT-PCR结果进一步证实,该基因在蜱吸血后的唾液腺中差异表达。     

小亚璃眼蜱和亚洲璃眼蜱对环形泰勒虫传播能力的研究

将实验室培养的小亚璃眼蜱（Hyalomma anatolicum anatolicum)和亚洲璃眼蜱（Hyalomma asiaticum asiaticum)清洁幼虫和若虫饲喂于感染环形泰勒虫的牛体，收集饱血幼虫和若虫，用所孵化的若虫和成虫感染试验牛。结果显示，小亚璃眼蜱幼虫、若虫阶级感染，所发育之若虫、成虫均可传播环形泰勒虫；而亚洲璃眼蜱各阶级的传播试验结果均为阴性。     

亚洲璃眼蜱唾液腺新基因GP15的表达和鉴定

将GP15的阅读框序列插入pET32a( )制成重组质粒,通过BL21成功表达出相对分子质量为36 000的蛋白.该蛋白可被His·Bind从细菌裂解物纯化出来,也可为抗融合蛋白抗体所识别.表达形式分析显示,融合蛋白以包涵体形式在大肠肝菌内表达.     

亚洲璃眼蜱P27基因的克隆和表达模式分析

为了进一步研究蜱吸血时唾液腺的基因表达调控机制,并为蜱疫苗的制备筛选功能性抗原,本试验对从亚洲璃眼蜱雌蜱吸血前后唾液腺消减文库中筛选出的一个具有Poly（A）尾的EST序列P27进行了研究。首先运用RACE技术扩增出该基因的5′端,在此基础上设计引物,扩增出该基因全长,此基因全长827bp,其开放阅读框从第35个碱基始至第706个碱基止,预测分子量为27．28ku,等电点4．22。生物信息学结构分析表明该基因含有跨膜区及多个活性位点,可能与细胞内DNA的转录相关;该基因与现有其他基因同源性很小,为一新基因;RT-PCR结果显示该基因在半饱血雌蜱的唾液腺、蜱壳、中肠均有表达,但在壳中表达丰度稍低。本研究克隆的P27基因序列已登录GenBank,序列号为EU180067。     

亚洲璃眼蜱唾液腺一新功能基因的克隆与测序

HaB1是亚洲璃眼蜱雌成蜱唾液腺差异表达基因文库中的一个片段,根据其序列设计引物HaB1-GSP1和HaB1-GSP2,以唾液腺总RNA为模板,RACE法扩增获得HaB1的未知3′-末端。测定该末端序列,进行序列拼接,设计全长引物5-′CCAGTCCGAAGGAAGGGCG-3′和5-′TCTC-CGGGCACGTGAAGTGTC-3′。以cDNA第一链为模板,扩增获得基因全长。经核查表明,该基因为一新基因(登录号AY803896)。     

亚洲璃眼蜱免疫抑制蛋白P36的分子鉴定及重组表达

为了解蜱吸血和病原传播的分子机制,本研究从亚洲璃眼蜱唾液腺中克隆获得一个编码免疫抑制蛋白P36的同源性基因,该基因全长924bp,编码区为708bp,预测的编码蛋白包含235个氨基酸,分子量为27ku。BLAST分析表明,该基因预测的氨基酸与美洲花蜱和安氏革蜱唾液腺中的免疫抑制蛋白P36高度同源。RT-PCR分析表明,该基因在未吸血成蜱中没有表达,但吸血后表达。将目的基因与载体pGEX-4T-1连接后转化BL21表达菌,经诱导后得到GST融合重组蛋白。该实验结果为进一步研究P36奠定了基础。     

麻点璃眼蜱的鉴定及部分生物学特性研究

1999－2000年3－9月份从甘肃省永靖县的绵羊、山羊体表采集蜱842只（雄虫453只，雌虫389只），经鉴定为麻点璃眼蜱(Hyalomma rufipes).该种蜱对山羊的侵害大于绵羊，，一般寄生于羊后肢内侧，肛门周围和母亲外生殖器周围等无毛或毛稀少、毛毛短的部位。经实验室人工饲养，证明该种蜱为二宿主蜱，饱和血雌虫产卵前的生殖滞育期平均39．5d，产卵期平均22．5d，卵孵化平均27d，幼虫从开始吸血到变为饱血若虫19．5d，饱和血若虫蜕皮约37d；成虫活动季节为3－10月份，5－6月份为高峰期，羊在高峰期的感染率达100％。     

羊尤氏泰勒虫一个新生多肽复合物α多肽基因的cDNA文库筛选和测序（英文）

为筛选羊尤氏泰勒虫裂殖子功能基因,用羊尤氏泰勒虫裂殖子提取物免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾脏细胞与鼠骨髓瘤SP2/0-Ag14细胞融合,融合细胞培养上清用酶联免疫吸附法和免疫印记法检测。提取羊尤氏泰勒虫裂殖子mRNA后,进行cDNA合成与文库构建。文库在免疫学噬斑筛选后,将阳性克隆进行测序和序列BLAST搜索。筛选结果显示有两个阳性克隆。所得序列BLAST搜索结果显示,它与12类寄生虫新生多态相关复合物α多肽基因的同源性在39%到78%之间。结果提示,所筛选的序列为羊尤氏泰勒虫裂殖子新生多态相关复合物α多肽基因不完全序列。该研究为今后使用单克隆抗体筛选羊泰勒虫功能性基因提供了参考。     

血清Ⅰ型马立克氏病病毒被膜蛋白UL11在真核细胞内的表达

本研究利用血清Ⅰ型马立克氏病病毒（Marek＇s disease virus serotype 1,MDV-1）被膜蛋白UL11原核表达产物作为免疫原,免疫小鼠制备多抗血清,通过间接免疫荧光试验,结果发现：UL11真核表达时,存在于COS-1和Sf9细胞浆中。而检测MDV的RB1B毒株感染CEF时,却发现UL11高度聚集于空斑中心,且可分布于空斑周围的所有细胞核中。这为研究UL11细胞核内扩散的分子机制,以明确UL11是否参与MDV-1致瘤的过程提供了参考。     

狂犬病病毒磷蛋白在杆状病毒系统的表达及鉴定

为了建立狂犬病毒磷蛋白(phosphoprotein,P)的体外表达系统,本研究将RT-PCR扩增的狂犬病病毒ERA株P蛋白基因克隆于杆状病毒转移载体pFastBacHTA,构建重组质粒pFastBacHTA-P,并转染昆虫细胞Sf9包装形成重组杆状病毒。SDS-PAGE分析显示重组质粒pFastBacHTA-P转染的Sf9细胞中出现了分子量约为42 kDa的蛋白条带,Western blot证实分子量约为42 kDa的蛋白能与抗His的单克隆抗体发生特异性反应,间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)分析进一步显示Sf9细胞表达的P蛋白与抗P蛋白单克隆抗体能特异性结合。这些实验证明,狂犬病病毒P蛋白不仅在Sf9细胞中获得表达,而且具有良好的免疫反应性。狂犬病病毒P蛋白杆状病毒表达体系的建立,为蛋白结构的解析和诊断试剂的研制奠定了基础。     

山东地区3型鸭疫里氏杆菌的分离鉴定及主要生物学特性研究

从山东某地市典型鸭传染性浆膜炎病例中分离得到8株细菌，经过形态与培养特性观察、生化试验、PCR等方法鉴定为鸭疫里氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA），血清型鉴定发现其中的4株为血清3型，其余4株未定型。血清3型WC6株对雏鸭的致病性试验表明，含茵量约为3×10^9CFU／mL的茵悬液，对10日龄雏鸭有较强的致病性，感染后症状典型，死亡明显；法氏囊指数低于对照组，差异显著（P〈0．05）；脾脏指数、胸腺指数都高于对照组，但差异不显著（P〉0．05）；病理组织学变化则以法氏囊与脾脏出现变性坏死等病变为主，胸腺病变略轻。     

兔出血症病毒提纯和多肽的比较研究

我们采用了甘油－酒石酸钿梯度离心、琼脂糖４Ｂ层析和ＤＥＡＥ３２离子交换层析等三种方法提纯兔出血症病毒（ＲＨＤＶ）进行比较，其结果发现ＤＥＡＥ３２离子交换层析效果最好，获得的病毒纯度最高，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗ－Ｂｌｏｔ试验表明，ＲＨＤＶ只有一条蛋白多肽分子量为６１ＫＤ，截然不同于以往国内研究报道的ＲＨＤＶ具有３－６条结构多肽等结果，在国内属首次报道。     

传染性支气管炎病毒非结构蛋白nsp5在真核细胞中的重组表达及鉴定

本文以嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)毒株的RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得IBV非结构蛋白5(non-structural protein,nsp5)基因片段后,构建了杆状病毒重组质粒IBVnsp5-Bacmid。IBVnsp5-Bacmid转染Sf9细胞,获得nsp5重组杆状病毒,经(immunofluorescence assay,IFA)和Western blot检测到转染细胞表达的nsp5蛋白。进一步从感染的细胞中纯化重组蛋白,并用纯化的蛋白免疫小鼠制备了抗nsp5的多抗血清,该多抗血清可检测到IBV四川株SC021202感染的DF-1细胞中特异性的nsp5蛋白。结果表明IBV nsp5在Bac-to-Bac真核表达系统中获得了成功表达,而且具有良好的免疫原性和反应原性。     

NDV小片段多肽F14a的融合表达和应用的研究

将对应NDV强毒株F基因裂解位点附近编码 14个多肽的双链寡核苷酸片段克隆至融合表达载体 pGEMEX 1,构建重组质粒GEMF14a并转化大肠杆菌DE3。将GEMF14a/DE3的融合表达产物免疫兔 ,制备抗多肽抗体。该抗体与NDV强毒株F4 8E9呈ELISA强阳性反应 ,P/N >3 5～ 7 0 ,而与弱毒NDV的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ系呈阴性反应 ,P/N <2 0 ,证明制备的F14a抗多肽抗体是特异的 ,可用于NDV强弱毒株的毒力快速鉴别。     

禽胰多肽粗品对肉鸡生长及血液生长激素、甲状腺激素水平的影响

1日龄粤黄鸡128只 ,随机分为4组 ,在饲喂相同日粮的条件下 ,Ⅰ组饲饮自来水为对照组 ,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组饲饮禽胰多肽(APP)粗品溶液 ,剂量分别为0.58、1.16和2.32mg/只 d。试验期84d。结果表明 :(1)84日龄时 ,各试验组鸡只平均体重均高于对照组 ,其中Ⅱ组显著高于对照组(P<0.05);(2)70日龄时 ,各试验组血浆GH水平均显著高于对照组(P<0.05) ;(3)56日龄时 ,Ⅱ组血浆T4 浓度、Ⅲ组T3 浓度均显著高于对照组(P<0.05)。提示APP粗品可促进肉鸡生长 ,提高血液中GH、T4 和T3 的含量。     

短芒大麦耐盐变异体的筛选与鉴定

从短芒大麦的幼穗、幼胚和成熟胚诱导出愈伤组织,建立了胚性悬浮细胞系,再以悬浮培养细胞为材料,结合诱变剂甲基磺酸乙酯处理,在含盐培养基上筛选,得到耐１．２％ＮａＣｌ的耐盐变异体,将耐盐系转入无盐培养基中培养５代,再转入含盐培养基中,仍具有耐盐性。耐盐系的生理生化分析表明,愈伤组织的耐盐极限在１．５％ＮａＣｌ,耐１．２％ＮａＣｌ的愈伤组织的游离辅氨酸含量为对照的６．６８倍,说明脯氨酸参与了植物组织对盐     

Ⅰ型鸭肝炎病毒vp3基因的截短表达及鉴定

根据I型鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus type 1,DHV-1)A66株vp3基因序列,设计了一对扩增vp3截短基因(-468bp)的特异性引物,将vp3截短基因与表达载体pET-32a(+)连接,构建了vp3截短基因的重组表达质粒pET-VP468。pET-VP468转入表达菌E.Coli Rosetta-gami(DE3)pLysS中,使用IPTG诱导表达融合蛋白Trx-VP468。Trx-VP468经过Ni-NTA亲和层析柱和DEAE-Sepharose阴离子柱纯化,SDS-PAGE电泳结果表明,pET-VP468在大肠杆菌中表达了一个相对分子量约为36kDa的蛋白,免疫印迹试验表明Trx-VP468得到了正确表达。该结果为VP3蛋白的免疫学功能研究奠定了基础。