兔病毒性出血症病毒重组蛋白VP60间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

为建立一种快速的兔病毒性出血症病毒抗体检测方法,本研究以原核表达的重组VP60蛋白作为诊断抗原,建立了检测兔病毒性出血症病毒抗体的VP60-ELISA诊断方法。该方法检测3种常见兔病(兔轮状病毒、仙台病毒和魏氏梭菌)的阳性血清均为阴性;检测灵敏度为1:12800;批内、批间重复性试验的变异系数分别小于4.9%和6.9%。本研究建立的RHDV VP60-ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为RHDV的抗体检测及流行病学调查等快速诊断提供了一种技术手段。     

兔病毒性出血症病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

建立一种检测兔病毒性出血症病毒(RHDV)抗体的间接ELISA方法。对RHDV陕西分离株VP60基因进行原核表达,Western blot分析表达产物的免疫反应性;以纯化的蛋白为包被抗原建立ELISA方法,并对反应条件进行优化。结果表明,VP60蛋白在大肠杆菌中成功表达,产物约为42.34 ku的融合蛋白,具有良好的反应原性;优化的ELISA最佳工作条件为:重组抗原包被浓度2.9μg/mL,37℃2 h后4℃过夜,1%BSA 37℃封闭2 h,待检血清37℃孵育1 h,酶标抗体1∶10 000稀释,37℃作用1 h,37℃显色5 min,临界值为0.340;建立的ELISA方法特异性强、重复性好、敏感性高;临床检测180份样品,与血凝抑制试验的符合率为74.1%,与商品化试剂盒检测结果符合率为94.8%。该方法可用于临床样品的大批量检测。     

兔病毒性出血症病毒间接ELISA抗体检测试剂盒的研制及其临床应用

为了建立一种快速的兔病毒性出血症病毒抗体检测方法,本研究参照已发表的RHDV基因序列,RT-PCR扩增了长约510bp的VP60基因片段,连接PGEX-4T-1表达载体后获得了以包涵体形式表达的重组VP60蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为诊断抗原,建立了检测兔病毒性出血症病毒抗体的VP60-ELISA诊断方法。该诊断方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,为RHDV的快速诊断、免疫兔群抗体监测和实验兔等级检测提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因克隆与序列分析

自感染RHDV致死的兔肝脏组织中提纯病毒，提取病毒总RNA，以RT－PCR方法扩增得到RHDV VP60基因全长片段，克隆到T载体中，经酶切分析及PCR鉴定后进行序列测定。同一毒株不同克隆产物进行3次测序，测序结果已输送到GeenBank中（注册号为AF453761）。将测得序列与GeneBank中记录的RHDV不同分离株进行比较。比较结果表明：各毒株间核苷酸的同源性为91％－98％，氨基酸同源性为94％－99％，氨基酸变异多发生在高变区，进一步证明了毒株的高度保守性，为明确我国RHDV地方株VP60蛋白的分子特征、分子诊断试剂及新型疫苗的研制奠定了基础。     

兔瘟重组VP60蛋白间接ELISA抗体诊断方法的建立

为建立一种快速的兔病毒性出血症病毒抗体检测方法,参照已发表的RHDV基因序列,采用RT-PCR扩增了长约510 bp的VP60基因片段,连接PGEX-4T-1表达载体后获得了以包涵体形式表达的重组VP60蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为诊断抗原,建立了检测兔病毒性出血症病毒抗体的VP60-ELISA诊断方法。该方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,为RHDV的快速诊断、免疫兔群抗体监测和实验兔等级检测提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

兔病毒性出血症病毒 VP60蛋白基因研究进展

兔病毒性出血症病毒（RHDV）是引起兔病毒性出血症（RHD）的病原,严重威胁着世界养兔业的健康发展。在RHDV的感染和免疫研究方面,RHDV 的衣壳蛋白VP60作为具有重要免疫原性的主要结构蛋白备受关注,论文对V P60蛋白基因的结构特征、核苷酸变异情况及在诊断方法建立和疫苗预防研究等方面进行了综述,为RHDV防控相关研究提供有用的参考资料。     

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60与兔肝脏细胞中相互作用蛋白的初步筛选

为鉴定兔出血症病毒(RHDV)在感染兔肝脏过程中与肝细胞膜表面相互作用的靶蛋白,本研究利用SMART文库构建技术构建了兔肝脏细胞的真核表达cDNA重组质粒文库,将其转染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选表达兔肝细胞蛋白的阳性SP2/0细胞.以RHDV-VP60蛋白作为固相包被抗原,经筛选,获得能够与VP60蛋白相互结合的表达性阳性SP2/0细胞克隆.测序表明26个克隆与兔的一些功能性蛋白有较高的同源性,其中包括代谢酶类13个、免疫信号通路受体蛋白5个以及其他细胞膜蛋白等.本研究鉴定的与RHDV VP60具有结合性的细胞蛋白为RHDV感染机制的研究奠定了基础.     

兔出血症病毒Yaan株衣壳蛋白VP60基因的克隆和序列分析

采用RT-PCR方法扩增兔出血症病毒（RHDV）Yaan株衣壳蛋白VP60基因,将扩增片段克隆到pMD 18-T载体上,经酶切及PCR鉴定后测序.结果显示,VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸.将Yaan株与其他RHDV分离株进行比较,结果显示,核苷酸同源性为90.5%～97.5%,氨基酸同源性为94.3%～99.5%,氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区,表明毒株具有高度保守性;同时对Yaan株与国外标准株AST/89的VP60蛋白氨基酸变异及其亲水性、柔性区、抗原区和表面结构进行了比较分析.     

鸭出血症病毒间接ELISA检测方法的建立与应用

为了建立快速检测鸭出血症病毒(DHDV)的血清学方法,本试验利用浓缩纯化的DHDV作为包被抗原,建立了检测DHDV血清抗体的间接ELISA方法,并对各种检测条件进行了优化。试验结果表明,抗原最佳稀释浓度为7.06 μg/孔;最佳包被条件为37 ℃ 1 h后,4 ℃包被过夜;待检血清的最佳稀释倍数为1:25。在优化条件下,阴阳性临界值判定标准为0.44。建立的ELISA方法对鸭瘟病毒、鸭病毒性肝炎病毒、雏番鸭细小病毒和番鸭呼肠孤病毒阳性血清均无交叉反应,结果表明该方法具有良好的特异性。批内和批间重复性试验的最大变异系数分别为0.0221、0.0032,显示该方法具有很好的稳定性,与血清中和试验的符合率为100%。该方法快速、简单、特异性好、重复性好,可用于大批量监测鸭群DHDV血清抗体感染情况。     

兔出血症病毒VP60蛋白真核表达及其免疫原性研究

将兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)衣壳蛋白VP60基因,克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建pcDNA-VP60,并将其转染Vero细胞.间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测pcDNA-VP60在细胞中的表达情况,同时将pcDNA-VP60免疫实验兔,观察血清中特异性抗体变化情况.试验结果表明,本文构建的pcDNA-VP60不仅能在Vero细胞中表达VP60蛋白,而且能够诱导机体产生免疫应答.     

兔出血症病毒缺失突变体的构建及鉴定

为研究兔病毒性出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）衣壳蛋白与病毒侵染性的关系,在RHDV侵染性克隆的基础上,构建了缺失衣壳蛋白（VP60）部分编码基因（5 325-6931 nt）的全长cDNA分子克隆。然后,在体外转录合成RNA,转染RK-13细胞,观察RHDV缺失5 325-6 931 nt区域以后,病毒的侵染性以及病毒复制能力的变化情况。结果表明,5 325-6 931 nt区域缺失以后,病毒的侵染性没有明显改变,但是病毒的复制能力有所下降。可见,该区域含有与病毒复制有关的调控序列或元件。     

兔出血症病毒遗传与变异的分子基础

兔病毒性出血症是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）引起的一种急性、高度致死性传染病,病死率高达100％。近年来,由于该病毒血凝性、抗原性的变异,病毒感染宿主增多,不仅对该病的防控造成了一定的威胁,更造成了严重的经济损失。国内外研究学者对该病毒的基因组结构、基因组编码的产物和功能,病毒的宿主和受体以及病毒变异等相关进行了大量深入的研究和分析,为该病毒的防控和治疗提供了技术基础。本文就RHDV遗传与变异的分子基础作一综述,希望能为深入了解该病毒,以及日后的防控提供一定的理论支持。     

基于新城疫病毒V蛋白鉴别鸡群感染与免疫的间接ELISA方法的建立

本研究以新城疫病毒(NDV)V蛋白羧基端结构域(Vc)的重组蛋白为包被抗原,建立了用于检测NDV V蛋白抗体的间接ELISA方法,并采用该方法检测了鸡群免疫或接毒后血清中的V蛋白抗体水平。结果显示:两组不同NDV灭活疫苗组在免疫后的3周内检测结果均为阴性;两组灭活疫苗免疫3周后再人工感染NDV强毒的鸡群,攻毒后第7、14和21 d,NDV阳性率分别为60%、80%、70%和50%、80%、70%;两组不同的NDV弱毒疫苗免疫组鸡群,仅在免疫后第21 d阳性率分别为20%和10%。以上结果表明,NDV疫苗免疫组与强毒感染组的V蛋白抗体阳性率存在明显差异,本方法可在群体水平上区分新城疫疫苗免疫与强毒感染鸡群,为NDV血清学诊断和流行病学调查提供了一种新的检测手段。     

Egg yolk IgY against RHDV capsid protein VP60 promotes rabbit defense against RHDV infection

VP60 capsid protein is the major structural and immunogenicity protein of RHDV (Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV), and has been implicated as a main protein antigen in RHDV diagnosis and vaccine design. In this report, egg yolk antibody (IgY) against N-terminal of VP60 was evaluated and developed as a new strategy for RHDV therapy. Briefly, N-terminal of VP60 (～250aa) fragment was cloned and inserted into pET28a expression vector, and then the resultant plasmid, pET28a/VP60-N, was transformed into E. coli BL21(DE3) for recombinant VP60-N protein (rVP60-N) expression. Next, the rVP60-N was purified by Ni⁺-affinity purification chromatography and identified by Western blotting with RHDV antiserum. After immunizing the chickens with rVP60-N, the anti-rVP60-N IgY was isolated, and the activity and specificity of the IgY antibody were analyzed by ELISA and Western blotting. In our results, the rVP60-N could be expressed in E. coli as soluble fraction, and the isolated anti-rVP60-N IgY demonstrated a high specificity and titer (1:22,000) against rVP60-N antigen. For further evaluation of the IgY efficacy in vivo, rabbits were grouped randomly and challenged with RHDV, and the results showed that anti-rVP60-N IgY could significantly protect rabbits from virus infection and promote the host survival after a sustained treatment with anti-rVP60-N IgY for 5 days. Taken together, our study demonstrates evidence that production of IgY against VP60 could be as a novel strategy for the RHDV therapy.     

TTMV间接ELISA检测方法的建立

以TTMV重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了检测人TTMV血清抗体的间接ELISA方法,结果显示：抗原最佳包被浓度为1．63μg／mL,37℃孵育1h后4℃过夜;血清稀释度为1：320;酶标二抗孵育时间为37℃60min;ELISA酶标板的临界值为0．211。运用该方法对上海市和辽宁省共计280份血清样品进行检测,阳性检出率分别为34．68％和39．74％。检测结果表明,建立的间接ELISA方法特异性与重复性均较好,为进一步完善TTMV临床诊断方法打下了基础。     

ELISA验证兔铁蛋白重链与RHDV VP60相互作用

为验证本实验室前期实验中初步鉴定的兔铁蛋白重链(FTH)与兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)具有相互作用关系,本研究采用RT-PCR技术从兔肝脏扩增编码FTH基因,并将其克隆至pET-32a(+)中转化大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS中进行表达.重组FTH蛋白(rFTH)经IPTG诱导获得表达,采用Ni-NTA Agarose纯化rFTH.利用纯化的VP60作为ELISA包被抗原检测FTH与VP60的相互作用.结果表明,ELISA检测的OD490nm值与FTH蛋白量呈正相关.本研究进一步验证了FTH与VP60具有相互作用关系.