水产品中弧菌的PCR技术检测研究进展

水产品中副溶血性弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌均是食源性致病菌,对这些菌种灵敏、快速的检测方法对水产品安全以及保护人类健康极为重要.主要综述了水产品中副溶血性弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌的分子生物学检测研究进展.     

实时定量PCR法快速检测水产品中的副溶血性弧菌

副溶血性弧菌是一种广泛存在于水产品中的食源性致病菌,可污染食物,引起严重的食物中毒。利用实时定量PCR方法建立一种快速检测水产品中副溶血性弧菌的方法,根据随机扩增多态性分析(RAPD)鉴定特异性片段,设计特异性引物。采用建立的实时定量PCR方法检测市售水产品20份,检出阳性食品6份,最小检测灵敏度为50 fg DNA,与传统微生物检测结果相比无显著差异。该检测方法特异性强,灵敏度高。     

浙江省海产品中副溶血性弧菌污染情况分析

2011-2012年对浙江省11个市的消费市场中的缢蛏、海带、花蛤、泥蚶、蛤蜊等海产品,参照GB-T 4789.7—200方法进行副溶血性弧菌分离,并用双重PCR法确定该菌的携带情况。230批次样品检测结果显示,有85批次检出副溶血性弧菌,平均检出率为36.96%。     

副溶血性弧菌ELISA快速检测试剂盒的研制

副溶血性弧菌间接ELISA检测试剂盒的主要组成部件,应用试验结果表明该试剂盒检测低限达104 cfu/g,具有良好的稳定性和特异性;检测时间为8 h,大大缩短了检测时间,提高了检测效率,该试剂盒具有一定的实际应用价值.     

湛江市海水鱼中副溶血性弧菌的分离 鉴定及致病性分析

为了解湛江市海水动物副溶血性弧菌的带菌感染率及其致病性,从湛江市水产品市场随机采集海水鱼样品30份,根据中华人民共和国国家标准和进出口标准规定的副溶血性弧菌的检验方法,结合科玛嘉弧菌显色培养基分离试验,对采集样品进行了副溶血性弧菌的分离与鉴定;并用神耐川试验、溶血试验和脲酶试验检测了分离菌株的致病性。结果显示：30份海水鱼样品分离得到10株副溶血性弧菌,检出率为33.33%。其中,神耐川试验溶血强阳性5株,弱阳性2株,阴性3株;在3.5%NaC l兔血琼脂平板上,本试验分离到的10株副溶血性弧菌均呈现较强溶血作用;10株分离菌株脲酶试验均为阴性。     

复合探针实时荧光PCR技术快速检测海产品中 副溶血性弧菌方法的建立

副溶血性弧菌是一种食源性致病菌,海产品和其制品海鲜酱油等最容易被副溶血性弧菌污染,而副溶血性弧菌寄生于鲜虾、海鲜酱油等复杂的食品基质中有时却很难被检测出。以快速检测食品中的副溶血性弧菌为目的,针对副溶血性弧菌的tlh基因,设计引物和复合探针,采用实时荧光PCR方法检测鲜虾和海鲜酱油中的副溶血性弧菌,得出以下结论,该方法检测副溶血性弧菌具有较强的特异性和灵敏度,当鲜虾(固体)中的样品菌含量为10~3cfu·g~(-1)或海鲜酱油中的样品菌含量为10~3cfu·m L~(-1)时,无需增菌培养,即可快速检出。增菌6~8 h即可检出鲜虾(固体)或海鲜酱油(液体)的1cfu的副溶血性弧菌。     

致病性副溶血性弧菌特异性三重PCR检测方法研究

[目的]建立同时检测致病性副溶血性弧菌gyrase、tdh、toxR基因的三重PCR快速检测方法。[方法]用3种基因的特异性引物分别对副溶血性弧菌ATCC33847的模板DNA进行单一扩增,找到各自引物最佳扩增条件;再用3种引物同步对模板DNA进行扩增,通过优化引物浓度、引物间比例以及退火温度,建立最佳扩增体系。[结果]在最佳三重PCR反应条件下,gyrase、tdh和toxR能同时扩增出清晰条带,大小分别为91、269和368 bp。[结论]该研究为致病性副溶血性弧菌的快速检测提供了一种新的技术方法。     

副溶血性弧菌的检测研究

[目的]对toxR进行副溶血性弧菌特异性检测,探讨toxR靶基因能否准确检测副溶血性弧菌,从而消除其他研究者对该基因特异性的疑虑。[方法]采用SN/T1870—2016中副溶血性弧菌toxR的引物探针对副溶血性弧菌和其亲缘关系接近的弧菌标准菌株进行检测。[结果]采用实时荧光PCR方法证实该引物探针只能扩增出副溶血性弧菌,其他弧菌诸如溶藻弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌等未得到扩增。[结论]证实SN/T1870—2016中toxR的引物探针特异性高。该研究可为各检测机构提供数据支持,为副溶血性弧菌的检测与研究奠定更为坚实的基础。     

副溶血性弧菌分子检测与分型研究进展

副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐菌,常通过食用被该菌污染的食品导致食物中毒。该文综述了副溶血性弧菌的分子检测技术如PCR、环介导等温扩增、免疫捕获等,及分型技术如RAPD-PCR、ERIC-PCR、PFGE、核糖体分型、RFLP等,这些方法将为副溶血性弧菌食物中毒提供重要的检测与分型手段,对预防与控制副溶血性弧菌食物中毒具有重要意义。     

水产品副溶血性弧菌不同增菌液增菌效果的比较

[目的]对用不同方法检测水产品副溶血性弧菌的不同增菌条件进行比较,以期寻找一种快速高效的增菌条件,为提高检测效率提供聋考依据。[方法]采用FDA、ISO、GB／T4789．7-2003、GB／T4789．7-2008、SN0173等方法中的培养基配方,时副溶血性弧菌进行杂种培养,并通过生长曲线测定方法比较验证使用培6-基的增菌效果。[结果]结果表明,含3％NaCl的碱性蛋白胨具有最好的增菌茵效果。[结论]该结果对于检测水产品中副溶血性弧菌具有重要的指导意义。     

应用斑点ELISA技术检测副溶血弧菌

研究了应用斑点酶联免疫吸附试验(Dot-Enzym e L inked Immunosorbent Assay,Dot-ELISA)技术检测副溶血弧菌Vibrio parahaem olyticus的方法。根据棋盘试验,确定副溶血弧菌免疫血清最佳工作浓度为1∶200,酶标抗体最佳工作浓度为1∶100,以出现明显清晰斑点者判定为阳性。用该方法检测时,副溶血弧菌呈阳性,哈维氏弧菌V.harveyi、嗜水气单胞菌Aerom onas hydrophila、河流弧菌Vf.luvialis biotype、溶藻弧菌V.alginolyticus、大肠杆菌Escherichia coli均呈阴性。斑点ELISA方法不仅具有快速、经济的特点,而且可用肉眼直接判定结果,适合在基层单位应用推广。     

建立PC-PCR法快速、半定量检测养殖环境和水产动物中的致病性副溶血弧菌

以tl为靶基因,将菌落PCR技术和平板菌落计数法相结合,建立致病性副溶血弧菌快速、半定量检测方法。PCR扩增的目的片段为673 bp,人工污染样品检测最低限固体样品为3.1×102cfu/g,液体样品为1.3×102cfu/mL,菌落PCR每反应体系的检测低限为90 cfu。对人工污染样品的检测结果显示,PC-PCR方法检测结果与常规检测结果一致,可用于养殖环境及水产品中细菌的动态监测。     

致对虾肝胰腺坏死病副溶血弧菌荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种对虾急性肝胰腺坏死病（Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease）病原菌副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus, VpAHPND）荧光定量 PCR 检测方法,对该病进行快速检测。【方法】根据副溶血弧菌基因保守序列设计特异性引物和探针,经优化反应体系及条件,建立检测 VpAHPND 的荧光定量 PCR 方法;以重组质粒为标准品制作标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。【结果】该方法定量范围宽,起始模板浓度范围为 2.3×101 ~2.3×107 拷贝 /μL 时,标准曲线具有良好的线性关系;最低检测限为 2.3 拷贝/μL,与对虾其他病原菌及病毒无交叉反应,重复试验变异系数为 0.45%~0.69%,可在 1 h 内完成样品检测;对临床对虾样品的检测结果表明,该方法与世界动物卫生组织（OIE）推荐的套式 PCR 法检测结果一致。【结论】应用 TaqMan 探针建立的检测 VpAHPND 的荧光定量 PCR 方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好的特点,可有效用于临床对虾样品的 VpAHPND 检测。     

多重PCR检测四种食源性病原弧菌

【目的】建立在扩增内标存在下同时快速检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌4种食源性致病菌的五重PCR方法。【方法】以细菌16S rRNA基因为扩增内标靶序列,针对溶藻弧菌gyrB基因、副溶血弧菌collagenase基因、创伤弧菌vvhA基因、霍乱弧菌ompW基因,分别设计特异性引物,建立多重PCR体系,对其灵敏度和特异性进行评价,并将建立的五重PCR应用于弧菌的筛选。【结果】建立的多重PCR检测体系对混合模板中副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌的灵敏度达10 CFU/mL,霍乱弧菌的灵敏度达105 CFU/mL,经特异性评价证实其特异性好,并能有效指示PCR反应的假阴性,将建立的多重PCR应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够快速、灵敏、准确地检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌4种食源性致病菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,适用于食品中常见致病性弧菌的快速筛检。     

副溶血弧菌在玻璃器皿上的粘附及去除

[目的]研究副溶血性弧菌在玻璃器皿上的粘附及去除技术.[方法]以栽玻片模拟厨房中的玻璃类和陶瓷类厨具,选用酒精、醋酸及乳酸链球菌素作为抑菌剂对人工污染粘附到载玻片上的副溶血性弧菌进行处理,通过观察副溶血性弧菌在栽玻片上的存活数和去除率考察3种抑菌剂及其协同抑菌作用.[结果]载玻片上粘附的副溶血性弧菌的活菌数经生理盐水和不同浓度的酒精、醋酸和乳酸菌链球菌素作用后均有一定程度的降低,抑菌剂组残留的活菌数（残留率）明显低于生理盐水对照组,各抑菌组的抑菌能力均随着抑菌剂浓度的增加而增强.协同抑菌试验结果表明,pH 4.0、35％酒精、1.0 g,/L乳酸链球菌素的组合能有效抑制副溶血性弧菌在玻片上的粘附,具有良好的协同效应.[结论]副溶血性弧菌在玻璃器皿上有一定的粘附力,但酒精、醋酸和乳酸菌链球菌素具有较好的除菌效果.