牛病毒性腹泻病毒E2基因在毕赤酵母GS115中的表达与鉴定

将牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea-mucosal disease virus,BVDV)河北分离株HB-bd毒株E2基因去除跨膜区获得sE2基因,将sE2基因克隆入巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)分泌型表达载体pPIC9K中,筛选培养后提取阳性重组质粒,经酶切和PCR鉴定,命名为pPIC9K-sE2。重组质粒pPIC9K-sE2经SalⅠ酶切后,电穿孔导入P.pastorisGS115基因进行整合,使外源基因sE2稳定地整合到P.pastoris染色体中,G418筛选得到阳性高拷贝转化子GS115-pPIC9K-sE2。经甲醇诱导表达后,sE2融合蛋白获得了表达,表达产物经SDS-PAGE、Western-blot和Dot-ELISA分析,确定其表达的sE2融合蛋白相对分子质量大小为37 000,且具有天然蛋白的抗原特异性。免疫活性研究证明,P.pastoris表达的sE2蛋白能刺激动物产生抗体。     

牛白细胞介素-2在毕赤酵母中的表达

将编码牛白细胞介素-2(BoIL2)成熟肽的cDNA克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZB中，构建出含BoIL2基因的重组质粒BoIL2-pPICZB。将经Sac Ⅰ酶切后线性化的BoIL2-pPICZB电转化到巴斯德毕赤酵母X-33中，转化子经高浓度Zeoein抗性筛选鉴定后，用1％甲醇诱导目的蛋白表达。经SDS-PAGE及Western blotting检测，表明BoIL2在酵母中获得了胞内表达；通过金属螯合亲和层析(MCAC)获得纯化的重组蛋白；培养小鼠CTLL2细胞进行活性检测，证实所表达的重组BoIL2具有生物活性。     

猪IL-2基因在毕赤酵母中的高效表达及生物活性分析

本研究根据密码子偏爱原则设计猪IL-2引物,克隆其基因后构建pPIC9k-IL-2重组表达载体,线性化后电转化毕赤酵母GS115,获得优化密码子的重组酵母转化子;再用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,不同条件下进行甲醇诱导表达。结果表明:经PCR鉴定IL-2基因已整合到酵母基因组中。表达产物经SDS-PAGE电泳分析发现相对分子质量为16、20ku两条目的蛋白表达带,脱糖基化分析表明目的蛋白得到了适度的糖基化修饰,Western blotting分析显示表达的蛋白具有良好的免疫反应性,分子筛纯化可以获得纯度为95%的蛋白质,淋巴细胞增殖活性分析表明所得的蛋白质具有促淋巴细胞增殖的活性。毕赤酵母表达系统可以高效地表达具有生物活性的重组猪IL-2蛋白分子。     

猪流行性腹泻病毒S1基因在毕赤酵母中的表达

为了研制一种能够高效表达猪流行性腹泻病毒S1主要抗原表位基因的新型疫苗,将S1主要抗原表位基因整合到酵母表达载体pPICZαC中,构建了重组质粒pPICZαC-S1,对重组质粒经Sac Ⅰ酶切线性化后通过电转化法转化到毕赤酵母X-33中,经Zeocin^TM抗性筛选后得到阳性转化子(pPICZαC-S1),转化子接种培养基后用甲醇进行诱导,并对诱导结果进行SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定。结果表明,纤突蛋白主要抗原表位在毕赤酵母中成功分泌表达,表达的蛋白分子质量为42 ku,且能够与PEDV阳性血清特异性结合。     

土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR技术从土耳其斯坦东毕吸虫（Orientobilharzia turkestanicum）成虫总RNA中扩增磷酸丙糖异构酶基因（TPI），鉴定后将目的片段与毕赤酵母表达载体pPIC9k连接，构建重组表达质粒pPIC9k-TPI，并将其电击转化到毕赤酵母GS115中，重组菌株经甲醇诱导后表达的TPI蛋白，经SDS-PAGE、Western-blotting检测，并利用葡聚糖凝胶层析柱纯化。结果显示，成功地克隆了土耳其斯坦东毕吸虫TPI；重组毕赤酵母表达了分子质量为43ku的TPI蛋白；葡聚糖凝胶层析过滤得到单一的TPI蛋白。     

抗菌肽Cecropin AD在毕赤酵母中的组成型表达及中试发酵研究

构建表达抗菌肽Cecropin AD蛋白的真核重组表达质粒pGAPZα-A-CAD,并转化酵母菌Pichia pastoris X-33,Zeocin抗性筛选阳性重组子,通过PCR鉴定、Tricine-SDS-PAGE分析和琼脂孔穴扩散法筛选获得抗菌肽CAD组成型表达菌株,并采用pH-溶氧监控策略进行工程菌Pichia pastoris X-33/pGAPZα-A-CAD的50 L中试发酵研究。结果表明,本实验成功实现了抗菌肽CAD在毕赤酵母Pichiapastoris X-33中的组成型表达pGAPZα-A,Tricine-SDS-PAGE分析显示在4.0 kDa处有明显的目的条带,工程菌经50 L发酵罐培养48 h后收获的上清液,100℃热处理10 min后,对金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC25922等均有明显的抑杀作用。抗菌肽的组成型表达方法在本研究中得到了成功应用,中试研究为以后的规模化生产和应用奠定了基础。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因在酵母中的表达

为探索猪圆环病毒Ⅱ型(PCVⅡ) ORF2基因的高效表达,将ORF2基因整合到酵母表达载体pPICZαC中,构建重组质粒pPICZαC-ORF2,通过SacⅠ酶切线性化,经电穿孔法转到毕赤酵母菌SMD1168。经Zeocin^TM抗性筛选得到转化子,通过SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定,结果表明衣壳蛋白在酵母菌中成功分泌表达。     

潮霉素抗性基因筛选标记质粒的构建及LL37的表达

为了实现以潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)为选择标记的质粒在毕赤酵母中高效表达抗菌肽LL37,在pGAPZαA质粒的基础上,通过EcoRⅤ、BamHⅠ双酶切将Zeocin抗性基因替换成潮霉素磷酸转移酶基因,获得的表达质粒命名为pGAPHαA。根据LL37氨基酸序列,通过毕赤酵母密码子偏嗜性改造,合成的LL37基因片段克隆到pGAPHαA质粒中,获得重组分泌型表达质粒pGAPHαA-LL37,线性化后电击转化毕赤酵母SMD1168,经潮霉素B筛选阳性转化子。72 h表达上清LL37蛋白含量约为167 μg /mL,表达产物耐热性好,对大肠杆菌DH5α、猪链球菌最小抑菌浓度分别为2.94、7.06 μg/mL。     

鸡β干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒活性测定

为研究鸡β干扰素（chicken interferon-β,ChIFNβ）蛋白在毕赤酵母中的表达及其抗病毒活性,将克隆的ChIFNβ基因亚克隆至酵母表达载体pPICZα-A中,构建重组质粒pPIC-ChIFNβ。将鉴定正确的质粒pPIC-ChIFNβ线性化,通过电转化整合到毕赤酵母菌株X-33基因组中,得到阳性菌株。经1.0%甲醇连续诱导4 d,表达产物利用SDS-PAGE电泳、细胞病变抑制法等进行分析。ChIFNβ在酵母中获得了分泌型表达,表达产物分子质量约为17 ku。表达产物以细胞病变抑制法检测其活性,效价为10^7.5 U/mL;在鸡胚中能有效抑制禽流感病毒H9N2的增殖。动物攻毒保护试验结果显示,表达的蛋白可提供70%的免疫保护。表达的ChIFNβ蛋白具有较好的抗病毒活性,本研究可为ChIFNβ的应用提供重要参考。     

鸡IL-18酵母表达载体的构建及表达条件的优化

应用PCR技术从含有罗曼鸡白介素18全长基因质粒pMD18-T-ChIL-18中扩增出鸡IL-18成熟肽基因,亚克隆于毕赤酵母表达载体pPICZαA上,构建了重组质粒pPICZαA-ChIL-18。经酶切、PCR和测序鉴定正确后,电转化入毕赤酵母菌X-33,筛选多拷贝单克隆进行诱导表达,并进一步分析了培养液pH值、诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度对重组菌表达水平的影响,从而获得最优化的表达条件。结果表明,重组毕赤酵母菌能够表达鸡IL-18,且在培养液pH6.0,甲醇诱导浓度1.5%,诱导温度26℃的条件下诱导96 h,目的蛋白的表达量最高,可占菌体总蛋白的60.2%。本文为鸡IL-18的规模化发酵生产奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫真核起始因子3d基因的酵母表达分析

在毕赤酵母真核表达系统中表达柔嫩艾美耳球虫真核起始因子3d(Emeria tenella eukaryotic initiation factor 3d,EteIF3d)基因,并获得具有天然构象的活性蛋白。将EteIF3d基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,将构建正确的重组质粒通过电激转化入酵母细胞GS115,用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选,获得含重组质粒的酵母表达细胞。在含1%甲醇的BMMY培养基中诱导培养,收集1~3 d的表达上清。表达产物进行SDS-PAGE检测,并用Western blot进行免疫学分析。结果表明,本研究成功构建了重组质粒pPIC9k-EteIF3d,并成功表达该蛋白,且该蛋白能与兔抗EteIF3d血清特异性结合,具有良好的抗原性。EteIF3d基因可在真核表达系统毕赤酵母中表达,且获得蛋白具有抗原性,从而为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定了基础。     

猪乳铁蛋白N叶(PLF-N)在毕赤酵母中的表达及抑菌活性鉴定

根据猪乳铁蛋白N叶(PLF-N)的蛋白序列和毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子的偏嗜性,通过全基因合成法合成改造后的PLF-N基因片段,将其克隆到pGAPZα-A质粒中构建分泌型重组酵母表达载体 pGAPZα-A- PLF。pGAPZα-A- PLF 通过限制性内切酶Avr Ⅱ酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞SMD1168内。PCR检测结果发现,PLF-N基因与毕赤酵母染色体稳定结合,Zeocin抗性筛选,得到高拷贝转化子。在GAP启动子调控下,PLF-N重组蛋白获得分泌表达,其分子质量约为38 ku,上清表达量约为364 μg/mL。琼脂糖孔穴扩散法检测结果显示,该表达产物对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较好的抑菌活性,且对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度(MIC)分别为12.5、25.0 μg/mL。     

枯草芽孢杆菌木聚糖酶Xyn B在毕赤酵母中的表达

编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis strain GD3b)木聚糖酶(Xylanse B,Xyn B)基因从重组载体pUC-XynB中切割,并克隆到pPICZa A载体中,经酶切和测序鉴定,成功构建了分泌型毕赤酵母表达载体pPICZa-Xyn B。载体经线性化后转入毕赤酵母X-33,并筛选获得可通过甲醇诱导分泌表达Xyn B重组蛋白的毕赤酵母工程菌X-33/Xyn B。     

大麦芽阿魏酸酯酶的分离纯化及其部分酶学性质的测定

本试验采用硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE-52离子交换层析对大麦芽中的阿魏酸酯酶(FAE)进行了分离纯化,并测定了其部分酶学性质。结果显示,分离纯化后获得了阿魏酸酯酶纯品,纯化倍数达34倍;经SDS-PAGE电泳显示为单一条带,并测定其相对分子质量约为29.3 ku;最适反应温度为50℃;最适pH为5.5,但阿魏酸酯酶在60℃以下,pH 4.5~7.5之间有较好的稳定性;Zn2+、Cu2+、Fe3+对酶活有很强的抑制作用,Na+和EDTA对酶有一定的激活作用。     

J亚群禽白血病病毒gp85基因在毕赤酵母中的分泌表达

为获得J亚群禽白血病病毒gp85蛋白,将gp85基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K,构建了pPIC9K-gp85表达载体。将鉴定正确的表达载体经Sal Ⅰ酶切线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,经MD及G418抗性平板筛选后挑取阳性克隆进行PCR鉴定,获得重组酵母菌株GS115/pPIC9K-gp85。对阳性重组菌进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE、Western blotting和Dot-ELISA分析,结果表明,gp85基因在毕赤酵母中获得分泌表达,表达产物与J亚群禽白血病病毒多克隆抗体有良好的反应活性,分泌表达量达40 mg/L。本研究为J亚群禽白血病病毒诊断方法的建立及gp85蛋白的深入研究奠定了基础。     

毕赤酵母Mut+和Muts重组子表达植酸酶基因及其表达物的酶学性质比较

将重庆市草食家畜与牧草重点实验室已成功构建的植酸酶基因表达载体pPIC9K-phyA酶切线性化后,通过原生质体法整合到巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115菌株细胞中,利用测定酶活、观察转化子在MM和MD平板上的生长情况以及PCR菌落鉴定,筛选出表型为甲醇利用缓慢型的重组子(His+Muts)。在相同培养条件下比较甲醇利用缓慢型的重组子和Mut+重组子在表达植酸酶方面的异同。实验结果表明,诱导表达48h后,Mut+和Muts重组子表达的产物在SDS-PAGE胶上都出现了清晰的目的带。酶学性质测定表明,酶学性质无显著差异。     

黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母X33中的高效表达

为高效表达黑曲霉糖化酶基因,根据GenBank中糖化酶的氨基酸序列(登录号:AY652617),选用毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏嗜性,全基因合成新的cDNA序列。改造后的基因克隆到pGAPZαA质粒中,获得重组分泌型酵母表达质粒pGAPZαA-EC,经限制性内切酶Bln Ⅰ酶切线性化后,电击转化入毕赤酵母细胞X33内。经高浓度博莱霉素抗性筛选,得到高拷贝转化子,PCR检测结果显示,糖化酶基因与毕赤酵母染色体稳定结合。糖化酶蛋白获得分泌表达,SDS-PAGE分析其分子质量约为80 ku,其表达量约为180 mg/L。表达产物经Starch-PAGE活性染色,显示其具有酶学活性。     

一种新型家蝇幼虫抗菌肽基因(MDAP-2)的真核表达及抑菌活性检测

利用毕赤酵母表达系统表达新型家蝇抗菌肽MDAP-2基因(Musca domestica antimicrobial peptide,MDAP-2),为其作为新型抗菌物质应用于临床提供实验依据。根据已有的MDAP-2的氨基酸序列,采用PCR技术扩增获得MDAP-2基因,构建真核重组表达质粒pPIC9K-MDAP-2,将线性化的重组质粒电击转入毕赤酵母(P.pastoris)感受态GS115细胞内,将PCR鉴定为阳性的重组酵母菌进行甲醇诱导表达,并采用Tricine-SDS-PGAE检测表达产物的大小,经镍柱亲和层析纯化获得纯度较高的重组蛋白,采用管碟法检测重组蛋白的生物学活性。结果显示,重组质粒pPIC9K-MDAP-2获得高效表达,蛋白分子量为7.8 kD,管碟法检测重组蛋白对大肠杆菌与沙门氏菌均具有体外抑菌活性。MDAP-2基因的成功表达为进一步研究表达产物的生物学及免疫学活性奠定基础。     

禽传染性支气管炎病毒S1基因毕赤酵母表达载体的构建

本试验根据已公布的IBV株S1基因序列及pPIC9K表达载体序列，去掉由18个氨基酸构成的信号肽后，设计一对IBV S1基因表达片段的PCR引物，利用RT—PCR扩增得到了IBV四川分离株的S1基因片段，将该片段克隆到PMD18-T载体上，通过对所得到的重组质粒进行酶切分析、菌落PCR鉴定，证明得到了含有目的基因片段的阳性重组质粒，测序分析片段长为1566bp，已经成功切除了由18个氨基酸构成的信号肽序列。将该基因亚克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的SnaBⅠ和NotⅠ酶切位点，并通过菌落PCR、双酶切鉴定了该重组质粒的正确性，IBV S1基因毕赤酵母表达载体的构建为进一步利用毕赤酵母表达IBV S1蛋白提供了基础材料，并对表达产物的免疫原性和禽传染性支气管炎基因亚单位疫苗及特异性诊断抗原的研究打下了基础。     

TaqMan实时荧光定量PCR检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数

以3-磷酸甘油醛脱氢酶为内参基因,建立一种快速检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的TaqMan荧光定量PCR方法.通过对反应参数进行优化,建立针对目的基因和内参基因的双标准曲线,并对重组酵母基因组中外源基因和内参基因的拷贝数进行同时定量检测,外源基因与内参基因起始模板拷贝数的比值即为外源基因在重组酵母菌株基因组中的拷贝数.结果表明,2条标准曲线在101～108拷贝·μL-1具有良好的线性关系,以及良好的敏感性和重复性.利用该方法对60株重组酵母菌株进行荧光定量PCR检测,结果筛选到38株单拷贝插入菌株和22株多拷贝插入菌株.本研究所建立的TaqMan探针荧光定量PCR方法方便、高效,可用于重组毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的检测.