枯草芽孢杆菌Bs916中脂肽抗生素Bacillomycin L的操纵子结构及生物活性

【目的】明确枯草芽孢杆菌Bs916(Bacillus subtilis 916)分泌的脂肽化合物Bacillomycin L操纵子、结构和生物活性,阐明枯草芽孢杆菌Bs916防治病害的分子生化机制。【方法】采用LA-PCR和基因步行的方法克隆bacillomycin L的操纵子Bac;通过生物信息学的方法分析Bac操纵子的遗传特征;运用基质辅助解离质谱法测定Bac操纵子合成的脂肽类化合物bacillomycin L的分子量;利用碰撞诱导解离(CID)技术获得化合物的典型结构特征离子碎片测定bacillomycin L肽端的一级结构;通过平板对峙实验和溶血活性试验测定bacillomycin L的生物活性。【结果】克隆到全长约39.0kb的Bac操纵子,该操纵子由BacD、BacA、BacB和BacC4个多功能复合酶及1个启动子组成;生物信息学分析表明Bac操纵子与脂肽类化合物iturinA、mycosubtilin、bacillomycin D操纵子具有很高的同源性,然而也发现一段低同源性区域,该区域是一个新型Ser激活结构域。根据Bac操纵子特征推测Bac操纵子编码的脂肽类化合物可能是Bacillomycin L;Bac合成的脂肽类化合物的分子量分别为:1008,1022,1036和1050Da;推测属于相差一个(-CH2)亚甲基的同系物;脂肽化合物的一级结构为[cyclo-(Asn-Tyr-Asn-Ser-Glu-Ser-Thr-β-amino fattyacid)],该一级结构与以前报道的bacillomycin L的肽序列一致。生物活性测定结果表明其是一种生物表面活性剂,具有广谱抗真菌活性。【结论】本研究克隆了bacillomycin L的完整操纵子,并通过对操纵子生物信息学分析和生化试验鉴定了枯草芽胞杆菌Bs916分泌的脂肽bacillomycin L的化学结构,并阐明了生防菌Bs-916分泌的脂肽bacillomycin L是其抗真菌活性的关键因子。     

表面活性素、杆菌霉素L、罗克霉素和泛革素4种脂肽类抗生素高效制备方法及其生物学活性

【目的】建立一种从枯草芽胞杆菌中高效快速制备4种脂肽类抗生素的方法,初步阐明制备脂肽类抗生素的生物学活性。【方法】通过构建脂肽类抗生素突变株,采用酸沉淀、有机溶剂抽提和固相萃取的方法从枯草芽胞杆菌Bs916及其突变株的发酵液中提纯表面活性素、杆菌霉素L、泛革素和罗克霉素4种脂肽类抗生素;运用HPLC-MS、SDS-PAGE电泳对制备脂肽类抗生素的纯度进行检测;最后采用西瓜枯萎病菌、金黄色葡萄球菌和绵羊血红细胞测定4种脂肽类抗生素的抗真菌、抗细菌和溶血活性。【结果】蛋白凝胶电泳和液相色谱联用质谱检测结果表明,制备的脂肽类抗生素均达到了电泳纯和色谱纯;生物活性分析实验结果表明,表面活性素和杆菌霉素L具有较强的溶血活性,泛革素和罗克霉素的溶血活性较弱,杆菌霉素L和泛革素具有较强的抗真菌活性,而表面活性素和罗克霉素具有较强的抗细菌活性。【结论】建立快速从芽胞杆菌中提纯4种脂肽类抗生素色谱方法,测定了4种脂肽类化合物的生物活性,为进一步探究脂肽类抗生素的构效关系、生物合成和开发应用奠定基础。     

枯草芽胞杆菌Bs916突变体库的构建和抑制水稻 细菌性条斑病菌相关基因的克隆

【目的】采用转座子标签技术构建枯草芽胞杆菌Bs916突变体库,从突变体库中筛选对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果发生显著变化的菌株并克隆插入位点的基因,获得生防菌Bs916中与抑制细菌活性可能相关的基因。【方法】携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA通过化学转化方法转化至枯草芽胞杆菌Bs916菌株,构建随机插入突变体库。通过平板抑菌试验从突变体库中筛选对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果得到显著提高和下降的突变体;并采用PCR和Southern Blot验证转座子是否成功插入到Bs916染色体基因组上,利用反向PCR技术克隆转座子插入位点基因、测序并进行生物信息学分析。【结果】成功构建了枯草芽胞杆菌Bs916的转座子随机插入的突变体库;PCR和Southern Blot结果表明转座子成功的插入到染色体基因组上,约85%突变体以单拷贝形式插入;筛选出30株对水稻细菌性条斑病菌抑制效果发生显著变化的菌株,克隆到21个突变体插入位点的基因序列并测序。生物信息学分析结果表明这些基因与感受态形成、生物膜形成和次生产物代谢相关。【结论】成功构建了Bs916突变体库,克隆到该库中对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果显著变化菌株的突变位点基因,这些基因推测可能与枯草芽胞杆菌Bs916中的抑制细菌化合物的合成代谢及调控相关。     

FliZ调控枯草芽孢杆菌Bs916生物膜形成 及其对水稻纹枯病的防治效果

【目的】发掘并鉴定枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Bs916生物膜形成调控新基因,检测其对Bs916生物膜形成能力和对水稻纹枯病防治效果的影响。【方法】利用基因同源重组技术构建fliZ基因位点的单敲除突变株,通过干重分析法来验证其生物膜形成的缺陷;利用平板对峙试验检测fliZ突变株和Bs916对水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）的抑菌效果;利用高效液相色谱（HPLC）检测fliZ突变株和Bs916中影响防治效果的3种脂肽类抗生素表面活性素、杆菌霉素L和泛革素的相对产量;利用绿色荧光标记技术构建Bs916与fliZ突变株的GFP标记菌株,观察两者在水稻茎秆定殖能力变化;检测fliZ突变株和Bs916对水稻纹枯病的防治效果。【结果】成功构建了fliZ位点单敲除突变株,与对照组Bs916的三维立体结构生物膜相比仅能形成平面二维结构生物膜,呈现破碎状态,证明其生物膜形成存在显著缺陷;对生物膜干重进行定量分析发现fliZ突变株生物膜干重仅为对照组Bs916的23%,进一步验证了fliZ突变株生物膜形成能力显著下降;游动性试验发现fliZ突变株菌体扩展直径仅为Bs916的32%,证明fliZ突变株的游动能力显著下降;抑菌试验显示两者抑菌带宽基本一致,证明fliZ突变株对水稻纹枯病菌的抑菌能力与Bs916相比无显著差异;成功检测了fliZ突变株和Bs916合成的3种脂肽类抗生素表面活性素、杆菌霉素L和泛革素的相对产量,fliZ突变株中杆菌霉素L相对产量显著增加1倍,而表面活性素和泛革素相对产量与Bs916相比无显著差异;水稻茎秆定殖试验发现fliZ突变株菌体数量显著低于Bs916,在水稻纹枯病病斑附近不出现显著的聚集效应,呈现无序分布状态,证明fliZ突变株与Bs916相比在水稻茎秆上的定殖能力显著下降;对水稻纹枯病的田间防治效果试验显示,fliZ突变株第6—15天防治效果介于6.0%—20.7%,显著低于Bs916的36.0%—57.6%,证明fliZ突变株对水稻纹枯病防治效果显著下降。【结论】鉴定的Bs916生物膜新调控基因fliZ位于控制鞭毛运动的信号通路,直接作用于菌体的游动与扩张,显著单一调控生物膜形成与对水稻纹枯病的防治效果。     

FliZ调控枯草芽孢杆菌Bs916生物膜形成及其对水稻纹枯病的防治效果

【目的】发掘并鉴定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs916生物膜形成调控新基因,检测其对Bs916生物膜形成能力和对水稻纹枯病防治效果的影响。【方法】利用基因同源重组技术构建fliZ基因位点的单敲除突变株,通过干重分析法来验证其生物膜形成的缺陷;利用平板对峙试验检测fliZ突变株和Bs916对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)的抑菌效果;利用高效液相色谱(HPLC)检测fliZ突变株和Bs916中影响防治效果的3种脂肽类抗生素表面活性素、杆菌霉素L和泛革素的相对产量;利用绿色荧光标记技术构建Bs916与fliZ突变株的GFP标记菌株,观察两者在水稻茎秆定殖能力变化;检测fliZ突变株和Bs916对水稻纹枯病的防治效果。【结果】成功构建了fliZ位点单敲除突变株,与对照组Bs916的三维立体结构生物膜相比仅能形成平面二维结构生物膜,呈现破碎状态,证明其生物膜形成存在显著缺陷;对生物膜干重进行定量分析发现fliZ突变株生物膜干重仅为对照组Bs916的23%,进一步验证了fliZ突变株生物膜形成能力显著下降;游动性试验发现fliZ突变株菌体扩展直径仅为Bs916的32%,证明fliZ突变株的游动能力显著下降;抑菌试验显示两者抑菌带宽基本一致,证明fliZ突变株对水稻纹枯病菌的抑菌能力与Bs916相比无显著差异;成功检测了fliZ突变株和Bs916合成的3种脂肽类抗生素表面活性素、杆菌霉素L和泛革素的相对产量,fliZ突变株中杆菌霉素L相对产量显著增加1倍,而表面活性素和泛革素相对产量与Bs916相比无显著差异;水稻茎秆定殖试验发现fliZ突变株菌体数量显著低于Bs916,在水稻纹枯病病斑附近不出现显著的聚集效应,呈现无序分布状态,证明fliZ突变株与Bs916相比在水稻茎秆上的定殖能力显著下降;对水稻纹枯病的田间防治效果试验显示,fliZ突变株第6—15天防治效果介于6.0%—20.7%,显著低于Bs916的36.0%—57.6%,证明fliZ突变株对水稻纹枯病防治效果显著下降。【结论】鉴定的Bs916生物膜新调控基因fliZ位于控制鞭毛运动的信号通路,直接作用于菌体的游动与扩张,显著单一调控生物膜形成与对水稻纹枯病的防治效果。     

芽孢杆菌的抑菌活性与其产脂肽类抗生素的相关性

【目的】明确55株芽孢杆菌（Bacillus spp.）菌株对3个植物病原真菌（小麦纹枯病菌Rhizoctonia cerealis、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum、西瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp. niveum）抑菌活性及与其产生的脂肽类抗生素种类的定性定量关系。【方法】采用平板对峙培养分别测定55株芽孢杆菌活体菌及其脂肽类抗生素粗提物对3个真菌的抑菌活性;根据脂肽类抗生素合成相关基因序列srfA、ituA和fenA对55株芽孢杆菌进行PCR扩增;采用质谱及液相色谱分析55株芽孢杆菌脂肽类抗生素的种类、数量。【结果】55株芽孢杆菌菌株及其脂肽类抗生素粗提物对3个病原真菌均具有一定的抑菌活性,其中16.5%菌株脂肽类粗提物的抑菌活性比活体菌的强,55.8%菌株粗提物的抑菌活性比活体菌的弱,27.7%菌株粗提物的抑菌活性基本没有变化。55株芽孢杆菌基因组PCR扩增结果表明,89.1%菌株含有srfA,87.3%菌株含有ituA,只有56.4%菌株中含有fenA。55株芽孢杆菌粗提物质谱检测结果表明,53株菌株检测到surfactins,48株检测到iturins,只有菌株Bs916（Bacillus subtilis 916）检测到fengycins,粗提物中没有检测到3种抗生素的菌株其抑菌活性较弱或者没有。同时发现,在检测到iturins的48株菌株中,48株均检测到bacillomycin D,2株检测到bacillomycin L,12株检测到bacillomycin F、iturin A或mycosubtilin。对55株芽孢杆菌粗提物的液相色谱检测结果表明,53株菌株检测到surfactins;51株检测到iturins;只有菌株Bs-916检测到fengycins;有2株菌株未检测到上述3种抗生素。根据iturins的色谱峰出峰时间及峰型分为4大类,命名为1、2、3和4型,4种类型的iturins对病原菌的抑菌活性强度顺序为1型＞2型＞3型＞4型。在3株菌株JCC-1、JCC-9和JCC-18中检测到2个未知的脂肽类化合物（命名为Unknowns：Unknown1、2）的质谱峰。【结论】芽孢杆菌脂肽类抗生素是抑制植物病原真菌的主要成分,并具有多样性;iturins结构的变化及其分泌量与抑制植物病原真菌活性有一定的相关性。芽孢杆菌还产生一些未知的脂肽类化合物。     

枯草芽孢杆菌F-2抗植物病原真菌活性物质的研究

    枯草芽孢杆菌F-1和F-2与尖孢镰刀菌的对峙实验中,F-1没有抑菌作用,而F-2表现出强抑菌效果.为了分析测定F-2的抑菌活性物质,对F-1和F-2胞外代谢物粗提液的HPLC谱图进行比较,发现F-2具有F-1所没有的特征代谢产物.使用LC-MS对F-2的特征产物进行分析,推测主要产物的分子量为1477.0、1489.1和1505.1.进一步采用MALDI-TOF MS对F-2粗提液进行分析,发现F-2产生两组分子量相差14 Da(CH2)的同系物.其中一组的分子量依次为1462.8、1476.8、1490.8、1504.8和1518.9,通过质量指纹谱技术鉴定为脂肽抗生素C14-18 Fengycin B.另一组的分子量依次为1432.8、1446.8、1460.8、1474.8和1488.9,与C14-18 Fengycin A对应分子分子量相差2 Da,推测可能是Fengycin A的一种异构体,其碳链中具有一个双键,具体性质有待进一步分析.     

枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的共培养及其对生物活性物质产生的影响

研究了枯草芽孢杆菌Bs5 5和Bs90菌株分别与苏云金芽孢杆菌Bt1和Bt2菌株在共培养条件下的菌体生长、抗菌活性物质脂肽类化合物和杀虫活性物质伴孢晶体蛋白的产生状况。结果表明 ,Bs5 5与Bt共培养的菌体生长和脂肽类化合物的产生与单独培养的Bs5 5相似 ,未检测到伴孢晶体蛋白 ,但有Bt特异性蛋白存在 ;Bs90与Bt共培养的菌体生长和脂肽类化合物的产生与单独培养的Bs90有相对较大的差别 ,检测到伴孢晶体蛋白。说明Bs与Bt可以共生 ,组合适当时可以产生各自的生物活性物质     

枯草芽孢杆菌BAB-1产脂肽类及挥发性物质的分离和鉴定

【目的】对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis菌株BAB-1产生的脂肽类物质和挥发性物质进行分离鉴定和抑菌活性研究。【方法】采用HPLC和MALDI-TOF-MS对脂肽类物质进行分离纯化和鉴定;采用GC-MS对挥发性物质进行鉴定。【结果】HPLC分析表明,菌株BAB-1产生的脂肽类物质由LP-1、LP-2、LP-3三类组分组成,其中LP-2起主要抑菌作用。MALDI-TOF-MS质谱分析表明,LP-1为surfactin(C13—C15),LP-2为fengycin A(C14—C15)和fengycin B(C14—C18),LP-3成分未能确定。GC-MS结果表明,菌株BAB-1产生的挥发性物质由多种成分组成,主要为醇类、酮类、酸类、胺类和烷烃类等。【结论】枯草芽孢杆菌菌株BAB-1能够产生脂肽类物质和挥发性物质,并且这两类物质都具有较强的抑菌活性。     

枯草芽孢杆菌4种环脂肽抗猪δ冠状病毒的研究

为探究从枯草芽孢杆菌Bs 916中提取的表面活性素、罗克霉素、泛革素及杆菌霉素L 4种抗菌肽对猪δ冠状病毒(PDCoV)的抗病毒作用。首先采用CCK-8法确定抗菌肽对细胞无毒性的最佳浓度范围,随后分别采用RT-qPCR、Western blot及IFA 3种方法检测Bs 916中4种环脂肽对PDCoV的抗病毒效果。结果显示,4种环脂肽在浓度≤50μg/mL时对细胞无毒性,同时具有良好的抗病毒效果。相同条件下,罗克霉素抗病毒效果最佳,其次为表面活性素。本研究从枯草芽孢杆菌Bs 916中提取的表面活性素、罗克霉素、泛革素及杆菌霉素L可抑制PDCoV在细胞中的增殖,具有良好的抗病毒作用,其中以罗克霉素和表面活性素的抗病毒效果最佳,可为抗PDCoV药物研发提供理论支持。     

枯草芽胞杆菌Bs-916的全基因组分析

 【目的】对枯草芽胞杆菌Bs-916进行全基因组测序,为今后更好挖掘和利用该菌生防潜力提供较多的分子生物学信息。【方法】通过应用比较基因组学软件与另一测序菌株Bs168进行全基因组序列分析。【结果】Bs-916菌株全基因组大小为3 925 958 bp,GC含量为46.4%,与其它已测序全基因组芽孢杆菌相比,其GC含量最高;预测所得CDS数为4 056个,152个串联重复区域,转座子103个,IS（插入序列）序列数量37个, tRNA 46个,rRNA 39个;比较基因组学分析其含有8个NRPS/PKS基因簇,其中bacillomycin L,macrolactin,difficidin这3个基因簇在比较菌株Bs168中不存在;该菌还含有植酸酶基因、comAPQX及sfp等与生防因子相关的基因。【结论】Bs-916菌株全基因组含有多种抗菌物质编码基因簇,是一类具有极大生防潜力的典型根际革兰氏阳性菌株。该菌株全基因组序列的测定及其遗传操作方法的可行性,有利于其次生代谢产物的开发和利用。次生代谢产物具有潜在的应用价值,有望在未来开发成独特的农业生物工程制剂。     

解淀粉芽孢杆菌Lx-11产脂肽类物质鉴定及表面活性素对水稻细菌性条斑病的防治作用

【目的】对解淀粉芽孢杆菌Lx-11产生的脂肽类物质进行分离鉴定和水稻条斑病防效测定。【方法】根据脂肽类抗菌物质合成相关基因序列对Lx-11进行PCR扩增检测,采用MALDI-TOF-MS对脂肽类物质进行分析。【结果】通过3对特异性引物对Lx-11菌株检测,扩增产物经克隆、测序和BLAST分析,表明解淀粉芽孢杆菌Lx-11基因组中含有sfp、fenB、ituA或bamA基因。质谱分析发现提取的粗提物中含有surfactin、bacillomycin D和fengycin等3种脂肽类抗生素。通过构建surfactin突变体菌株,平板和盆栽试验显示突变体菌株抑制条斑病菌能力显著降低。【结论】解淀粉芽孢杆菌Lx-11产生的surfactin类物质对条斑病菌具有较强的抑制作用,是抑制条斑病菌主要物质之一。     

一个短季棉芽黄基因型的鉴定及生理生化分析

 【目的】鉴定新的早熟棉花芽黄突变体,为揭示航天诱变机理和芽黄突变体的利用提供理论基础。【方法】以中棉所58芽黄突变体为材料与野生型、棉花中期库17份芽黄材料进行正、反交,通过遗传学分析、叶绿体的超微结构观察和抗氧化系统酶活性测定,比较中棉所58芽黄突变体Vsp与野生型的各性状差异。【结果】中棉所58芽黄突变体Vsp和野生型中棉所58正、反交F2叶色表现符合绿叶﹕黄叶为3﹕1的分离结果,说明该突变体的芽黄性状由隐性核基因控制,中棉所58芽黄突变体Vsp和其它17份芽黄材料正、反交,虽有材料杂交后代有极个别表现芽黄表型,但绝大部分（95%以上）都表现为正常绿色,说明控制中棉所58芽黄突变体Vsp芽黄性状的基因和其它17份已经鉴定的芽黄材料控制该性状的基因不等位。叶绿体的超微结构表明,芽黄突变体叶绿体发育存在一定的缺陷,发育比较滞后,基粒类囊体和基质类囊体垛叠数较少,排列比较混乱,但随着叶片的不断发育,之后逐渐达到野生型的发育水平。芽黄材料的株高、果枝数、大铃、小铃、产量和纤维品质显著低于对照,芽黄突变体的SOD和CAT活性低于对照,POD活性高于对照,说明其抗氧化能力远低于对照。【结论】利用航天诱变技术,经过多代连续自交,获得芽黄性状稳定遗传且不同于棉花中期库17份已有芽黄材料的芽黄突变体中棉所58Vsp,该芽黄性状受一对隐性核基因控制;该芽黄突体的抗氧化系统酶活性、色素含量、叶绿素合成前提物质及叶绿体的超微结构均受到一定的影响。     

小花棘豆总生物碱抑菌作用的研究

[目的]研究小花棘豆总生物碱的抑菌作用.[方法]通过体外抑菌试验研究小花棘豆总生物碱的抑菌活性、最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)和影响小花棘豆总生物碱抑菌效果的因素.[结果]小花棘豆总生物碱对金黄色葡萄球菌、乳房链球菌、化脓链球菌和枯草芽孢杆菌有抑菌作用;其对乳房链球菌和化脓链球菌的MIC为6.3 mg/mL,对金黄色葡萄球菌的MIC为1.6 mg/mL,对枯草芽孢杆菌的MIC为0.8 mg/mL.生物碱在不同pH值下的抑菌活性发生变化;高温使其抑菌活性消失;紫外照射对其稳定性没有影响.[结论]小花棘豆总生物碱对部分革兰氏阳性菌有较好的抑菌作用.     

Mutator诱导的玉米白化突变体插入位点的遗传分析及代谢途径的构建

【目的】利用Mutator(Mu)诱变群体获得、验证叶色白化突变体的Mu因子插入位点;解析玉米叶色变异相关基因及其代谢网络。【方法】以含有活性MuDR转座子的W22∷Mu为父本,与玉米自交系综31(Z31)杂交产生的M2和M3家系群体为材料,经表型性状的遗传分析和Mu插入位点的分离获得白化突变体,经生物信息学方法解析白化突变体产生的相关基因,同时构建产生白化突变代谢网络。【结果】对870个M2家系的16000余单株和M3种植的36个家系近700单株进行考察,获得了遗传稳定的白化突变体41株。经Mu-TAIL-PCR分析获得35条Mu因子插入序列;对靶位点序列分析,获得的14个靶位点可能与叶绿素合成及光合作用有关;利用其中6个靶位点构建了5条玉米叶色突变产生白化的叶绿素代谢网络途径。【结论】初步证实了Mu转座子插入的27个靶位点与叶色白化突变体的关联;建立了6个靶位点的玉米叶色突变产生白化的叶绿素代谢网络途径。