不同品系绒山羊皮肤毛囊生长发育周期中chi-miR-107-3p及其相关基因的表达分析

为分析chi-miR-107-3p及相关基因在不同品系绒山羊皮肤毛囊生长发育周期中的表达情况,本研究分别在毛囊休止期(4月)、兴盛前期(7月)、兴盛期(9月)和退行期(1月)采集了阿拉善型绒山羊(季节性长绒)和敏盖绒山羊(常年长绒)体侧皮肤组织,通过组织切片比较分析组织形态,实时荧光定量PCR法检测chi-miR-107-3p及ADCK5、DSBC1、ARSA、FMAP4、RHBDF2和ALDH3A2等6个相关基因表达量。结果表明:1)两种品系的绒山羊毛囊在形态特征上基本一致,但在同一时期生长规律不同;2)chi-miR-107-3p和RHBDF2基因在两种品系绒山羊皮肤毛囊不同发育周期的表达量呈相反趋势。在次级毛囊重建初期,chi-miR-107-3p表达量较高,而RHBDF2基因的表达量极低,随着次级毛囊重建逐步完成,chi-miR-107-3p表达量显著降低,RHBDF2基因的表达量逐渐增高。进入退行期,chi-miR-107-3p的表达量逐渐增高,而RHBDF2基因的表达量逐渐降低,休止期,chi-miR-107-3p的表达量达到最大值,此时RHBDF2基因的表达量最小,推测chi-miR-107-3p可能负向调控RHBDF2基因的表达;3)相关性分析表明,chi-miR-107-3p和RHBDF2基因表达水平均与皮肤毛囊性状显著相关(P<0.05),说明chi-miR-107-3p和RHBDF2基因均为两品系绒山羊皮肤毛囊生长发育的重要影响因子;4)ALDH3A2基因的表达量在皮肤毛囊休止期至兴盛期的过程中逐渐降低,由退行期至休止期的过程中逐渐增高。ALDH3A2基因与皮肤毛囊各性状均显著相关(P<0.05),表明高表达的ALDH3A2可能抑制两品系绒山羊毛囊的生长发育,是调控皮肤毛囊生长发育的重要影响因子,其他基因对绒山羊皮肤组织生长均无影响。本研究证实羊绒生长发育过程离不开miRNA及其相关基因参与调控,为进一步研究毛囊发育分子机理提供了参考,为实际生产中进行羊绒增产提供理论依据。     

miR-376b-5p调控绵羊产羔性状相关基因IGF1的表达

为探讨miR-376b-5p靶向调控IGF1影响绵羊多羔性状的分子机制,本研究根据产羔记录选取高、低产羔数小尾寒羊各5只,同期发情处理后,采集卵泡期卵巢及其他6个组织,通过RT-qPCR、Western blot和双荧光素酶报告基因检测系统分析miR-376b-5p与IGF1在高、低产羔数小尾寒羊各组织中的表达量;并确定二者之间的靶向关系;随后,将体外合成的miR-376b-5p模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)转染至绵羊卵巢颗粒细胞中,检测miR-376b-5p对IGF1表达水平的调控情况,同时对多羔性状TGF-β信号通路中TGFβ1和PTGS2标志因子的表达进行分析。结果表明：1)组织表达谱显示,IGF1在绵羊卵巢组织中的表达量显著高于其他组织(P<0.05);RT-qPCR和Western blot显示,IGF1在高产羔数小尾寒羊卵巢组织中的表达量极显著高于低产羔数小尾寒羊(P<0.01);miR-376b-5p定量结果显示其表达趋势与IGF1相反(P<0.01);2)在线软件预测和双荧光素酶报告系统检测显示,miR-376b-5p可靶向结合IG...     

多囊卵巢综合征与正常卵泡液中环状RNA的差异表达分析

收集江苏省扬州市苏北人民医院生殖中心接受辅助生殖技术治疗的女性患者卵泡液,分为多囊卵巢综合征(PCOS)组(n=3)和对照组(n=3),利用高通量测序技术检测样本中circRNA的表达差异,对筛选出的差异表circRNA的亲本基因进行GO、KEGG富集分析。以分析环状RNA在PCOS患者卵泡液中基因表达谱的差异,探究环状RNA在PCOS发病中的作用机制。结果表明:通过高通量测序技术对卵泡液circRNA表达谱的分析,上调的circRNA亲本基因有167个,下调的245个,无明显变化的有1 846个;差异circRNA亲本基因的功能富集,发现在微生物感染功能、氧化应激反应功能、神经系统病变功能等高度富集。这一研究提示多种circRNA在PCOS患者卵泡液中呈异常表达,这些表达差异的circRNA可能参与了PCOS的发病机制。     

绵羊胚胎不同发育阶段及其组织中MicroRNA-483-5p表达分析

[目的]研究MicroRNA(miR)483-5p在中国美利奴羊胚胎不同发育阶段肾脏和脐带组织中的表达变化,以了解其在绵羊胚胎发育中的重要作用.[方法]选择中国美利奴羊胚胎不同发育时期(45、85、115和135 d 4个时期)肾脏和脐带组织为研究材料,采用半定量RT-PCR检测第45d绵羊胚胎不同组织中miR483-5p的表达;同时利用实时荧光定量PCR对miR-483-5p在绵羊胚胎不同发育阶段肾脏和脐带组织的表达变化进行实时检测.[结果]miR-483-5p在所检测的绵羊45 d胚胎各组织中广泛表达,其中以肌肉、心脏和肺脏组织表达丰度最高.实时荧光定量PCR结果显示,不同发育阶段绵羊胚胎肾脏和脐带组织miR -483-5p的表达具有明显的时空选择性.脐带组织miR-483-5p随着胚胎发育其表达量呈逐渐下降的趋势;肾脏组织miR-483-5p则是随着胚胎发育在第85 d其表达量下降到最低,其后在115和135 d其表达量又逐渐上升.不同发育阶段胚胎肾脏、脐带组织miR-483-5p的表达量呈显著性差异(P＜0.05).[结论]miR-483-5p在绵羊胚胎不同发育阶段肾脏或脐带组织中表达明显不同,表明其表达具有选择性;依据miR -483-5p表达的差异性及其涉及的生物学功能,推测miR-483-5p在绵羊脐带和肾脏组织中具有一定的调控作用.研究为进一步了解miR-483-5p在胚胎肾脏和脐带发育中的作用机制提供一定的理论依据.     

山羊p300基因生物信息学分析及其在主要器官中的表达

为探讨山羊p300基因的基因组特征及其在主要器官中的表达,本研究从染色体定位、基因结构、序列比对等方面对p300基因进行生物信息学分析,并通过实时定量PCR技术检测了p300基因在三月龄胎羊八种不同器官的表达情况。实验表明,p300基因定位于5号染色体,包含31个外显子,跨越长度63 766 bp,mRNA总长9 571 bp,CDS全长7 235 bp,编码2 411个氨基酸。p300在物种间保守性较高,其中山羊与绵羊同源性最高。此外,p300在山羊的8种器官中均有表达,且在心脏中相对表达量最高。     

山羊卵巢颗粒细胞差异表达基因消减文库的建立

为了从单卵泡水平建立非闭锁大小卵泡颗粒细胞基因表达的消减文库,选择繁殖性能正常、空怀高繁殖力黄淮山羊2只,以氯前列烯醇处理40h后取卵巢,计数卵泡并测量卵泡直径,钝性分离采集卵泡颗粒细胞,置于液氮内保存,取样后的卵泡部分组织采用原位缺口末端标记法(TUNEL)进行闭锁鉴定。选择直径6和4mm非闭锁卵泡,提取颗粒细胞mRNA,扩增cDNA,监测抑制消减杂交及其文库构建的试验环节。结果表明:消减文库的阳性克隆测序成功率100%,从正向文库中随机挑取96个克隆进行差异表达的筛选,发现12个全新表达序列标签;应用RT-PCR对已知序列的抑制素βA亚基基因(INHBA)和谷胱甘肽S-转移酶A1基因(GSTA1)进行表达水平测定,证实了颗粒细胞2个基因mRNA的表达模式与差异显示的结果相同。表明消减文库构建成功。     

马铃薯低温响应的ScmiR390-5p及其靶基因表达与结构分析

【目的】研究马铃薯富含亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat receptor-like protein kinase LRR-RLK)类受体蛋白激酶基因SCLRRK1受miR390（ScmiR390-5p）调控响应非生物胁迫的机理。【方法】通过低温响应马铃薯miRNA测序分析与靶基因预测,发现ScmiR390-5p通过调控1个可能的LRR类受体蛋白激酶基因对低温做出响应;利用实时荧光定量PCR技术（Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR）验证ScmiR390-5p和SCLRRK1响应低温胁迫的表达情况;利用RLM-5′RACE确定ScmiR390-5p作用于SCLRRK1的切割位点;利用PCR技术克隆得到SCLRRK1的DNA序列和CDS序列,生物信息学分析SCLRRK1的结构和功能;利用RT-qPCR分析ScmiR390-5p/SCLRRK1在马铃薯各组织中的表达情况及其响应各种非生物胁迫的表达情况。【结果】RT-qPCR结果表明,低温诱导ScmiR390-5p表达,SCLRRK1的表达则受到低温的抑制,ScmiR390-5p和SCLRRK1的表达在低温胁迫下呈负相关性;RLM-5′RACE分析表明,ScmiR390-5p作用于SCLRRK1的切割位点是ATTCCT//CCTGAGTT,马铃薯ScmiR390-5p/SCLRRK1调控模块在低温响应中起作用。克隆结果表明SCLRRK1的CDS序列长度为2 685 bp,编码894个氨基酸,DNA序列长度为3 549 bp,含有1个内含子、2个外显子、3′非编码区和5′非编码区,ScmiR390-5p的靶位点位于SCLRRK1 CDS序列内部（960—981 bp,GGAACTATTCCTCCTGAGTTT）。生物信息学显示SCLRRK1是1个富含亮氨酸重复序列(leucine-richrepeat,LRR)的类受体蛋白激酶基因,编码的蛋白属于跨膜分泌蛋白。马铃薯组织表达RT-qPCR分析显示,ScmiR390-5p在叶中的表达量最高,根次之,茎中（地上茎、块茎和匍匐茎）表达量较低;而SCLRRK1的表达情况与ScmiR390-5p相反,其在叶中的表达最低,在茎中表达最高（匍匐茎>块茎>地上茎）。多种非生物胁迫结果显示,ScmiR390-5p和SCLRRK1表达在NaCl胁迫下呈负相关,ScmiR390-5p受到NaCl胁迫诱导表达。与对照相比,ABA和6-BA处理下ScmiR390-5p表达先下降之后呈波浪小幅回调;6-BA处理下SCLRRK1表达持续升高,ABA处理下SCLRRK1表达先上升后下降。GA₃、PEG和IAA处理8 h时,ScmiR390-5p的表达达到峰值,GA₃、PEG和IAA处理都能诱导SCLRRK1表达,但其变化趋势与ScmiR390-5p相关性不强。【结论】SCLRRK1具备编码LRR类受体蛋白激酶的核酸、氨基酸序列和结构基础,是ScmiR390-5p的靶基因;ScmiR390-5p/SCLRRK1调控模块在马铃薯组织器官中具备明显作用;ScmiR390-5p在转录后水平通过抑制马铃薯SCLRRK1的表达对低温胁迫做出响应,同时,马铃薯ScmiR390-5p/SCLRRK1调控模块在NaCl和6-BA胁迫响应中起作用,但不对ABA、GA₃、IAA和PEG胁迫做出响应,ScmiR390-5p和SCLRRK1分别在转录水平受到ABA、GA₃、IAA和PEG胁迫信号调控。     

亚洲玉米螟miR-1a-5p表达与Cry1Ab蛋白敏感性的关系

【目的】探索亚洲玉米螟miR-1a-5p表达与Cry1Ab蛋白敏感性的关系,为揭示miRNA在昆虫Bt抗性产生过程中的作用提供依据。【方法】通过荧光定量PCR,研究亚洲玉米螟Cry1Ab抗性品系(ACB-AbR)和Bt敏感品系(ACB-BtS)表皮及中肠组织中miR-1a-5p的表达差异。以Sf9细胞为研究对象,通过转染miR-1a-5p促进剂(Mimics)或抑制剂(Inhibitor)改变细胞中miR-1a-5p的表达量,测定不同处理细胞对Cry1Ab蛋白的敏感性,探讨miR-1a-5p表达量改变后Sf9细胞对Cry1Ab蛋白的敏感性变化。通过荧光素酶报告试验,研究miR-1a-5p对潜在靶标基因Unigene12370_All的调控作用。【结果】ACB-AbR表皮组织中miR-1a-5p的表达量显著高于ACB-BtS表皮组织,ACB-AbR中肠组织中miR-1a-5p的表达量显著低于ACB-BtS中肠组织;ACB-AbR和ACB-BtS幼虫表皮组织中miR-1a-5p的表达量均显著高于其中肠组织。Sf9细胞miR-1a-5p表达量升高导致Sf9细胞对Cry1Ab蛋白的敏感性增强,反之亦然。荧光素酶报告试验结果提示,miR-1a-5p与靶标基因Unigene12370_All可以结合。【结论】亚洲玉米螟miR-1a-5p表达量的变化与其对Cry1Ab蛋白敏感性的改变有关。     

福清山羊与努比亚黑山羊发情期卵巢组织RNA-Seq分析

【目的】 研究福清山羊与努比亚黑山羊发情期卵巢组织转录组差异表达水平,一方面为山羊繁殖性状形成的分子机制提供理论依据,另一方面为利用努比亚黑山羊杂交改良福清山羊提供可加快遗传进展的分子标记。【方法】 利用转录组测序方法对福清山羊和努比亚黑山羊发情期卵巢组织进行研究,筛选品种间的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,并对DEGs功能进行注释和若干基因荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）验证;同时通过与参考基因组比对,分析和筛选测序样品中存在的SNP/InDel。【结果】 6个样品共得到46.68Gb Clean Data,DESeq分析发现了福清山羊和努比亚黑山羊发情期卵巢组织的DEGs149个（包含25个新转录本）,其中表达上调53个,表达下调96个;初步认为输卵管素基因（oviductin,OVN）、类固醇合成快速调节蛋白基因(steroidogenic acute regulatory protein,STAR)、早期生长应答1基因(early growth response 1,EGR1)可作为福清山羊繁殖性能的候选基因。149个DEGs中的108个基因能被GO（gene ontology）数据库注释,30个DEGs能够被COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins）数据库注释,91个DEGs能够被KEGG（kyoto encyclopediaof genes and genomes）数据库注释。KEGG通路分析表明DEGs共富集到21条信号通路中,6条通路显著富集。经过进一步的与参考基因组序列比对分析,共发掘1 506个新转录本。经qRT-PCR验证,所选基因（转录本）表达变化模式与转录组测序结果一致,表明测序结果可靠。【结论】 在转录组水平上筛选出了福清山羊和努比亚黑山羊发情期卵巢组织的149个DEGs,发掘了1 506个新转录本,初步揭示了OVN、STAR和EGR1在山羊繁殖过程中可能发挥重要作用,为进一步探索山羊繁殖性状相关机理提供参考依据。     

牛微小隐孢子虫子孢子表面抗原p23基因的克隆及原核表达

从已构建的牛微小隐孢子虫子孢子cDNA文库中,用PCR方法扩增出子孢子表面抗原p23基因,将其插入到编码谷胱肽转移酶(GST)的质粒(pGEX-4T-2)多克隆位点,构建原核表达载体pGEX-p23。重组质粒经EcoRI/Sal I酶切、测序鉴定后转入大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达蛋白。结果成功构建了pGEX-p23原核表达载体,经IPTG诱导,转化的大肠杆菌表达出分子质量为47kDa的GST融合蛋白,且该蛋白能与抗p23抗体发生特异性结合反应。本研究为进一步研究p23的生物学功能和临床应用奠定了基础。     

山羊IGFBP-5基因克隆及特征分析

为探讨山羊IGFBP-5基因的特点,进一步研究其在山羊上的表达及生长发育中的作用机制,以初生南江黄羊肝脏组织为材料抽提RNA进行克隆测序,并利用ExPasy、NetPhos、NetOGlyc、SignalP等生物软件分析IGFBP-5基因CDS区及其编码氨基酸的理化性质、结构特点.结果显示,山羊IGFBP-5基因的CD...     

miR-423-5p在牛肌肉组织中表达及其靶基因预测

miR-423-5p在细胞中具有重要的生物学功能,如在肌细胞中能影响细胞的增殖.根据miRBase及NCBI网站显示的相关信息利用分析软件对miR-423在各物种之间的同源性进行了分析.取成年西门塔尔牛体内的骨骼肌、小肠、心脏组织利用茎环荧光定量PCR进行miR-423-5p表达量检测,将牛骨骼肌卫星细胞(MDSCs)...     

山羊不同组织中IGFBP-5 mRNA的发育表达模式

[目的]探讨IGFBP-5基因在山羊出生后不同组织的发育性表达模式。[方法]采用荧光定量PCR,分析了出生后0、15、30、60、90和120d36只南江黄羊（公、母羔各18只）的心脏、肝脏、脾、肺、背最长肌、半膜肌、臂三头肌和股二头肌样品中IGFBP-5mRNA水平。[结果]母羔的IGFBP-5mRNA表达丰度显著高于公羔。各组织IGFBP-5mRNA表达量呈现肝脏〉肺〉脾（心脏）〉肌肉的趋势（P〈0.01）,脾与心脏间差异不显著（P〉0.01）,肌肉的表达值最低。随着日龄的增加,各组织中IGFBP-5mRNA丰度均呈现下降-上调-下降的发育性表达模式,而肝脏和肺中的表达模式具有明显的性别差异。[结论]IGFBP-5mRNA主要在内脏,尤其是肝脏中合成,但在各组织的发育性表达模式一致,性别是一个重要的影响因素。     

鸡肌肉发育相关miR-133a-5p分析和关键靶基因筛选

为筛选miR-133a-5p影响鸡肌肉发育的关键靶基因,本研究利用在线数据库预测miR-133a-5p靶基因,并对靶基因进行富集分析和构建蛋白-蛋白相互作用(Protein-protein interaction,PPI)网络,寻找网络图中有意义的模块。通过单因素方差分析,比较分析肌肉和其他组织中的miR-133a-5p表达量;再依据microRNA与靶基因负相关的作用机制,将miR-133a-5p靶基因与肌肉中相对下调基因取交集,筛选关键靶基因。最后,通过RNA22 v2对筛选结果进行评估。结果表明:1)共获得157个靶基因;2)GO富集分析显示,靶基因参与多个生物合成过程的调控和代谢过程;KEGG富集结果包括MAPK信号通路等多种信号通路,也包括肌动蛋白细胞骨架等与肌肉发育直接相关的通路;3)PPI网络图共筛选到4个有意义模块,涉及17个基因;4)miR-133a-5p在肌肉中表达显著上调(相对肺、肝脏和肾脏),与肌肉相对下调基因取交集后,筛选到SOX5(SRY-box 5)、PRTFDC1(Phosphoribosyl transferase domain containing 1)、THRB(Thyroid hormone receptor beta)、THBS2(Thrombospondin 2)和ARRDC3(Arrestin domain containing 3)5个基因;5)在GSE93855的表达谱中,PRTFDC1和THRB在肌肉中表达量最低,而RNA22 v2评估结果显示,仅SOX5和THRB存在P<0.05的结合位点。综上,miR-133a-5p很可能是通过SOX5、PRTFDC1、THRB、THBS2和ARRDC3影响肌肉发育,其中SOX5和THRB尤为重要。本研究为进一步研究鸡miR-133a-5p提供了理论基础和数据支撑。     

miR-31-5p对山羊毛囊干细胞增殖和凋亡的影响

【目的】长江三角洲白山羊是我国及世界上唯一能生产优质笔料毛的山羊品种,课题组前期转录组测序结果表明：在优质笔料毛与非优质笔料毛个体皮肤组织中,MAP3K1的表达水平存在显著差异。探究优质笔料毛性状形成过程中与MAP3K1相互作用的关键miRNAs及其对山羊毛囊干细胞增殖和凋亡的影响,为长江三角洲白山羊的分子选育提供理论依据。【方法】通过生物信息学网站（StrBase、miRDB、TargetScan、miRWalk、DAVID、KEGG、RNAhybrid）预测、筛选与MAP3K1具有靶向关系的miRNAs,利用在线网站Venny 2.1绘制韦恩图。通过构建miR-31-5p过表达载体,MAP3K1、RASA1野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体,验证miR-31-5p与MAP3K1、RASA1之间的靶向关系,并结合qPCR和Western Blot技术检测过表达后miR-31-5p对MAP3K1、RASA1 mRNA和蛋白表达水平的影响。为探究过表达miR-31-5p后对细胞增殖、凋亡的影响,分析了转染miR-31-5p后毛囊干细胞内增殖相关基因（PCNA, CDK1, CCND2）、抗凋亡基因（Bcl-2）和促凋亡基因（Bax）的mRNA和蛋白表达水平;同时结合CCK-8,EdU,流式细胞术等方法验证过表达miR-31-5p对毛囊干细胞活力、细胞周期以及凋亡的影响。【结果】通过数据库共同预测到3个可能与MAP3K1相作用的miRNAs,结合现有miRNAs在皮肤和毛囊细胞上研究,最终选用评分相对较高的miR-31-5p作为研究对象。转染miR-31-5p后检测细胞内的miR-31-5p的相对表达量,发现miR-31-5p表达含量极显著高于对照组及空白载体组（P<0.01）;双荧光素酶报告基因结果显示过表达miR-31-5p可促使MAP3K1活性升高（P<0.01）,结合TargetScan、KEGG数据库预测发现miR-31-5p可靶向MAPK信号通路中位于MAP3K1的上游抑制因子RASA1。过表达miR-31-5p抑制了RASA1的活性（P<0.01）;同时,qPCR及Western Blot表明：过表达miR-31-5p后显著抑制RASA1的mRNA和蛋白表达,促进了MAP3K1的表达（P<0.01）。CCK-8结果显示过表达miR-31-5p后提高了细胞增殖能力（P<0.01）,通过EdU染色发现过表达miR-31-5p后,EdU阳性细胞率显著高于空白组（P<0.01）,促进细胞增殖;细胞周期数据说明过表达miR-31-5p后, G1/G0期细胞所占比例为52.23%,显著低于Control组（56.81%,P<0.01）,减缓了G1/G0期细胞阻滞,而S期和G2/M期差异不显著,但仍有上升趋势。通过细胞凋亡试验发现过表达miR-31-5p组活细胞率为93.8%,总凋亡率为4.9%,而空白组活细胞率仅为90.1%,总凋亡率为8.41%,说明在过表达miR-31-5p后细胞凋亡率明显下降（P<0.05）;最后检测miR-31-5p对增殖和凋亡相关基因的影响,发现过表达miR-31-5p后显著提高了增殖相关基因、抗凋亡基因（Bcl-2）的mRNA和蛋白表达水平（P<0.05）,降低了促凋亡基因（Bax）的mRNA和蛋白表达水平。最终根据所研究出的结果绘制miR-31-5p在毛囊干细胞中的分子作用机制图。【结论】 miR-31-5p通过靶向抑制MAPK信号通路中的RASA1,上调MAP3K1表达水平,进而促进毛囊干细胞增殖并抑制其凋亡,为进一步阐明调控长江三角洲白山羊优质笔料毛性状的分子形成机制提供理论依据。