Claudin-11在成年羊驼卵巢中的表达与定位

【目的】研究生长分化因子9（growth differentiation facter9,GDF9）的潜在靶蛋白Claudin-11在成年羊驼卵巢中的表达与定位,探索Claudin-11对促进卵泡发育、调节排卵的作用机理。【方法】以成年雌性羊驼为研究对象,用RT-PCR技术分析潜在靶蛋白Claudin-11在成年羊驼卵巢中的表达,并使用实时荧光定量PCR技术分析其相对表达量,采用免疫组织化学法和western blotting法对Claudin-11在成年羊驼卵巢中的表达进行定位分析。【结果】荧光定量PCR结果显示,Claudin-11在羊驼卵巢的初级卵泡中弱表达于次级卵泡;western blotting结果显示,多克隆兔抗Claudin-11抗体与成年羊驼卵巢组织粗提取物可以发生特异性的免疫反应;免疫组织化学试验结果显示,Claudin-11在羊驼卵巢的原始卵泡和次级卵泡中弱表达于卵泡细胞周围的扁平或立方形卵泡细胞的胞质,而在次级卵泡中 Claudin-11在最内层颗粒细胞的胞质中进行表达。【结论】Claudin-11在成年羊驼卵巢组织中表达且存在特异性的细胞定位。     

神经生长因子NGF及其受体TrkA在雌性水牛生殖器官的表达定位

为研究神经生长因子NGF及其受体TrkA在广西雌性水牛生殖器官中表达定位情况,运用免疫组织化学ABC法对处于发情周期不同阶段(卵泡期、黄体期)成年水牛的卵巢、子宫、输卵管NGF、TrkA分别进行染色定位.结果表明:NGF/TrkA阳性细胞在卵巢主要见于卵泡内膜细胞、颗粒细胞及黄体细胞;在子宫主要见于子宫内膜上皮细胞、腺...     

促性腺激素释放激素在不同品种水牛卵巢中的免疫组化定位

【目的】了解促性腺激释放激素（GnRH）在广西沼泽型水牛与摩拉杂交水牛卵巢中定位表达的异同点,为深入阐明GnRH调节卵巢功能的机制提供理论依据。【方法】采用免疫组化SP染色法对广西沼泽型水牛和摩拉杂交水牛卵巢中GnRH及其受体的分布表达进行对比研究。【结果】两种不同品种水牛卵巢中均存在大量的GnRH阳性细胞,且主要位于颗粒层细胞和黄体粒细胞的胞质内;通过比较显示,两种不同品种水牛卵巢GnRH阳性细胞个数差异极显著（P〈0．01）,但GnRH阳性细胞大小及其平均光密度的差异均不显著（P〉0．05）。【结论】不同品种水牛卵巢的GnRH分布差异可能与繁殖性能有关,但主要分布于巢卵颗粒层细胞和黄体粒细胞的胞质内。     

水牛腔前卵泡体外培养效果影响因素的研究

 【目的】主要探讨水牛腔前卵泡体外培养的影响因素。【方法】采用梳刮法从沼泽型水牛的卵巢中回收得到腔前卵泡，而后用McCoy's5a培养液在96孔培养板中体外培养5～10 d，在显微镜下观测腔前卵泡的形态与增长情况，并用台盼蓝染色鉴定腔前卵泡的存活情况。【结果】在培养液中添加100 µg•L-1的FSH能显著提高腔前卵泡培养5和10 d后的增长幅度，当同时添加50 mg•L-1的维生素C时增长幅度进一步加强；添加50 mg•L-1的维生素C能提高腔前卵泡培养10 d后的形态正常率，但对卵泡增长及存活没有影响；添加50 µg•L-1的EGF能提高腔前卵泡培养5 d的增长幅度，但对培养10 d后腔前卵泡的作用不显著。随着卵泡的直径增加，体外存活率升高，增长的幅度上升，异常率下降。60～100 µm的腔前卵泡用三维培养法（琼脂糖包埋）体外培养10 d的直径增长幅度显著高于二维培养法（琼脂糖铺底）和普通培养法，且形态异常显著低于二维培养法和普通培养法；100～140 µm卵泡用二维培养法培养的增长幅度最大，培养成活率最高。【结论】FSH能促进水牛卵泡的体外增长，维生素C能维持卵泡的正常形态结构，且两者的协同作用显著；水牛卵泡体外发育能力随其体积的增大而增强；三维培养法适宜于培养60～100 µm的卵泡，而二维培养法有利于100～140 µm卵泡的体外发育。     

FoxO3转录因子在鸡卵巢组织中的表达鉴定

[目的]明确FoxO3转录因子在不同日龄鸡卵巢组织中的表达模式及其具体定位情况,为后续开展家禽卵泡激活及发育调控等相关机理研究提供科学依据.[方法]在GenBank中搜索鸡与其他物种(鸭、鹅、老鼠、猪、牛及人类)的FoxO3氨基酸序列,通过LaserGene分析鸡FoxO3氨基酸序列与其他物种FoxO3氨基酸序列间的亲缘关系及同源差异情况;利用RT-PCR鉴定FoxO3基因是否在鸡卵巢组织中表达,再采用实时荧光定量PCR检测不同发育阶段鸡卵巢组织中FoxO3基因的表达水平,最后以免疫荧光检测FoxO3蛋白在鸡卵巢组织中的定位情况.[结果]鸡与鸭和鹅的FoxO3氨基酸序列相似性分别为92.7%和95.3%,基于FoxO3氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示鸡与鸭和鹅的亲缘关系较近,说明FoxO3基因的进化相对较保守.在不同发育阶段的鸡卵巢组织中均能检测到FoxO3基因表达,且FoxO3基因在0日龄鸡卵巢组织中的相对表达量最高,显著高于在其他发育阶段的相对表达量(P<0.05).在0日龄鸡卵巢组织中未检测到FoxO3蛋白,但在21日龄和成年鸡的卵巢组织中均能检测到FoxO3蛋白;在21日龄鸡卵巢组织中FoxO3蛋白主要定位在原始卵泡细胞周围,在卵泡内部没有表达;而在成年鸡卵巢组织中FoxO3蛋白仅定位于大卵泡细胞边缘,小卵泡细胞内并未发现FoxO3蛋白.[结论]由于鸡和哺乳动物的FoxO3氨基酸序列高度同源,且FoxO3蛋白在鸡卵巢组织中的定位与在哺乳动物卵巢组织中的定位相似,说明FoxO3在鸡卵巢组织中发挥着与哺乳动物相似的功能,即在卵泡激活与成熟过程中发挥重要作用,因此通过调控FoxO3能有效提高鸡的繁殖性能.     

牛卵巢腔前卵泡的机械分离试验

机械方法处理胎牛、犊牛和成年牛卵巢可以获得大量的腔前卵泡。胎牛卵巢用眼科手术剪刀剪碎（Ｍ１）或用组织切碎机切碎（Ｍ２）,犊牛和成年牛卵巢用组织切碎机切碎,经悬浮吹打和过滤,平均每只卵巢可获得腔前卵泡胎牛为３２８２（Ｍ１）和５６８８（Ｍ２）,犊牛为２１００,成年牛为３５２．在所分离的胎牛和犊牛卵巢卵泡中原始卵泡和初级卵泡占绝大部分,而成年牛卵巢卵泡主要是初级卵泡和次级卵泡。不论是胎牛、犊牛或成年牛,从其所分离的绝大部分腔前卵泡外观质量完好     

促卵泡素分泌细胞在广西摩拉水牛脑垂体中的分布与定位

采用免疫组织化学SABC法并结合DAB显色技术对广西摩拉水牛脑垂体结构和促卵泡素分泌细胞进行了研究和定位.结果发现,广西摩拉水牛的垂体前叶由远侧部、结节部和中间部构成,远侧部占据了腺垂体的大部分.垂体促卵泡素免疫阳性细胞分布广泛,以垂体前叶远侧部分布较多,从而表明广西摩拉水牛整个垂体都有促卵泡素分泌,主要分泌部位在垂体前叶的远侧部.     

MiR-143在山羊卵巢组织中的表达及功能分析

旨在分析miR-143在妊娠与非妊娠山羊卵巢组织中的表达情况,并探讨其在山羊卵巢功能发挥以及其他生物学过程中所起的作用。采用Solexa测序及荧光定量PCR技术在妊娠和非妊娠山羊卵巢组织中检测miR-143的表达水平,并对其进行靶基因预测和GO富集分析。Solexa测序在山羊卵巢中检测到miR-143的表达,共发现miR-143及其异构体1 074个,总拷贝数为109 523,平均拷贝数为102;定量结果显示miR-143在妊娠山羊卵巢中的表达量是非妊娠山羊的12倍且差异显著(P0.05);GO分析表明miR-143广泛参与机体生殖发育、细胞增值分化等多个生物学过程。miR-143在妊娠山羊卵巢中的表达水平显著高于非妊娠山羊,而且其可能在卵巢激素分泌与作用应答、妊娠维持等生殖生物学过程中发挥潜在作用。     

MiR-143在山羊卵巢组织中的表达及功能分析

旨在分析miR-143在妊娠与非妊娠山羊卵巢组织中的表达情况,并探讨其在山羊卵巢功能发挥以及其他生物学过程中所起的作用。采用Solexa测序及荧光定量PCR技术在妊娠和非妊娠山羊卵巢组织中检测miR-143的表达水平,并对其进行靶基因预测和GO富集分析。Solexa测序在山羊卵巢中检测到miR-143的表达,共发现miR-143及其异构体1 074个,总拷贝数为109 523,平均拷贝数为102;定量结果显示miR-143在妊娠山羊卵巢中的表达量是非妊娠山羊的12倍且差异显著(P<0.05);GO分析表明miR-143广泛参与机体生殖发育、细胞增值分化等多个生物学过程。miR-143在妊娠山羊卵巢中的表达水平显著高于非妊娠山羊,而且其可能在卵巢激素分泌与作用应答、妊娠维持等生殖生物学过程中发挥潜在作用。     

催产素在广西本地水牛下丘脑-垂体-卵巢轴的免疫组化定位

[目的]研究催产素（OT）在广西本地水牛下丘脑、垂体及卵巢的分布,进而了解OT在下丘脑、垂体及卵巢三者之间分泌释放途径。[方法]采用免疫组织化学SuperPicTureTM二步法检测5头广西本地水牛的下丘脑、垂体和卵巢中催产素（OT）的分布情况。[结果]下丘脑中分泌OT的神经元主要分布在弓状核、视上核及室旁核,在腹内侧核、腹外侧核、交叉上核、背内侧核、乳头体、下丘脑前核等核团也有一定数量的阳性神经元;在腺垂体发现OT免疫反应阳性产物,自垂体柄和正中隆起的一侧可见平行排列的OT阳性神经纤维断续地延伸至神经部;卵巢中只在生殖上皮、卵泡颗粒细胞和黄体细胞发现有大量OT免疫阳性产物。[结论]首次发现OT存在于广西本地水牛下丘脑-垂体-卵巢轴的各个环节,并且下丘脑中各主要核团均有OT免疫阳性神经元的分布,尤其以弓状核、视上核、室旁核分布最多,为进一步研究OT的合成和作用机制提供形态学依据,并对广西本地水牛的繁殖育种及泌乳起到一定的参考指导作用。     

植物增殖细胞核抗原与DNA复制关系的研究现状

为了更深入的对植物增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)进行研究,本研究归纳了PCNA的研究现状,总结了PCNA的结构特征和包括PCNA参与DNA复制、DNA损伤修复和细胞周期调控等在内的PCNA的功能特点。目前有关PCNA的研究以医学和动物体为主,有关植物PCNA研究的报道很少且相对落后,但已有文献指出,PCNA调控DNA复制,参与DNA复制以确保植物体正常生长发育,因此植物PCNA的功能值得继续研究。     

GnRH在广西摩拉杂交水牛乳腺中的免疫组化定位及其受体基因表达的研究

采用免疫组化及RT-PCR技术检测广西摩拉杂交水牛乳腺组织中的促性腺激素释放激素(GnRH)及其受体.结果表明,15份正常乳腺组织中有13份呈GnRH免疫阳性反应,免疫阳性产物主要集中在腺泡细胞的胞质和胞膜,胞核无特异性染色;同时扩增的目的条带大小为1 008bp,与促性腺激素释放激素受体(GnRHR)基因片段大小一致.     

Mitf-M在羊驼皮肤组织的表达与序列分析及免疫组织化学定位

【目的】克隆羊驼皮肤组织表达的Mitf-M CDS序列,比较分析羊驼皮肤组织Mitf-M的特征,进一步定位分析Mitf-M蛋白表达的位置,为深入研究羊驼毛色基因表达机制奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增方法分段扩增Mitf-M CDS区,分别利用Clustal X和BioEdit生物学软件对氨基酸序列进行多重序列比较分析,免疫组织化学技术对Mitf-M蛋白定位分析。【结果】羊驼皮肤组织表达的Mitf-M的CDS区由419个氨基酸组成,具有bHLH-zip转录家族的保守结构域,该基因与牛和犬亲缘关系最近,Mitf-M蛋白主要分布于羊驼皮肤组织毛球基底层细胞之间与毛乳头周围的黑色素细胞中。【结论】与其它物种相比较,羊驼皮肤组织表达的Mitf-M蛋白保守性很强,在进化过程中的变异不大,可见Mitf-M为毛发的色素沉积提供重要的物质基础。     

水牛Cdc42cDNA的克隆与生物信息学分析

通过RT-PCR扩增得到水牛细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)cDNA序列,将扩增产物与pMD20-T载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序并进行生物信息学分析.结果表明:克隆得到的序列全长626 bp,含有1个大小为576 bp的开放阅读框,共编码191个氨基酸,相对分子质量为21.3×103,理论等电点为6.1...     

广西水牛ghrelin cDNA的克隆及序列分析

[目的]克隆广西水牛ghrelin的cDNA并对其进行序列分析。[方法]以广西沼泽型水牛的真胃底组织总RNA为模板,用特异性引物扩增ghrelin的cDNA。扩增产物经凝胶回收纯化后与pMD 18-T连接并转化大肠杆菌DH5d,转化产物经PCR和双酶切鉴定后筛选出阳性克隆,阳性克隆经5×1ml LB液体培养基培养鉴定后测序。[结果]成功获得了广西水牛ghrelin的cDNA,该片段长339bp,编码113个氨基酸。BLAST分析结果表明,该片段与黄牛前原ghrelin基因仅有6个碱基的差异,同源性为98．2％;而两者ghrelin均由27个氨基酸组成,序列同源性为1013％。[结论]为进一步研究ghrelin基因的生物学功能提了供理论基础。     

家蚕空泡型ATP酶（V-ATPase）基因的基本信息及表达特征

【目的】鉴定家蚕（Bombyx mori）中的空泡型ATP酶（vacuolar-type ATPase, V-ATP酶）A、B亚基的编码基因,并调查其在家蚕幼虫5龄第3天不同组织和上蔟时期丝腺不同区段的表达特征。【方法】利用生物信息学的方法鉴定家蚕的V-ATP酶A、B亚基的编码基因并在线预测V-ATP酶两个亚基所具有的结构域,采用软件将其分别与其他物种中V-ATP酶A、B亚基的氨基酸序列进行同源序列比对和进化树的构建,通过荧光定量PCR技术分析家蚕V-ATP酶A、B亚基的编码基因在5龄第3天家蚕各组织的表达情况。进一步利用向家蚕幼虫上蔟时期的气孔注射pH值指示剂溴酚蓝,对丝腺进行染色,通过颜色变化对丝腺不同区段的pH值进行调查。最后,采用荧光定量PCR对家蚕上蔟时期丝腺不同区段V-ATP酶A、B亚基编码基因的表达情况进行分析。【结果】获得了家蚕V-ATP酶A、B亚基的编码基因BGIBMGA008295(GenBank登录号NM_001098359.1)和BGIBMGA002241(GenBank登录号NM_001098358.1)。结构域预测发现这两个亚基均具有3个非常保守的结构域,分别为位于N端的β筒结构域、序列中部的核苷酸结合结构域和C端结构域。将这两个基因编码的V-ATP酶A、B亚基的氨基酸序列与其他物种V-ATP酶A、B亚基的氨基酸序列进行同源性比对和进化树的构建,同源比对结果发现不同物种中V-ATP酶A、B亚基的氨基酸相似度为90%,保守结构域间相似度高达95%以上,说明不同物种间V-ATP酶A、B亚基高度保守。进化树显示家蚕V-ATP酶A、B亚基与同属于鳞翅目的其他昆虫的V-ATP酶A、B亚基亲缘关系较近。5龄第3天家蚕各组织中V-ATP酶A、B亚基编码基因的荧光定量PCR结果显示,这两个基因主要在中肠、脂肪体、生殖腺和丝腺中表达。使用溴酚蓝染色的方法分析上蔟期丝腺不同区段的pH情况,结果显示家蚕后部丝腺、中部丝腺后区和中区为中性或碱性环境,中部丝腺前区pH急剧下降到酸性环境,前部丝腺也为酸性环境。进一步对V-ATP酶A、B亚基编码基因在上蔟期丝腺不同区段进行表达情况分析,发现V-ATP酶A、B亚基基因在前部丝腺和中部丝腺前区高量表达,推测V-ATP酶可能与这两个区域低pH环境的产生和维持相关。【结论】明确了V-ATP酶在家蚕各组织的表达情况,V-ATP酶可能与中部丝腺前区和前部丝腺腺腔的酸化相关,这为进一步研究V-ATP酶的生理功能提供了理论依据。     

卵巢恶性上皮性肿瘤中HLA-DR表达及树突细胞浸润的意义

目的：探讨卵巢癌中HLA-DR抗原表达和树突细胞浸润的情况及其意义。方法：用免疫组化S-P法对卵巢恶性上皮性肿瘤(48例)、良性上皮性肿瘤(30例)及正常卵巢(30例)的HLA-DR抗原表达及树突细胞浸润情况进行对照研究。结果：正常卵巢组织中HLA-DR阴性,卵巢恶性上皮性肿瘤中HLA-DR表达阳性率为52.08％(P＜0.01);HLA-DR表达率与肿瘤分化程度相关(P＜0.01),且与预后相关(P＜0.05);卵巢恶性上皮性肿瘤中树突细胞(S-100+DC)浸润显著增加(P＜0.001);S-100+DC浸润与肿瘤间质淋巴细胞浸润相关(P＜0.01);S-100+DC浸润与肿瘤患者预后相关(P＜0.05)。结论：卵巢恶性上皮性肿瘤中HLA-DR抗原表达增强,树突细胞浸润增加,二者可能是局部抗肿瘤免疫的重要环节;HLA-DR和树突细胞浸润数量可作为提示卵巢癌患者预后的指标。     

核转录因子在卵巢癌组织及细胞系的表达和意义

培养11株卵巢癌细胞系,收获细胞,对其进行胞质、胞核蛋白质提取,Western-blotting观察核转录因子(NFkB)家族蛋白及其抑制物的表达;采用免疫组化方法检测卵巢良性上皮性肿瘤、卵巢交界性上皮性肿瘤和卵巢癌中NFkB蛋白的表达。结果表明:111个卵巢癌细胞系P50、P65和IkB-α胞质表达阳性率分别为63.6%、45.5%、81.9%,胞核表达阳性率分别为63.6%、54.5%、18.2%。2在卵巢良性上皮性肿瘤、卵巢交界性上皮性肿瘤和卵巢癌中NFkB的阳性表达率分别为33.3%、37.5%和65.0%;3在卵巢癌组织,P65核染色阳性与分化程度、淋巴结转移、临床分期及肿瘤大小明显相关(P<0.05)。NFkB与卵巢癌细胞的发生、发展有关,NFkB可望成为判断卵巢癌预后新的标志物。