小麦新品种“川农16”低分子量谷蛋白亚基新基因的分子克隆

采用PCR方法从小麦（Triticum aestivum L.）新品种“川农16”中克隆得到一个低分子量谷蛋白亚基（LMW-GS）新基因LMWCN16-2（GenBank No.AY296753）。该基因具有LMW-GS基因的典型结构特征，编码区全长906 bp，编码301个氨基酸。推导氨基酸序列比较显示，LMWCN16-2与已报道的LMW-GS基因，尤其是Glu-A3位点编码的基因序列有很     

小麦高分子量谷蛋白12亚基基因mRNA的定量分析

利用RT-PCR的方法研究小麦籽粒灌浆期高分子量谷蛋白12亚基基因mRNA的表达水平。东农7742的12亚基在开花后第6天出现mRNA的表达，花后14d表达量最高。新克旱9的12亚基mRNA的表达出现在开花后第10天，第18天表达量达最高。在籽粒灌浆的各个时期，东农7742的12亚基基因的mRNA的表达量均明显高于新克旱9。     

小麦不同品种高分子量谷蛋白亚基积累动态的研究

以不同品质类型的春小麦品种为材料,研究灌浆期籽粒贮藏蛋白中高分子量谷蛋白亚基积累动态.研究结果表明,小麦高分子量谷蛋白亚基是在籽粒形成过程中逐渐形成的.东农7742高分子量谷蛋白亚基在开花后10 d开始出现,14 d亚基全部形成.新克旱9在开花后12 d亚基开始出现,18 d亚基全部形成.新克旱9比东农7742亚基形成晚2～4 d.高分子量谷蛋白亚基的积累在籽粒形成初期,积累量少,随籽粒的灌浆,谷蛋白亚基积累渐增.东农7742和新克旱9均在开花后20 d亚基积累速度加快,花后22～26d积累最快,但东农7742的亚基积累强度和积累总量明显高于新克旱9,表现出2个品种亚基动态形成和积累以明显差异的特点.     

小麦编码高分子量谷蛋白亚基基因的转化

以小麦的幼穗和幼胚作为转化受体,首次用抗除草剂草甘麟的EPSPs基因作为选择标记,通过基因枪法共转化,将小麦编码高分子量谷蛋白亚基的基因1Dx5和1Dy10转移到普通小麦京花1号中,获得33株再生植株,经PCR初步检测有12株同时扩增到了3个处在不同质粒上的外源基因EPSPs, 1Dx5和1Dy10的目标片段。将部分PCR检测为阳性的转化体     

小麦胚乳贮藏蛋白高分子量谷蛋白亚基1Dy10单克隆抗体在品质育种…

本文研究利用高分子量谷蛋白亚基１Ｄｙ１０特异性单克隆抗体测定小麦胚乳贮藏蛋白中是否含有优质亚基１Ｄｘ５＋１Ｄｙ１０的免疫化学测定条件，建立适宜的间接ＥＬＩＳＡ测定法。结果表明：蛋白质提取剂种类对籽粒贮藏蛋白提取效率及１Ｄｘ５＋１Ｄｙ１０与１Ｄｘ２＋１Ｄｙ１２亚基的识别起决定作用。其中以１０ｍＭ ＨＣｌ较理想，还原剂ＤＴＴ能提高１Ｄｘ５＋１Ｄｙ１０与１Ｄｘ２＋１Ｄｙ１２亚基的识别能力，蛋白提取时间、     

3个新疆地方小麦品种Glu-A3位点低分子量谷蛋白亚基新基因的序列分析

麦谷蛋白可分为高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS),其中低分子量麦谷蛋白亚基对小麦品质具有重要影响.本文采用PCR方法从中国小麦微核心种质中的3个新疆小麦品种红春麦(新疆玛纳斯)、红春麦(新疆昌吉)和红金包银(新疆伊吾)中分别得到了3个低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-CS)新基因(GenBank:DQ519084、DQ519085和DQ517534).它们具有LMW-i型基因的典型结构特征,与已报道的Glu-A3位点编码的LMW-GS基因序列有很高的一致性,高达79.06%～94.24%.DQ519084和DQ517534在C末端保守区有9个半胱氨酸残基,DQ519085其编码区内存在1个提前终止密码子,推测其为假基因.     

小麦地方品种高分子量谷蛋白亚基多样性分析

采用SDS-PAGE方法,对我国9个麦区的76份代表性地方品种的高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)组成比较分析,并探讨其与环境因素(平均海拔、年平均降雨量和年平均温度)的相关性。结果表明,25.0%的品种具有异质性,分别包含2~4种不同HMW-GS组合;在Glu-1位点共检测到14个等位变异,其中Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1等位变异数分别为2、7和5;发现了3个新等位变异,包括Glu-B1位点2个和Glu-D1位点1个。所有等位变异构成16种不同的亚基组合类型,以(N, 7+8, 2+12)为主,频率为69.7%。在Glu-1位点上,不同麦区遗传多样性分布存在一定的不均衡性,年平均降雨量和年平均温度与麦区多样性指数呈负相关。推测环境压力可能是地方品种多样性地区分化的重要因素。     

小麦品种陕253 γ-醇溶蛋白基因的克隆、原核表达与功能鉴定

利用设计合成的特异γ-醇溶蛋白基因引物,采用PCR方法从小麦品种陕253克隆获得一个γ-醇溶蛋白基因(GenBank登录号GQ857626)。序列分析表明,该基因编码产物的II区由于碱基转换产生一个额外的半胱氨酸残基。构建了GQ857626的原核表达载体并转入表达菌株E. coli Rosetta gami B(DE3),IPTG诱导其成功表达。使用HisTrap HP组氨酸标记亲和层析柱纯化该基因的表达产物,并使用4 g粉质仪分析其功能。结果显示,将此纯化蛋白通过氧化还原反应整合到基础面粉后,面团的形成时间缩短,稳定时间减少,弱化度增加,导致主要的粉质指数明显下降,说明该亚基对面团流变学性质整体表现不利。     

低分子量谷蛋白亚基GlU-A3和GlU-B3位点对小麦面筋强度和烘焙特性影响

低分子量谷蛋白亚基是小麦谷蛋白亚基的重要组成部分,黄淮麦区小麦低分子量谷蛋白亚基组成对品质的效应尚缺乏系统的研究。本研究采用SDS-PAGE方法,鉴定了黄淮麦区42个小麦品种的Glu-A3位点和Glu-B3位点低分子量谷蛋白亚基组成,分析了低分子量谷蛋白亚基对小麦面筋强度和烘烤品质的影响。结果表明,在Glu-A3位点,对面筋强度和面包烘焙品质正向效应为:d,b>a,e;在Glu-B3位点,对面筋强度正效应为:h,d>f>g,b,j,对面包烘焙品质正向效应为:h>f,d>g,b,j。Glu-A3d/Glu-B3h亚基组合具有较好的面筋强度和烘焙品质。就低分子量谷蛋白亚基单个变异位点对品质综合效应而言,Glu-B3位点对品质作用比较大,与Glu-B1位点相近,同时,高低分子量谷蛋白亚基之间存在着互作效应,以Glu-B1/Glu-A3和Glu-D1/Glu-B3位点的互作效应比较显著。Glu-A3和Glu-B3位点及其所编码的不同亚基种类对品质的效应差异显著,并且与高分子量谷蛋白亚基位点存在互作,对不同位点优质亚基的聚合将有助于小麦品质的遗传改良。     

铁皮石斛DoSAMDC-like基因的克隆及原核表达

本研究从药用植物铁皮石斛中克隆得到S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosyl-L-methionine decarboxylase)基因(DoSAMDC-like)并进行序列分析和原核表达。SAMDC基因家族具有多个成员,本研究采用同源克隆的方法对铁皮石斛中尚未报道的新成员DoSAMDC-like基因进行克隆,并与拟南芥SAMDC基因家族成员和铁皮石斛基因组注释序列进行比对分析、蛋白质特征及原核表达等分析。基因序列分析表明,DoSAMDC-like基因编码区全长1104 bp,推测编码368个氨基酸,氨基酸序列具有SAM_decarbox超家族共同的保守结构域。多序列比对及进化树结果表明,克隆获得的DoSAMDC-like基因序列对应于基因组测序注释的XM_020825443.2序列,一致性为99.55%,与铁皮石斛SAMDC1基因一致性为80.16%。异源表达结果表明,DoSAMDC-like基因受IPTG诱导,蛋白分子量约为47 kD。DoSAMDC-like基因的克隆和原核表达,可为参与铁皮石斛多胺代谢、生物碱合成相关基因的蛋白质生化活性等研究提供了帮助。     

花后干旱和渍水对小麦籽粒HMW-GS及GMP含量的影响

采用SDS-PAGE和切胶比色进行亚基定量，研究花后干旱和渍水对小麦强筋品种豫麦34和弱筋品种扬麦9号籽粒HMW-GS和GMP含量的影响。结果表明，两品种的干旱处理和豫麦34淹水处理在花后10 d籽粒HMW-GS形成，两品种对照和扬麦9号淹水处理在花后15 d籽粒HMW-GS形成，说明花后干旱提早了小麦籽粒HMW-GS的起始形成。干旱促进了小麦籽粒HMW-GS早期积累，但对后期积累不利，使快速积累期缩短，渍水处理更明显缩短籽粒HMW-GS快速积累期。两品种成熟期总HMW-GS和GMP含量表现为对照>干旱>渍水，且豫麦34各处理大于扬麦9号的对应处理。     

番茄褪绿病毒CP基因克隆、序列分析及原核表达

为制备番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)抗血清,以番茄病叶为试验材料,提取总RNA,根据To CV CP基因设计特异性引物,利用RT-PCR方法克隆目的基因,构建原核表达载体p ET32a-To CVCP,在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中表达CP蛋白。结果表明:To CV CP基因(Gen Bank登录号:KT809400)全长774 bp,编码257个氨基酸,与Gen Bank中其他地区分离物核苷酸序列同源性为97.2%~99.6%,推导的氨基酸序列同源性为97.3%~100.0%。核苷酸序列保守位点占全部位点的91.3%,氨基酸序列保守位点占全部位点的88.3%,表明不同地理来源的番茄褪绿病毒的CP基因保守性较高。将To CV CP基因克隆到原核表达载体p ET-32a(+)上,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白。SDS-PAGE分析表明,转p ET32a-To CVCP载体的大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株表达了分子量约33 k Da的重组蛋白。该重组蛋白在37℃,1.0 mmol/L IPTG、诱导6 h,表达量最大。     

磷肥对小麦籽粒HMW-GS积累及GMP粒度分布的影响

在112.5 kg hm^-2和225 kg hm^-2两种氮水平下,检测了施磷量对强筋小麦山农12籽粒高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)积累及谷蛋白大聚合体(GMP)粒度分布的调控效应。结果表明,小麦籽粒HMW-GS在花后14 d已形成, 成熟期籽粒HMW-GS含量表现为施磷处理高于不施磷处理。在低氮条件下,施磷有助于HMW-GS的积累,而在正常施氮条件下过多施磷则不利于其积累。在低氮条件下,粒径<10 μm GMP颗粒体积百分比随施磷量增加而显著降低;在正常氮水平下,施磷降低粒径<10 μm GMP颗粒体积百分比,其效应表现施磷0 kg hm^-2处理最大,其次为施磷40 kg hm^-2和100 kg hm^-2处理,施磷160 kg hm^-2处理最小。两种施氮水平下分别增施磷肥,粒径在10~100 μm和>100 μm GMP颗粒的体积百分比均呈现随磷肥用量增加而增加的趋势。在正常氮水平下,各施磷处理间籽粒中GMP颗粒数目百分比无明显差异。成熟期籽粒中HMW-GS含量与粒径<10 μm GMP颗粒体积百分比呈显著负相关,而与10~100 μm GMP颗粒体积百分比呈显著正相关。说明较大粒径GMP颗粒具有较高的HMW-GS含量。     

阳春砂WRKY40的克隆、分析及原核表达

转录因子可有效调控植物次生代谢产物的生物合成,本研究从姜科药用植物阳春砂(Amomum villosum Lour.)中克隆获得两个WRKY转录因子基因,命名为AvWRKY 40-1和AvWRKY 40-2。两个基因的编码框分别为852 bp和885 bp,分别编码283和294个氨基酸。Av WRKY 40-1和Av WRKY 40-2编码的蛋白序列一致性为75%,在GenBank中均比对上拟南芥的WRKY 40,且均含有WRKY转录因子家族所共有的WRKKYGQK七肽序列及CX5CX23HNH锌指结构域。系统发育进化树表明:Av WRKY 40-1和Av WRKY 40-2与菠萝(Ananas comosus)的AcWRKY 71亲缘关系最近,且与单子叶植物的WRKY聚为一支。两个基因在阳春砂果皮和种子团中的表达有差异,并且与阳春砂转录组中筛选出来的萜类合酶基因表达相关性也存在差异,AvWRKY 40-1表现出与萜类合酶基因更高的相关性。成功构建了两个基因的重组表达载体pDEST 17-Av WRKY 40-1和pDEST 17-Av WRKY 40-2,经诱导表达得到其融合蛋白。本研究首次克隆阳春砂的WRKY类转录因子基因并获得其融合蛋白,为后续Av WRKY 40-1和Av WRKY 40-2的功能鉴定及其对萜类的代谢调控研究提供基础。     

Effect of Shading from Jointing to Maturity on High Molecular Weight Glutenin Subunit Accumulation and Glutenin Macropolymer Concentration in Grain of Winter Wheat

Accumulations of high molecular weight glutenin subunits (HMW‐GS) and glutenin macropolymer (GMP) in wheat grains are important indicators of grain quality. Two wheat cultivars, Yangmai 158 (shading tolerant) and Yangmai 11 (shading intolerant) which contains the same subunit pairs of 7 + 8 and 2 + 12, were used to evaluate the impacts of shading on HMW‐GS accumulation and GMP concentration in the grain. Three shading levels were implemented from jointing to maturity, i.e. S1, S2 and S3, in which the plants received 8 %, 15 % and 23 % less radiation of the control (S0), respectively. The initial formation of HMW‐GS was pre‐dated by shading. The rapid HMW‐GS accumulation duration was shortened, and the accumulation rate during late grain filling period was lowered in the two relatively severe shaded treatments (S2 & S3). Thus, the total HMW‐GS accumulation in single grain at maturity was lower in S2 and S3 than in the control (S0). However, concentrations of HMW‐GS and GMP at maturity increased because of the reduced single grain weight in S2 and S3, as compared to S0. In contrast, the low density shading (S1) prolonged the rapid accumulation duration of HMW‐GS, hence increased the accumulation and concentration of HMW‐GS in the grains. Consequently, S1 reduced falling number and SDS‐sedimentation volume, while shortened dough development time (DDT) and dough stability time (DST). In contrast, S2 and S3 increased falling number, wet‐gluten concentration and SDS‐sedimentation volume, and lengthened the DDT and DST. In addition, the fluctuations in accumulations of HMW‐GS and GMP and most quality traits because of shading in Yangmai 158 were less than Yangmai 11. The interrelations between HMW‐GS accumulation, GMP concentration and quality of grain and dough were further discussed.     

硬粒小麦Glu-B3基因家族新成员的克隆及其分子标记的开发

获得小麦低分子量谷蛋白基因家族新成员, 为深入研究该基因家族的组成及其在染色体上的分布与进化奠定基础。本研究根据已发表的小麦低分子量麦谷蛋白基因序列设计了1对简并引物, 以从硬粒小麦品种Langdon BAC文库中筛选的携带小麦低分子量谷蛋白基因的BAC为模板, 利用同源序列克隆技术克隆了1个MET类型的小麦低分子量谷蛋白基因LMWLDN-M, 该基因编码350个氨基酸。利用LMWLDN-M与本实验室克隆的Langdon品种其他类型的小麦低分子量谷蛋白基因之间的SNP, 设计了该类型基因特异的引物。以Langdon代换系和中国春小麦缺体-四体为模板进行PCR扩增, 将该基因定位到小麦B基因组上。序列分析表明, LMWLDN-M为Glu-B3基因家族的一个新成员。