小麦新品种“川农16”低分子量谷蛋白亚基新基因的分子克隆

采用PCR方法从小麦（Triticum aestivum L.）新品种“川农16”中克隆得到一个低分子量谷蛋白亚基（LMW-GS）新基因LMWCN16-2（GenBank No.AY296753）。该基因具有LMW-GS基因的典型结构特征,编码区全长906 bp,编码301个氨基酸。推导氨基酸序列比较显示,LMWCN16-2与已报道的LMW-GS基因,尤其是Glu-A3位点编码的基因序列有很     

小麦高分子量谷蛋白12亚基基因mRNA的定量分析

利用RT-PCR的方法研究小麦籽粒灌浆期高分子量谷蛋白12亚基基因mRNA的表达水平。东农7742的12亚基在开花后第6天出现mRNA的表达,花后14d表达量最高。新克旱9的12亚基mRNA的表达出现在开花后第10天,第18天表达量达最高。在籽粒灌浆的各个时期,东农7742的12亚基基因的mRNA的表达量均明显高于新克旱9。     

小麦不同品种高分子量谷蛋白亚基积累动态的研究

以不同品质类型的春小麦品种为材料,研究灌浆期籽粒贮藏蛋白中高分子量谷蛋白亚基积累动态.研究结果表明,小麦高分子量谷蛋白亚基是在籽粒形成过程中逐渐形成的.东农7742高分子量谷蛋白亚基在开花后10 d开始出现,14 d亚基全部形成.新克旱9在开花后12 d亚基开始出现,18 d亚基全部形成.新克旱9比东农7742亚基形成晚2～4 d.高分子量谷蛋白亚基的积累在籽粒形成初期,积累量少,随籽粒的灌浆,谷蛋白亚基积累渐增.东农7742和新克旱9均在开花后20 d亚基积累速度加快,花后22～26d积累最快,但东农7742的亚基积累强度和积累总量明显高于新克旱9,表现出2个品种亚基动态形成和积累以明显差异的特点.     

小麦编码高分子量谷蛋白亚基基因的转化

以小麦的幼穗和幼胚作为转化受体,首次用抗除草剂草甘麟的EPSPs基因作为选择标记,通过基因枪法共转化,将小麦编码高分子量谷蛋白亚基的基因1Dx5和1Dy10转移到普通小麦京花1号中,获得33株再生植株,经PCR初步检测有12株同时扩增到了3个处在不同质粒上的外源基因EPSPs, 1Dx5和1Dy10的目标片段。将部分PCR检测为阳性的转化体     

小麦胚乳贮藏蛋白高分子量谷蛋白亚基1Dy10单克隆抗体在品质育种…

本文研究利用高分子量谷蛋白亚基１Ｄｙ１０特异性单克隆抗体测定小麦胚乳贮藏蛋白中是否含有优质亚基１Ｄｘ５＋１Ｄｙ１０的免疫化学测定条件，建立适宜的间接ＥＬＩＳＡ测定法。结果表明：蛋白质提取剂种类对籽粒贮藏蛋白提取效率及１Ｄｘ５＋１Ｄｙ１０与１Ｄｘ２＋１Ｄｙ１２亚基的识别起决定作用。其中以１０ｍＭ ＨＣｌ较理想，还原剂ＤＴＴ能提高１Ｄｘ５＋１Ｄｙ１０与１Ｄｘ２＋１Ｄｙ１２亚基的识别能力，蛋白提取时间、     

3个新疆地方小麦品种Glu-A3位点低分子量谷蛋白亚基新基因的序列分析

麦谷蛋白可分为高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS),其中低分子量麦谷蛋白亚基对小麦品质具有重要影响.本文采用PCR方法从中国小麦微核心种质中的3个新疆小麦品种红春麦(新疆玛纳斯)、红春麦(新疆昌吉)和红金包银(新疆伊吾)中分别得到了3个低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-CS)新基因(GenBank:DQ519084、DQ519085和DQ517534).它们具有LMW-i型基因的典型结构特征,与已报道的Glu-A3位点编码的LMW-GS基因序列有很高的一致性,高达79.06%～94.24%.DQ519084和DQ517534在C末端保守区有9个半胱氨酸残基,DQ519085其编码区内存在1个提前终止密码子,推测其为假基因.     

小麦地方品种高分子量谷蛋白亚基多样性分析

采用SDS-PAGE方法,对我国9个麦区的76份代表性地方品种的高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)组成比较分析,并探讨其与环境因素(平均海拔、年平均降雨量和年平均温度)的相关性。结果表明,25.0%的品种具有异质性,分别包含2~4种不同HMW-GS组合;在Glu-1位点共检测到14个等位变异,其中Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1等位变异数分别为2、7和5;发现了3个新等位变异,包括Glu-B1位点2个和Glu-D1位点1个。所有等位变异构成16种不同的亚基组合类型,以(N, 7+8, 2+12)为主,频率为69.7%。在Glu-1位点上,不同麦区遗传多样性分布存在一定的不均衡性,年平均降雨量和年平均温度与麦区多样性指数呈负相关。推测环境压力可能是地方品种多样性地区分化的重要因素。     

小麦品种陕253 γ-醇溶蛋白基因的克隆、原核表达与功能鉴定

利用设计合成的特异γ-醇溶蛋白基因引物,采用PCR方法从小麦品种陕253克隆获得一个γ-醇溶蛋白基因(GenBank登录号GQ857626)。序列分析表明,该基因编码产物的II区由于碱基转换产生一个额外的半胱氨酸残基。构建了GQ857626的原核表达载体并转入表达菌株E. coli Rosetta gami B(DE3),IPTG诱导其成功表达。使用HisTrap HP组氨酸标记亲和层析柱纯化该基因的表达产物,并使用4 g粉质仪分析其功能。结果显示,将此纯化蛋白通过氧化还原反应整合到基础面粉后,面团的形成时间缩短,稳定时间减少,弱化度增加,导致主要的粉质指数明显下降,说明该亚基对面团流变学性质整体表现不利。     

新疆小麦品种高分子量谷蛋白亚基及相关品质基因的分子标记检测

高分子量麦谷蛋白亚基、1B·1R易位系、多酚氧化酶(PPO)活性及黄色素含量等基因对小麦加工品质有重要影响,准确、快速鉴定这些基因对品质改良有重要意义.本研究对新疆当地及国内外引进的321份小麦品种进行SDS-PAGE分析,利用特异性分子标记对高分子量谷蛋白亚基中的Dx5、Bx7、By8、By9亚基、1B·1R易位系、PPO和黄色素含量基因进行鉴定.进一步验证分子标记检测的可靠性和准确性,为优质小麦分子标记辅助育种提供材料和方法.SDS-PAGE分析表明,供试材料有21种亚基类型,其中Glu-A1位点有3种类型,以null为主;Glu-B1位点有10种类型,Bx7+By8和Bx7+By9亚基占主导地位;Glu-DJ位点有8种类型,Dx2+Dy12和Dx5+Dy10占主导地位.分子标记检测表明,Dx5亚基的频率为38.3%,Bx7亚基的频率为85.7%,By8亚基的频率为38.9%,Bx9亚基的频率为42.7%;特异性PCR标记扩增与SDS-PAGE鉴定结果的吻合率分别为97.2%、98.4%、93.4%和97.2%.在新疆当地品种、其他国内品种和国外品种中,1B·1R易位系材料的频率分别为22.0%、31.5%和25.0%,Psy-A1b的频率分别为9.0%、10.8%和5.4%,Ppo-A1b的频率分别为38.0%、43.8%和45.7%,Ppo-Dla的频率分别为48.0%、66.9%和40.2%.同时含Ppo-A1b和Ppo-D1a的材料有74份,占23.0%.本试验中采用的基因特异性标记重复性好、准确率高,可有效用于小麦品质分子标记辅助选择.     

硬粒小麦Glu-B3基因家族新成员的克隆及其分子标记的开发

获得小麦低分子量谷蛋白基因家族新成员, 为深入研究该基因家族的组成及其在染色体上的分布与进化奠定基础。本研究根据已发表的小麦低分子量麦谷蛋白基因序列设计了1对简并引物, 以从硬粒小麦品种Langdon BAC文库中筛选的携带小麦低分子量谷蛋白基因的BAC为模板, 利用同源序列克隆技术克隆了1个MET类型的小麦低分子量谷蛋白基因LMWLDN-M, 该基因编码350个氨基酸。利用LMWLDN-M与本实验室克隆的Langdon品种其他类型的小麦低分子量谷蛋白基因之间的SNP, 设计了该类型基因特异的引物。以Langdon代换系和中国春小麦缺体-四体为模板进行PCR扩增, 将该基因定位到小麦B基因组上。序列分析表明, LMWLDN-M为Glu-B3基因家族的一个新成员。     

簇毛麦新型HMW-GS的序列分析及加工品质效应鉴定

利用设计的HMW-GS特异引物,从簇毛麦TA10220中克隆到6条HMW-GS基因序列(1.0~1.7 kb, GenBank登录号为KF887414~KF887419),比普通小麦HMW-GS基因序列小,其中KF887414~KF887417为能正常表达的基因,KF887418和KF887419是编码区出现终止信号的假基因。综合推导氨基酸的序列分析以及基于编码蛋白全序列、N-端和C-端域的进化树分析,认为KF887414属于y型HMW-GS,KF887415~KF887419的氨基酸序列同时具有x和y型的结构特征。将具有完整编码区的4个基因在宿主菌Escherichia coli Rosetta-gami B(DE3)中经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析表达的蛋白质和种子提取的HMW-GS,经Western blot进一步检测表达产物,证明蛋白质表达成功。通过His-Trap HP柱纯化表达蛋白,回收产物经SDS-PAGE分析后,低温冷冻干燥备用。将冷冻干燥的回收产物加入中国春基础面粉中,利用微量掺粉试验通过测定粉质参数来鉴定簇毛麦来源的HMW-GS对面粉品质的影响,结果表明,簇毛麦来源的4个HMW-GS对于面粉加工品质具有显著的正向效应。     

硬粒小麦Glu-B3基因家族新成员的克隆及其分子标记的开发

获得小麦低分子量谷蛋白基因家族新成员, 为深入研究该基因家族的组成及其在染色体上的分布与进化奠定基础。本研究根据已发表的小麦低分子量麦谷蛋白基因序列设计了1对简并引物, 以从硬粒小麦品种Langdon BAC文库中筛选的携带小麦低分子量谷蛋白基因的BAC为模板, 利用同源序列克隆技术克隆了1个MET类型的小麦低分子量谷蛋白基因LMWLDN-M, 该基因编码350个氨基酸。利用LMWLDN-M与本实验室克隆的Langdon品种其他类型的小麦低分子量谷蛋白基因之间的SNP, 设计了该类型基因特异的引物。以Langdon代换系和中国春小麦缺体-四体为模板进行PCR扩增, 将该基因定位到小麦B基因组上。序列分析表明, LMWLDN-M为Glu-B3基因家族的一个新成员。     

121份自选小麦新品种（系）高分子量麦谷蛋白亚基组成分析

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术对121份自选高代小麦品种（系）高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）进行鉴定;并对其亚基种类与组合类型等进行分析。结果表明:121份小麦品种共出现了9种亚基类型;其中Glu-A1位点包括1和N两种类型;Glu-B1位点包括7、7+8、7+9、13+16共4种类型;Glu-D1位点包括5+10、4+12、2+12共3种类型。121份小麦品种（系）共有10种亚基组合;其中1/7+8/5+10亚基组合类型最多;其频率为52.90%;其次是1/7+9/5+10、1/7+8/2+12、1/7+9/2+12;出现频率依次为23.14%、9.10%、5.79%;其他亚基组合类型频率低于5%。品质得分评判结果显示;所有品种（系）品质得分介于5~10分之间。研究表明;121份小麦新品种（系）的HMW-GS位点表现出较为丰富的多样性;优质亚基5+10出现频率最高;发现稀有亚基13+16;未发现有优质亚基2、14+15、17+18。     

PRRS病毒E基因的克隆及表达载体的构建

分别以质粒pBV221和pPIC9K为表达载体,成功构建了PRRS病毒E基因克隆载体,转化后经抗性筛选、PCR扩增、双酶切鉴定,确认得到了含有目的基因的阳性克隆。对含有E蛋白原核表达载体的阳性克隆进行诱导表达,经过酶联免疫鉴定,结果显示外源蛋白在宿主菌中有表达,成功实现了在大肠杆菌细胞中的克隆。本研究成功构建了PRRSV BJ-4毒株E基因的原核表达载体和真核表达载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

番茄褪绿病毒CP基因克隆、序列分析及原核表达

为制备番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)抗血清,以番茄病叶为试验材料,提取总RNA,根据To CV CP基因设计特异性引物,利用RT-PCR方法克隆目的基因,构建原核表达载体p ET32a-To CVCP,在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中表达CP蛋白。结果表明:To CV CP基因(Gen Bank登录号:KT809400)全长774 bp,编码257个氨基酸,与Gen Bank中其他地区分离物核苷酸序列同源性为97.2%~99.6%,推导的氨基酸序列同源性为97.3%~100.0%。核苷酸序列保守位点占全部位点的91.3%,氨基酸序列保守位点占全部位点的88.3%,表明不同地理来源的番茄褪绿病毒的CP基因保守性较高。将To CV CP基因克隆到原核表达载体p ET-32a(+)上,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白。SDS-PAGE分析表明,转p ET32a-To CVCP载体的大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株表达了分子量约33 k Da的重组蛋白。该重组蛋白在37℃,1.0 mmol/L IPTG、诱导6 h,表达量最大。     

施氮时期对小麦籽粒HMW-GS积累及GMP粒度分布的影响

在225 kg hm^-2施氮水平下, 设置起身肥(SE, GS 30), 拔节肥(JT, GS 32)和孕穗肥(BT, GS 41) 3个追施氮肥处理(底追比1:1), 研究了追肥时期对强筋小麦济南17和弱筋小麦鲁麦21籽粒HMW-GS积累和GMP粒度分布的影响。结果表明, 两品种籽粒HMW-GS于花后14 d均已形成, 济南17籽粒HMW-GS和GMP含量均高于鲁麦21, 说明强筋小麦具有较强的谷蛋白积累能力。济南17成熟期籽粒HMW-GS和GMP含量以SE处理最高, 施氮时期后移其含量呈下降趋势。JT处理显著提高鲁麦21灌浆中后期HMW-GS的积累速度, 延长HMW-GS的快速积累期。济南17 SE处理和鲁麦21 JT处理的籽粒x型亚基(1、4或5、7)在灌浆中后期的积累速率显著提高。追肥时期对y型亚基的积累速率无显著影响。追氮时期后移均提高两品种籽粒GMP小颗粒的(粒径<12 μm)体积和表面积百分比, 降低大颗粒(粒径>100 μm)体积和表面积百分比。济南17粒径>12 μm的GMP颗粒数目百分比因追氮时期后移而增加, 鲁麦21粒径>12 μm的GMP颗粒数目百分比则降低。含4+12亚基的强筋小麦济南17比含5+10亚基的弱筋小麦鲁麦21偏向于更高的大颗粒体积比例, 说明亚基间的聚合和GMP颗粒的分布不仅与亚基类型有关, 而且与单位面粉中亚基的含量密切相关。     

施氮量对小麦籽粒HMW-GS及GMP含量动态的影响

采用SDS-PAGE电泳和切胶比色进行亚基定量的方法;研究施氮量对2个小麦品种胚乳部分HMW-GS和GMP积累的影响。结果表明;高蛋白小麦品种徐州26在花后14 d HMW-GS就开始形成;低蛋白品种宁麦9号在花后21 d才开始形成。增施氮肥对小麦灌浆前期HMW-GS的形成作用不明显;而有利于徐州26 HMW-GS积累速度的提高和HMW-GS快速积累期的     

花生白藜芦醇合成酶基因PNRS1的克隆及其在原核中的表达

采用RT-PCR克隆花生白藜芦醇合成酶(resveratrol synthetic enzyme, RS)基因全长,命名为PNRS1,GenBank登录号为FM955393。序列分析表明该基因的开放读码框1 170 bp,编码389个氨基酸残基。以花生品种鲁花14基因组DNA为模板经PCR扩增,获得该基因的基因组序列长1 537 bp,包含2个外显子和1个内含子。比较发现,PNRS1与其他已知RS序列的同源性达91%~95%。表达模式分析显示,PNRS1在花生根中特异表达,并可被紫外线UV-B诱导。PNRS1与pET-28a(+)构建原核表达载体,经IPTG诱导后可表达获得相对分子量约为46 kD的外源融合蛋白。以上结果证实PNRS1属花生RS基因家族成员,并为进一步分析该基因的功能奠定了基础。