基于蛋白组学对苯胺降解菌 Rhodococcus sp. AN-P1 苯胺胁迫响应的研究

【目的】研究微生物在苯胺胁迫环境下的响应机制,揭示Rhodococcus sp.AN-P1适应、降解苯胺内在分子机理,弥补苯胺降解菌在苯胺胁迫下耐受机制的空白,为进一步调控提高微生物降解苯胺能力提供良好的靶点,为其生物修复研究奠定理论基础。【方法】采用双向电泳技术分离纯化Rhodococcus sp.AN-P1在苯胺、柠檬酸条件下表达的蛋白质组,并利用基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定显著差异表达蛋白,对比NCBInr蛋白数据库获得蛋白质点的详细信息。【结果】在以苯胺、柠檬酸为唯一碳源的条件下,Rhodococcus sp.AN-P1分别表达了681、579个蛋白质点;选取21个显著差异蛋白质点进行质谱分析,成功获得17个蛋白质点的相关信息,其分布于信号转导调节、氨基酸及能量代谢、细胞防御、苯胺降解酶多个代谢系统,并发现大部分蛋白质分子质量在31 000～58 000之间,等电点位于4～7之间。【结论】Rhodococcus sp.AN-P1在苯胺胁迫环境中会通过响应信号传导系统感知外界胁迫、调节氨基酸及能量代谢系统抵抗苯胺的毒害影响、利用细胞防御系统进一步提高其存活能力、表达苯胺降解酶系统降解苯胺获得碳源、氮源及能量来源,从而达到适应并降解高浓度苯胺的目的。     

甲基对硫磷降解菌Alcaligenes.sp.YcX-20的分离鉴定及降解性能研究

采用室内培养方法,对分离到的一株具有降解甲基对硫磷活性的细菌进行了鉴定,并对其降解性能进行了研究。通过形态观察、生理生化特征及16SrDNA同源性分析将其初步鉴定到属,并确定为产碱菌属的一个新种,命名为Alcaligenes.sp.YcX-20,16SrDNA序列在GenBank中注册号为AY628412。其酯酶活性随菌液浓度和培养时间的增加呈上升趋势;在基础培养基中可耐受700mg·L-1的甲基对硫磷,在普通培养基中耐受浓度达2500mg·L-1;X-20可降解甲基对硫磷形成对硝基苯酚;以甲基对硫磷为惟一碳源时,30℃培养30h降解率达60%。     

原油降解菌YSL28的分离鉴定及降解特性研究

取材受原油污染的土壤中分离得到一株石油降解菌YSL28,对原油的降解率为46.9％,通过形态、生理生化及16S rDNA序列分析进行初步鉴定.结果表明,该菌与红球红平菌(Rhodococcus erythropolis)的相似度最高,归属于Rhodococcus属.通过对降解条件的研究,确定降解菌YSL28的最佳降解条件为:初始pH 7.0、温度30℃、原油初始浓度5g·L-1、转速180 r·min-1.     

Rhodococcus sp.T1菌株胞内精恶唑禾草灵酯酶酶学性质及分离纯化

[目的] Rhodococcus sp.T1是一株高效的精恶唑禾草灵(FE)降解菌株,T1菌株可以断裂FE的酯键将其转化为精恶唑禾草灵酸(FA).对T1菌株胞内精恶唑禾草灵酯酶的酶学性质进行研究并对其进行分离纯化,以期为生物修复精恶唑禾草灵污染提供更多的理论依据.[方法]以酯酶的通用底物乙酸-1-萘酯作为定量测定胞内酯酶活力的底物,分析温度和pH值对酯酶活力和稳定性的影响,同时探讨金属离子对酯酶活力的影响;通过硫酸铵沉淀、疏水层析、DEAE离子交换层析和Superdex-200凝胶层析柱组合技术对精恶唑禾草灵酯酶进行分离纯化,计算了纯化过程中酯酶的比活力、纯化倍数和回收率.[结果]胞内酯酶最适反应pH值为8.0,在pH 4.0～ 10.0内处理24h活性稳定;最适反应温度为42℃,在温度50℃以下处理30 min活性稳定;1.0 mmol· L-1 Ag+对酯酶活力有强烈的抑制作用.纯化后的酯酶比活力从0.058 U· mg-1提高到21.5 U·mg-1,纯化倍数为369.5倍,回收率为3％.纯化后的粗酶经SDS-PAGE电泳后至少有4条明显的蛋白条带,通过酶谱确定精恶唑禾草灵酯酶条带的相对分子质量为42.3× 103.[结论]精恶唑禾草灵酯酶具有较好的酸碱稳定性和热稳定性,在精恶唑禾草灵污染土壤修复中可能具有较好的应用潜力.     

精噁唑禾草灵降解菌株Acinetobacter sp.T-1的分离鉴定及降解特性研究

从长期受精噁唑禾草灵污染的土壤中分离筛选得到了精噁唑禾草灵降解菌T-1,根据生理生化特性和16S rRNA同源性序列分析,将其鉴定为不动杆菌属(Acinetobacter sp.).菌株T-1能够以精噁唑禾草灵为唯一碳源进行生长,在5d内对50 mg· L-1精噁唑禾草灵的降解率可达95％以上.T-1降解精噁唑禾草灵的最适温度为37℃,而其在pH5～11的范围内对50 mg· L-1精噁唑禾草灵的降解率均可以达到85％以上.经LC-MS鉴定Acinetobacter sp.T-1降解精噁唑禾草灵的主要产物为精噁唑禾草灵酸,表明菌株T-1对精噁唑禾草灵的降解是通过断裂其酯键形成精噁唑禾草灵酸和乙醇实现的.     

苯胺降解菌的分离鉴定及其降解特性研究

通过驯化培养,从活性污泥中分离出一株高效苯胺降解菌,命名为菌株AN5.对该菌株进行了鉴定及降解特性研究.结果表明,分离菌株呈革兰氏染色阳性,细胞为球状或短杆状,菌落颜色呈橙红色.菌株AN5除可降解苯胺外,还可以苯酚、苯甲酸、萘为惟一碳源生长.它的部分长度16S rDNA序列分析表明,分离菌株AN5与嗜吡啶红球菌(Rhodococeus pyriainivorans)的16S rDNA序列具有99%相似性.实验采用PAUP 4.0软件包最大似然法对该菌株与相关菌进行系统发生分析.菌株AN5耐受苯胺的最高浓度可达5 000 mg·L-1.投加蛋白胨可以加速菌株对苯胺的降解.代谢机理研究证实, 菌株AN5在邻苯二酚-1,2-双加氧酶作用下经邻位裂解途径降解苯胺.     

原油降解菌YSL28的分离鉴定及降解特性研究

取材受原油污染的土壤中分离得到一株石油降解菌YSL28,对原油的降解率为46.9%,通过形态、生理生化及16S rDNA序列分析进行初步鉴定。结果表明,该菌与红球红平菌(Rhodococcus erythropolis)的相似度最高,归属于Rhodococcus属。通过对降解条件的研究,确定降解菌YSL28的最佳降解条件为:初始pH 7.0、温度30℃、原油初始浓度5 g.L-1、转速180 r.min-1。     

三价砷氧化细菌Acidovorax sp.GW2中As(Ⅲ)氧化酶基因和调控序列的克隆鉴定

通过反向PCR和细菌Fosmid文库筛选,克隆得到1株二三价砷[As(Ⅲ)]氧化细菌Acidovorax sp.GW2的As(Ⅲ)氧化酶Aox基因簇,包括aoxRSXABCD 7个基因,分别预测编码双组分信号传导系统转录调控子AoxR(同源性68%),周质感应组氨酸激酶AoxS(同源性55%),周质结合蛋白AoxX(同...     

苯胺降解菌的分离及降解特性研究

[目的]筛选高效苯胺降解菌并研究其降解特性。[方法]通过驯化富集培养,从河南某化工厂活性污泥中分离出1株以苯胺为唯一碳、氮源的高效苯胺降解菌DA-K,并对该菌株进行了生理生化鉴定和生物学降解特性研究。[结果]DA-K菌株呈革兰氏阴性,细胞为杆状,菌落颜色呈灰白色,初步确定为不动细菌属。通过测定,DA-K菌株生长的最适pH为6.0,最适温度为30℃,可在苯胺质量浓度为2 500 mg/L的无机盐培养基上生长良好。DA-K菌株在苯胺浓度为1 000 mg/L,pH 6.0,30℃,180 r/min的条件下振荡培养96 h,苯胺降解率接近80%。[结论]DA-K菌株苯胺降解效率较高,具有实际处理苯胺废水的能力,为构建基因工程菌奠定了基础。     

石油烃降解菌Rhodococcus sp.15-3的分离鉴定及特性研究

从原油污染土壤中分离筛选到一株石油烃降解菌15-3,根据其形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列同源性分析,将其初步鉴定为红球菌(Rhodococcus sp.).采用室内培养的方法,研究了15-3菌株对原油、原油中的烃类及正十八烷的降解作用.结果表明,15-3菌株能以正十八烷为惟一碳源生长,在48 h内对500 mg·L-1的正十八烷降解率达96.9%.15-3菌株降解正十八烷的最适温度、pH值和盐浓度(NaCl)分别为30℃、7.0、2%,在低温(10℃)及高盐(4%～5%NaCl)环境下也有良好的降解能力.15-3菌株可以降解原油中C,13～C,32的正构烷烃、芳香烃及姥鲛烷.在含5 g·L-1原油的培养基中,30℃培养5d后,菌株15-3对原油的降解率为60.3%,对原油中C,13～C,31烷烃的降解率均大于90%,对原油中芳香烃的降解率为63.6%.该菌株以石蜡为惟一碳源生长时能产生表面活性剂,将发酵液表面张力由58.11 mN·m-1降到36.6 mN·m-1,表明菌株15-3具有较强的乳化和分散石油的能力.     

苯酚降解菌DF51的分离鉴定，降解特性及其固定化的研究

从太原市郊苯酚污染的土样中分离到一株能以苯酚、苯甲酸、萘、联苯和苯并噻吩为唯一碳源和能源生长，并且具有同时分解单环和双环芳香类物质能力的菌株，经生理生化和16S rDNA基因序列分析鉴定为红球菌DF51(Rhodococcus sp. DF51). 在本实验条件下，菌株DF51能够有效降解浓度范围为100-800mg L-1的苯酚，该菌代谢苯酚主要是通过邻苯二酚1, 2-双加氧酶催化开环途径进行，同时辅以邻苯二酚2, 3-双加氧酶催化开环，表明菌株DF51兼有混浊红球菌(Rhodoccocus opacus R7)和红球菌PNAN5(Rhodoccocus sp. strain DF51)降解苯酚的途径. 菌株DF51固定化实验表明，该菌的固定化细胞具有降解苯酚的潜在应用价值.     

盐田土中中度嗜盐菌Pontibacillus sp. Y32的分离与鉴定

从江苏盐城三圩盐田土样中分离到一株中度嗜盐菌Y32并对其进行了系统鉴定。结果表明,综合该菌形态学、生理学和16S rRNA基因序列等特征,该菌为Pontibacillus属的一个新种,命名为Pon-tibacillus sp.Y32。菌种已送中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏,保藏号为CCAM 100050。     

苯胺高效降解菌的筛选及其生物学特性研究

采用富集培养法从高阳印染厂排污口土壤中分离得到209株微生物,定向筛选获得2株能够高效降解苯胺的细菌(菌株Ani-4-15和菌株Ani-5-61)。这2株细菌在苯胺浓度为400mg·L-1的培养液中培养30h后,培养液中苯胺的降解率均可达到85%以上;在苯胺浓度为1000mg·L-1的培养液中培养30h后,培养液中苯胺的降解率达70%左右。通过浊度测定法对菌株Ani-4-15和Ani-5-61在苯胺选择性培养基中的生长特性进行了研究,结果表明,两菌株最佳培养时间分别为15h和18h,最适生长温度均为30℃,最适生长pH值分别为7.0和6.0,对苯胺的耐受浓度范围在100～3200mg·L-1之间。在温室条件下,通过在灭菌土中分别接入一定量的苯胺(苯胺含量分别为400、600、800和1000mg·kg-1)和苯胺降解菌(106个菌体·g-1土),48h时菌株Ani-4-15和Ani-5-61对苯胺的降解率分别高达93.4%和96.6%。通过16SrDNA序列分析法明确了两株细菌均为假单胞菌属,利用非肠道革兰氏阴性杆菌鉴定系统(API20NE)进一步鉴定到种,菌株Ani-4-15为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida),菌株Ani-5-61为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)。     

Isolation and Characterization of E11 Gene Promoter from Tomato

A fragment of 2 000 bp upstream sequence of E11 clone was amplified from genomic DNA of the tomato cultivar Zhongshu5. Sequence analysis showed that the upstream contains the regulatory elements: TATA box (-29 - -22), CAAT box (-193- -189), wound, and drought response elements. Expression vectors of E11 promoter gus fusion were constructed with the promoters of 1 200 and 2 000 bp regions, respectively. Transgenic tomato plants were obtained through Agrobacteriummediated transformation. Histochemical analysis of GUS activity in various tissues showed that the two promoters were able to direct fruit-specific gene expression. The expression driven by promoter of 2 000 bp upstream fragment could increase GUS activity with the maturation of tomato fruits. The promoter of -1 200 bp fragment could direct gus gene expression in fruits with the inductions of drought and wounding. The regulatory region for fruit-specificity was probably located in the region of 1200 bp of 5'-flanking sequence and some positive regulatory elements or enhancers may exist in the region from -1200 to -2000 bp.     

香蕉枯萎病菌fgb2基因的克隆与序列分析

为了解fgb2基因在尖孢镰刀菌古巴专化型侵染香蕉过程中的作用,及其与尖孢镰刀菌古巴专化型1号和4号生理小种之间的致病力差异关系,采用PCR和RT—PCR方法扩增了2个生理小种的fgb2基因,并对其扩增产物进行了测序及相似序列搜索和比对,同时还对其基因编码的蛋白进行了氨基酸序列比对和功能分析。结果表明,2个生理小种fgb2基因开放阅读框分别为1466bp和1452bp,基因同源性为96．33％;其编码的氨基酸数量分别为299个和316个;从．詹62基因序列及其编码蛋白的氨基酸序列来看,2个生理小种的致病力差异与詹62基因并无明显对应关系。     

来源于云斑天牛肠道细菌Pseudomonas sp. TN06的β-折叠桶植酸酶基因phyA06的克隆、表达和酶学性质研究

从云斑天牛肠道中筛选到一株产植酸酶活性较高的假单胞菌Pseudomonas sp.TN06。采用简并PCR和TAIL-PCR的方法获得一个新的β-折叠桶植酸酶基因(phyA06),开放阅读框全长1 902 bp,编码633个氨基酸和1个终止密码子,预测其前23个氨基酸为信号肽,含有两个β-折叠桶结构域。将phyA06基因在大肠杆菌中表达,重组蛋白经镍柱纯化后达到电泳纯。纯化后的重组酶最适pH为7.0,在pH 6.0~10.0的条件下具有很好的稳定性;最适温度为55℃,热稳定性良好。同时,该酶在低温下仍保持一定活力,甚至0℃仍有活性。该植酸酶具有应用于水产饲料行业的潜在价值。     

三价砷氧化细菌Acidovorax sp.GW2中As(Ⅲ)氧化酶基因和调控序列的克隆鉴定

通过反向PCR和细菌Fosmid文库筛选,克隆得到1株二三价砷[As(Ⅲ)]氧化细菌Acidovorax sp.GW2的As(Ⅲ)氧化酶Aox基因簇,包括aoxRSXABCD 7个基因,分别预测编码双组分信号传导系统转录调控子AoxR(同源性68%),周质感应组氨酸激酶AoxS(同源性55%),周质结合蛋白AoxX(同源性55%),砷氧化酶AoxAB(同源性分别为74%和71%),硝基还原酶AoxC(同源性46%),细胞色素C AoxD(同源性63%).反转录PCR结果显示,编码双组分系统的aoxRS基因共转录,而与之转录方向相反的结构基因aoxABCD处于同一操纵子中,aoxX基因和aoxRS基因不在同一操纵子中.通过对aoxS、aoxX、aoxD的基因敲除功能研究发现aoxS和aoxX基因为GW2三价砷氧化的必需基因,aoxD的功能丧失减慢了三价砷的氧化速率,但非关键基因.     

腈水合酶产生菌发酵条件的优化及其酶学性质研究

通过腈水合酶生产菌Rhodococcus sp．SHZ-1菌株的发酵过程研究，阐明了发酵液pH、葡萄糖含量以及细胞浓度变化与酶活之间的关系。在发酵过程中调节pH以及补加葡萄糖，使酶活从2294U／mL，增加到5226U／mL，提高了1．28倍。腈水合酶的酶学性质研究表明，温度30℃，反应体系在pH中性范围酶活达到最高。该酶对于底物有很强的耐受性，丙烯腈浓度为7．2％时，酶活最高；产物丙烯酰胺浓度过高，则会严重抑制酶的活性。