共表达MEL和Ec-cLYZ重组表达质粒的构建及其重组蛋白的抑菌效果评价

为了表达一种高效低毒的广谱抑菌蛋白，试验通过T2A连接肽连接蜂毒肽(MEL)与斜带石斑鱼c型溶菌酶(Ec-cLYZ)基因，并克隆至pPICZαA质粒上构建重组表达质粒；将鉴定正确的重组表达质粒用限制性内切酶SacⅠ线性化后电转化至毕赤酵母表达菌株GS115感受态细胞中，构建毕赤酵母表达菌株；利用0.5%甲醇诱导表达，收集上清液进行冻干浓缩并纯化，采用Western-blot法检测重组蛋白的表达情况，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定重组蛋白浓度，试管二倍稀释法分别检测不同浓度重组蛋白对兔红细胞的溶血活性，牛津杯法评价重组蛋白的抑菌效果。结果表明：成功构建出重组表达质粒pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL、pPICZαA-Ec-cLYZ和pPICZαA-MEL及毕赤酵母表达菌株GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL、GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ和GS115/pPICZαA-MEL;经甲醇诱导，GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL表达出分子质量为16.5,3.4 ku的重组蛋白，GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ表达出分子质量为16.5 ku的重...     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌apxIA基因在毕赤酵母中的表达与分析

构建猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)apxIA基因的真核表达载体pPICZαA/apxI,并在毕赤酵母GS115中进行表达。SDS-PAGE显示仅在浓缩40倍的上清中检测得到表达产物,同时经RT-PCR可检测到重组酵母中编码目的基因成熟肽的mRNA,经分析发现目的序列AT含量高达62%,其中含49个毕赤酵母稀有密码子,占15.4%。证实ApxIA在毕赤酵母中为低水平表达。     

绵羊干扰素tau在毕赤酵母中的表达

应用绵羊的干扰素tau基因IFNt,根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子选择偏好进行分子改造。改造后的基因IFNt克隆到毕赤酵母表达载体p PIC9上,构建得到重组毕赤酵母表达质粒p PIC9-IFNt。电转化于毕赤酵母GS115菌株,对转化后菌体诱导表达,上清SDS-PAGE检测,并优化诱导表达条件。结果表明:IFNt基因已重组到酵母染色体上,并能正常分泌表达,最佳诱导条件为:200 r/min,28℃,0.5%甲醇,96 h。该研究为真核表达绵羊IFNt的生产应用提供了一定的理论依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆及其在毕赤酵母中表达

用RT-PCR扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重庆分离株C14-2的ORF7基因(384 bp),构建克隆质粒pMD19-T-ORF7,经EcoR Ⅰ /Not Ⅰ双酶切回收ORF7基因插入酵母表达载体pPIC9K,构建了重组表达质粒pPIC9K-ORF7,进行PCR鉴定和双酶切鉴定.鉴定的pPIC9K-ORF7经Sac Ⅰ线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,筛选获得阳性重组菌GS115(pPIC9K-ORF7),再经G-418/YPD筛选获得高拷贝重组菌,重组子经表型鉴定为Mut.重组菌GS115(pPIC9K-ORF7)经甲醇诱导表达,在96 h表达的N蛋白量最大,N蛋白经SDS-PAGE鉴定大小约为15 000;Western blot表明N蛋白能与美洲型PRRSV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应活性.本研究为开展PRRSV ORF7基因在毕赤酵母中表达及应用奠定基础.     

禽传染性支气管炎病毒M基因在毕赤酵母中表达与蛋白反应活性检测

将禽传染性支气管炎病毒(IBV)M基因克隆到毕赤巴斯德表达载体pPIC9K中,构建了重组表达载体pPIC9K-M,电击转化毕赤巴斯德酵母GS115,经MD和MM平板筛选和PCR鉴定后,采用G418抗性梯度筛选得到高拷贝重组菌株GS115/pPIC9K-M His~+Mut~+,重组菌株用1%的甲醇诱导分泌表达,并对表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析.结果表明,IBV M基因在毕赤酵母中成功获得了表达,表达蛋白的相对分子质量约为33 000,能与IBV阳性血清特异性结合.将表达蛋白初步纯化后作为包被抗原,ELISA检测结果显示表达蛋白与特异性抗体反应良好,表明表达的M蛋白生物学活性良好.本研究表达的IBV M蛋白可作为制备IB诊断抗原的基础材料,对IB的防治有重要理论和实用价值.     

昆虫死亡素thanatin与斑点叉尾鮰β-防御素在毕赤酵母中的表达及其抑菌效果评价

旨在利用毕赤酵母表达系统表达出具有良好抑菌效果的重组抗菌肽。选定昆虫死亡素thanatin基因和斑点叉尾鮰β-防御素基因(命名为defbl),按毕赤酵母偏好性密码子优化后，将用T2A剪切肽连接的共表达基因(命名为TD)及各单基因分别构建至pMD19-T载体上，经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切后亚克隆至表达载体pPICZɑA上，经SacⅠ线性化后电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，通过Zeocin抗性及PCR筛选出阳性菌株，利用1%甲醇进行诱导表达，72 h后收集培养基上清液，冻干浓缩并纯化后，进行Western blot检测及体外抑菌试验、溶血性试验。结果显示，成功构建重组毕赤酵母工程菌株GS115-pPICZαA-thanatin、GS115-pPICZαA-defbl和GS115-pPICZαA-TD,通过甲醇诱导成功获得重组蛋白，纯化后Western blot检测结果显示，thanatin组和defbl组分别在2.3 kDa和7.8 kDa处出现特异性条带，TD组同时出现上述2条带，蛋白大小均与预期相符；3个重组蛋白浓度分别为600、300和700μg/mL;体外抑菌试验及溶血性...     

重组山羊FSH基因在毕赤酵母中的高效表达

为探讨快速高效表达山羊FSH（促卵泡素）基因的方法,将获得的FSHα,β亚基基因克隆到毕赤酵母快速表达载体pPICZαA中,然后将构建的载体线性化处理后,电击转化至毕赤酵母GS115中,经Zeocin抗生素筛选后获得阳性菌落,经甲醇诱导表达后进行SDS-PAGE和Western–blot分析。结果表明：pPICZαA载...     

猪α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定

利用基因工程技术,将编码梅山猪α-干扰素成熟蛋白基因(mPoIFNα,501 bp)亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNα。用化学方法(LiCl)将线性化的mPoIFNα与ssDNA共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株再以高浓度的G418筛选多拷贝重组子。该高拷贝菌株经1%甲醇连续诱导4 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,结果表明在毕赤酵母中猪α-干扰素获得分泌型表达,表达产物约为20 000,在GS115中的表达量约为40mg/L,占GS115表达的可分泌型总蛋白的40.1%。对表达产物进行理化分析发现,重组酵母菌表达的蛋白耐酸(pH2),对热(56℃)部分敏感,并能被特异性抗猪α-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应。细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素生物活性,试验结果表明rPolIFNα具有较高的抗病毒生物活性,在MDBK中的抗VSV比活性为8.0×106U/mg。     

中国林蛙抗菌肽基因在毕赤酵母中的表达及其活性检测

将中国林蛙皮肤抗菌肽基因(RC)克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,使之准确融合于а交配因子分泌信号,然后通过电击转化毕赤酵母宿主菌GS115/His-,构建pPIC9K/RC。将筛选出的高效表达的重组转化子用甲醇作诱导剂进行小瓶发酵,28～30℃诱导后,经Tricine SDS-PAGE检测,表达产物在а信号因子引导下分泌到培养基中。分泌到培养基中的表达产物能够抑杀细菌和抑制肿瘤细胞生长。对酵母重组子用酵母染色体DNA的通用引物和目的片段的引物进行PCR扩增。结果表明,中国林蛙皮肤抗菌肽基因能以单拷贝整合到毕赤酵母染色体基因组中并形成转录产物。     

J亚群禽白血病病毒gp85基因在毕赤酵母中的分泌表达

为获得J亚群禽白血病病毒gp85蛋白,将gp85基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K,构建了pPIC9K-gp85表达载体。将鉴定正确的表达载体经Sal Ⅰ酶切线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,经MD及G418抗性平板筛选后挑取阳性克隆进行PCR鉴定,获得重组酵母菌株GS115/pPIC9K-gp85。对阳性重组菌进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE、Western blotting和Dot-ELISA分析,结果表明,gp85基因在毕赤酵母中获得分泌表达,表达产物与J亚群禽白血病病毒多克隆抗体有良好的反应活性,分泌表达量达40 mg/L。本研究为J亚群禽白血病病毒诊断方法的建立及gp85蛋白的深入研究奠定了基础。     

林麝白介素-2在毕赤酵母中的表达

克隆林麝（Moschus．berezovskii）白介素-2（interleukin．2，IL-2）到酵母表达载体pPIC9K，SalⅠ酶切后转化毕赤酵母GS115，G418抗性筛选高拷贝克隆，再由酵母菌落PCR鉴定；阳性克隆用甲醇诱导表达，SDS-PAGE分析．结果在诱导至第6d的酵母上清浓缩液中，检测到与预测林麝IL-2分子量相接近的，分子量约为18Ku的诱导表达带；TRIzol提取表达期间的酵母总RNA，并通过RT-PCR扩增IL-2 mRNA，发现表达期的重组酵母细胞中存在IL-2 mRNA，而对照没有检出，表明林麝IL-2存在低水平的表达。     

柔嫩艾美耳球虫真核起始因子3d基因的酵母表达分析

在毕赤酵母真核表达系统中表达柔嫩艾美耳球虫真核起始因子3d(Emeria tenella eukaryotic initiation factor 3d,EteIF3d)基因,并获得具有天然构象的活性蛋白。将EteIF3d基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,将构建正确的重组质粒通过电激转化入酵母细胞GS115,用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选,获得含重组质粒的酵母表达细胞。在含1%甲醇的BMMY培养基中诱导培养,收集1~3 d的表达上清。表达产物进行SDS-PAGE检测,并用Western blot进行免疫学分析。结果表明,本研究成功构建了重组质粒pPIC9k-EteIF3d,并成功表达该蛋白,且该蛋白能与兔抗EteIF3d血清特异性结合,具有良好的抗原性。EteIF3d基因可在真核表达系统毕赤酵母中表达,且获得蛋白具有抗原性,从而为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定了基础。     

O型FMDV复合多表位在毕赤酵母中的表达与鉴定

将O型FMDV复合多表位CTB-TEpi与FMDV结构基因P1-2A(P1/2A)连入毕赤酵母表达载体pPIC9K,经SacⅠ线性化后,利用电转化法整合到毕赤酵母(Pichia pastoris)基因组中。通过G418浓度梯度筛选得到高拷贝阳性转化子GS115/P1/2A-CTB-TEpi。经甲醇诱导表达后,目的蛋白在毕赤酵母中获得成功表达,并在FMDV自裂解片段2A的作用下裂解为P1/2A和CTB-TEpi 2个片段,相对分子质量分别为81 800和39 400,占上清液中可溶蛋白的比例为25%。Western blotting分析表明,表达蛋白的2部分均可被抗O型FMDV的血清所识别,而且含有CTB片段的CTB-TEpi条带可以被兔抗霍乱毒素血清识别,证明表达的蛋白具有抗原活性,为进一步研究O型FMDV复合多表位亚单位疫苗的免疫效果打下了基础。     

牛病毒性腹泻病毒E2基因在毕赤酵母GS115中的表达与鉴定

将牛病毒性腹泻病毒(BVDV)河北分离株HB-bd毒株E2基因去除跨膜区获得sE2基因,将sE2基因克隆入巴斯德毕赤酵母(P.Pastoris)分泌型表达载体pPIC9K中,筛选培养后提取阳性重组质粒,经酶切和PCR鉴定,命名为pPIC9K-sE2.重组质粒pPIC9K-sE2经Sal Ⅰ酶切线性化,电穿孔导入P.Pastoris GS115基因进行整合,使外源基因sE2稳定地整合到P.Pastoris染色体中,G418筛选得到阳性高拷贝转化子GS115-pPIC9K-sE2.经甲醇诱导表达后,sE2融合蛋白获得了表达,表达产物经SDS-PAGE、Western-blot和Dot-ELISA分析,确定其表达的sE2融合蛋白相对分子质量大小为37 000,且具有天然蛋白的抗原特异性.免疫原性研究证明P.Pastoris表达的sE2蛋白能刺激动物产生特异抗体.     

牛朊蛋白27-30基因的克隆与表达

利用PCR技术，从含有牛朊蛋白（Prion protein，PrP）基因Prnp的开放阅读框的克隆质粒BoPrnp—T中扩增出约420bp的目的基因（PrP猢基因）。将PrP^27-30基因和载体pPIC9K分别用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，T4DNA连接酶作用后，转化至E．coli JM109中，构建重组表达载体pPIC9K-boPrP^27-30。pPIC9K-boPrP^27-30经限制性核酸内切酶SalⅠ线性化后电转至毕赤酵母GS115中，经G418筛选后得到高拷贝的重组菌株GS115／pPIC9K-boPrP^27-30。GS115／pPIC9K-boPrP^27-30经1．0％甲醇诱导后，表达产物用SDS-PAGE和Western blot分析，结果表明牛PrP^27-30基因在毕赤酵母细胞中获得表达，表达产物的分子量约为27Ku，能够被单克隆抗体SAF-70识别。     

β-1,3-1,4葡聚糖酶基因双拷贝工程菌株的构建与发酵研究

本试验旨在研究β-1,3-1,4葡聚糖酶双拷贝基因毕赤酵母工程菌株的构建及发酵。首先,通过对质粒pGAP-glu-opt进行PCR扩增获得密码子优化的β-1,3-1,4葡聚糖酶基因glu-opt,用EcoR I和Not I双酶切后与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,获得重组质粒p9K-glu-opt。该重组质粒经Sac I线性化后转化毕赤酵母GS115菌株,利用不含组氨酸的MDS平板和摇瓶培养,筛选重组菌株,命名为GS115/9K-glu-opt。制备GS115/9K-glu-opt感受态细胞,再用线性化的重组质粒pPIC-glu-opt二次转化,在含有抗生素Zeocin的YPDS平板上筛选glu-opt基因双拷贝重组菌株GS115/2xglu-opt。双拷贝重组菌在10 L发酵罐中进行高密度发酵培养及甲醇诱导表达,β-1,3-1,4葡聚糖酶最高酶活达到21 600 U/mL,约为单拷贝工程菌株X33/pPIC-glu-opt发酵活力的1.44倍;蛋白表达量达8.4 g/L,约为X33/pPIC-glu-opt的1.68倍。     

Gene cloning of porcine adiponectin gene from adipose tissue and construction of its eukaryotic expression vector

To clone adiponectin (ADPN) gene from Shaziling porcine adipocyte and construct its eukaryotic expression vector, total RNA was extracted from subcutaneous fatty tissue. One pair of specific primers was designed by Primer 5.0 software according to the sequence of ADPN gene of porcine available in GenBank. The ADPN gene was amplified by PCR from cDNA and cloned into pMD18‐T vector to construct recombinant clonal vector pMD‐ADPN, sequenced and analysed. A recombinant expression plasmid pPICZaA‐ADPN was constructed by subcloning the cloned ADPN gene into the linearized pPICZaA vector. Then, the plasmid pPICZaA‐ADPN was expressed in Pichia pastoris (GS115) by electrotransformation. Western blot and Bradford analysis were used to determine the target protein induced by methanol. Results showed that the genome size of ADPN was 732 bp and encoded 244 amino acid, the nucleotide sequence of ADPN shared 100% identity with that of porcine available in GenBank. Western blot and Bradford analysis showed that the recombinant ADPN was expressed in GS115 correctly and has certain immune activity. The expression level of ADPN was 28.5 μg/ml. In conclusion, the recombinant ADPN could express in eukaryotic expression vector pPICZaA‐ADPN constructed in this study effectively.     

Expression and characterization of a recombinant soluble form of bovine tumor necrosis factor receptor type I

A recombinant soluble bovine tumor necrosis factor receptor type I (sboTNF-RI) was expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris and evaluated for its ability to inhibit bovine tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) cytotoxicity. A cDNA encoding the extracellular domain of bovine TNF-RI was placed under the control of the powerful and tightly regulated alcohol oxidase1 (AOX1) gene promoter of the pPICZa A vector and the resulting construct integrated into the 5' region of the alcohol oxidase genes of GS115 and KM71 strains of Pichia. Soluble bovine TNF-RI was secreted into the medium following induction of the AOX1 gene promoter with methanol, and purified to greater than 95% purity by ion-exchange chromatography. In in vitro assays, the purified recombinant sboTNF-RI will block the cytolytic activity of bovine TNF-alpha on WEHI 164 cells clone 13 by 50% when used at a concentration of 170 microg/ml, and by nearly 90% when used at a concentration of 310 microg/ml. Results of this study suggest that recombinant sboTNF-RI may have therapeutic value as a TNF inhibitor in cattle with coliform mastitis.     

猪IL-2基因在毕赤酵母中的高效表达及生物活性分析

本研究根据密码子偏爱原则设计猪IL-2引物,克隆其基因后构建pPIC9k-IL-2重组表达载体,线性化后电转化毕赤酵母GS115,获得优化密码子的重组酵母转化子;再用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,不同条件下进行甲醇诱导表达。结果表明:经PCR鉴定IL-2基因已整合到酵母基因组中。表达产物经SDS-PAGE电泳分析发现相对分子质量为16、20ku两条目的蛋白表达带,脱糖基化分析表明目的蛋白得到了适度的糖基化修饰,Western blotting分析显示表达的蛋白具有良好的免疫反应性,分子筛纯化可以获得纯度为95%的蛋白质,淋巴细胞增殖活性分析表明所得的蛋白质具有促淋巴细胞增殖的活性。毕赤酵母表达系统可以高效地表达具有生物活性的重组猪IL-2蛋白分子。     

土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR技术从土耳其斯坦东毕吸虫（Orientobilharzia turkestanicum）成虫总RNA中扩增磷酸丙糖异构酶基因（TPI），鉴定后将目的片段与毕赤酵母表达载体pPIC9k连接，构建重组表达质粒pPIC9k-TPI，并将其电击转化到毕赤酵母GS115中，重组菌株经甲醇诱导后表达的TPI蛋白，经SDS-PAGE、Western-blotting检测，并利用葡聚糖凝胶层析柱纯化。结果显示，成功地克隆了土耳其斯坦东毕吸虫TPI；重组毕赤酵母表达了分子质量为43ku的TPI蛋白；葡聚糖凝胶层析过滤得到单一的TPI蛋白。