维氏气单胞菌flrB基因敲除株构建及其生物特性鉴定

维氏气单胞菌是一种常见的人鱼共患致病菌,为研究维氏气单胞菌中的flrB基因的功能,笔者通过扩增flrB基因上下游同源臂连接至pRE112质粒中,电击转化重组质粒至大肠杆菌WM3064,接合转入野生型维氏气单胞菌,在蔗糖压力下筛选、PCR和测序验证敲除菌株.结果表明,敲除flrB基因后降低生物膜的形成,但不影响维氏气单胞...     

一个链霉菌中微型转座子系统的构建

针对链霉菌中现有转座子系统的一些缺陷,构建了一个链霉菌中的微型转座子质粒pHL265,它携带的转座酶基因tnpA在转座子mini-Tn4560A外部,降低了发生二次转座的可能性,并带有大肠杆菌与链霉菌进行属间接合转移的起始位点oriT,可通过接合转移的方式将其从大肠杆菌导入到链霉菌中.利用该转座子系统转座筛选得到天蓝色链霉菌M145的约1 000株转座突变株.选取其中的8株,经Southern杂交验证可知,该转座子的转座基本具有随机性,并在宿主DNA中稳定存在.此系统为链霉菌功能基因组的研究提供了新的技术手段.     

转座子Tn5诱导菊欧氏杆菌产细菌素菌株突变的研究

通过接合的方法将转座手Tn5从供体菌(Escherichia coli s17/pZJ25t:∶Tn5)转移到菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)产细菌素菌株EchB3上。平板LB上的接合频率约为0.8×10~(-8)/每个受体细胞,而滤膜上的接合频率为0.3×10~(-7)/每个受体细胞。2200个接合子只带有转座子Tn5的卡那霉素(km)抗性标记,而没有载体上的氮霉素(Cm)抗性标记,也没有检测到载体质粒。试验证明供体菌中的载体质粒(pZJ25)不能在EchB3中复制表达。因此供体菌株是对菊欧氏杆菌基因分析的良好工具。从2200个接合子中提取全DNA和质粒DNA转化到去质粒的菊欧氏杆菌菌株EchB3rcl,能得到恢复产细菌素的转化子,从而进一步肯定了菊欧氏杆菌EchB3中的质粒在产细菌素中的作用。     

菊欧氏杆菌细菌素基因的鉴别及探针的建构

放射自显影结果表明,质粒pZJ25::Tn5与Tn5诱变的不产细菌素的菊欧氏杆菌质拉DNA有同源杂交带,并且这些突变体的质粒分别能通过转化或接合转移到不产细菌素的去质粒菌株和大肠杆菌,得到抗卡那霉素的转化子和接合子。这证明转座子Tn5插入在质粒pWZ12产细菌素有关的基因上。 通过DNA重组的方法建构了一个分子量约为10.2Kb的细菌素探针质粒,pBR1210。它与质粒pWZ12有专一性的同源杂交带。     

灰红链霉菌AL7基因组文库及异源表达文库的构建

灰红链霉菌AL7对多种植物病原真菌和细菌都具有明显的抑菌活性。本研究在通用的大肠杆菌克隆宿主基础上,构建获得Dcm甲基化缺陷菌株,再引入接合转移辅助质粒pUZ8002得到菌株LP3。以LP3为宿主构建灰红链霉菌AL7的基因组粘粒文库,平均插入片段大小40kb。用高通量接合转移的方法将文库转到变铅青链霉菌TK24中,得到了异源表达文库,并从表达文库中初筛获得一些表型特异的克隆,如光秃表型、产素提前表型、产孢提前表型等。     

蟹源易损气单胞菌气溶素基因的克隆及其PCR检测

利用设计的特异引物,采用PCR技术,对蟹源致病性易损气单胞菌气溶素基因(aer)进了克隆和序列分析,从其基因组中克隆出长为622 bp的基因片断,用限制性内切酶BamHI对扩增产物进行酶切,产生长约570 bp和50 bp两条片断;研究还利用设计的特异引物,对蟹源致病性易损气单胞菌进行PCR快速分子鉴定的研究.     

欧鳗嗜水气单胞菌的分离、鉴定和特性分析

2000年夏季福建地区许多鳗场养殖的欧洲鳗暴发以脱粘、败血为主要症状的疫病，从不同来源的濒死鳗鱼体内分离到4株细菌。细菌的形态学、生化分析和补充试验结果符合嗜水气单胞菌的各项指标，PCR检测4株分离菌均扩增出特异性的气溶素基因（aerA)209bp片段及胆酶基因（Lip)760bp片段，进一步证实这些分离菌为嗜水气单胞菌并存在毒力基因。人工造病实验结果表明，分离株M00081205①的菌体纯培养物和胞外产物对昆明小白鼠和欧洲鳗分别具有中等和高度的致病力，初步证实嗜水气单胞菌是欧鳗夏季爆发性疫病的病原之一。     

潮霉素B抗性基因在木醋杆菌中的整合表达

以质粒pSET152为出发载体,构建潮霉素B抗性基因的表达载体pSET152-HYG,通过大肠杆菌-木醋杆菌的属间接合转移将pSET152-HYG导入木醋杆菌,在位点特异性重组酶作用下潮霉素抗性基因B整合到木醋杆菌的染色体上。与出发菌株相比,重组菌株传代稳定,潮霉素抗性有了较大的提高,从100μg/mL提高到了400μg/mL以上,而产纤维素能力只略有下降。     

一株分离自鸡肉样品的多重耐药大肠埃希菌的全基因组测序及耐药性研究

以分离自宁波市市售鸡肉中的一株大肠埃希菌ECCNB12-2为研究对象,使用微量肉汤稀释法进行最小抑菌浓度(MIC)测定,结果显示,该菌株对氨苄西林、庆大霉素、大观霉素、四环素、氟苯尼考、磺胺异恶唑、复方新诺明、头孢噻夫、恩诺沙星、氧氟沙星等10种抗生素耐药。采用第三代高通量测序技术对该菌株进行全基因组测序,随后对基因组完成图进行获得性耐药基因、毒力因子、质粒水平转移元件预测。菌株ECCNB12-2染色体基因组大小为5 539 489 bp,GC含量为50.37%,同时携带有4个质粒,大小分别为147 451 bp(pTB-nb1)、139 752 bp(pTB-nb2)、82 252 bp(pTB-nb3)、253 793 bp(pTB-nb4)。获得性耐药基因预测结果显示,染色体基因组、质粒pTB-nb1及质粒pTB-nb4上共携带有40个获得性耐药基因,同时菌株基因组检测出12个毒力因子。质粒水平转移元件预测结果显示,pTB-nb4质粒包含完整的水平转移系统,理论上具有高度的自主接合转移潜力。以上研究表明,分离自市售鸡肉样品的ECCNB12-2菌株是一株高风险的多重耐药菌株,反映了市售鸡肉中细菌耐药状况的严重性,相关研究结果为食源性细菌耐药安全风险评估提供了参考。     

框镜鲤维氏气单胞菌CY0806株鞭毛flaA基因的克隆与生物信息学分析

以框镜鲤Cyprinus carpio维氏气单胞菌Aeromonas veronii CY0806株细菌基因组DNA为模板,经PCR扩增,获得flaA基因,将其克隆并测序,测序结果与气单胞菌属的不同菌株进行相似性分析,并对flaA基因编码蛋白质进行生物信息学分析.结果显示:获得框镜鲤维氏气单胞菌鞭毛flaA基因,长915 bp,编码304个氨基酸,系统进化树分析,其与其他维氏气单胞菌flaA基因处于同一分支,相关生物信息学分析显示,flaA基因编码的蛋白质相对分子质量32 098.66,等电点5.57,半衰期30 h,不稳定系数为32.31,脂肪系数81.05,不存在信号肽和跨膜区,二级结构预测:flaA基因以α螺旋和β折叠为主,同时,以同源建模法预测了flaA基因编码蛋白的三维立体结构.     

一株产紫红色色素的沙雷氏菌的分离与鉴定

[目的]为有效预防和控制由沙雷氏菌引起的多种疾病提供依据。[方法]以华蓥山香菇作为研究材料,从其表面中分离出了1株产紫红色色素的细菌,采用形态学、生理生化方法对其进行初步鉴定;提取基因组DNA,采用16S rRNA的通用引物,PCR扩增16S rDNA基因片段,克隆入pMD-18T载体,转化E.coliDH5α,筛选阳性重组质粒鉴定后测序;通过多序列比对和同源性分析,构建系统发育树。[结果]该菌株革兰氏染色阴性,与沙雷氏菌属菌的同源性最高,命名为Serratiasp.JG05。扩增得到序列大小为1 506 bp,系统发育树表明JG05与Serratiasp.BBTR23的亲缘关系最近,核苷酸水平有99.20%的相似性。[结论]该研究为进一步研究这种附生菌与香菇的共生关系,以及它们之间的作用机制奠定了基础。     

High frequency of horizontal gene transfer in the oceans

Oceanic bacteria perform many environmental functions, including biogeochemical cycling of many elements, metabolizing of greenhouse gases, functioning in oceanic food webs (microbial loop), and producing valuable natural products and viruses. We demonstrate that the widespread capability of marine bacteria to participate in horizontal gene transfer (HGT) in coastal and oceanic environments may be the result of gene transfer agents (GTAs), viral-like particles produced by α-Proteobacteria. We documented GTA-mediated gene transfer frequencies a thousand to a hundred million times higher than prior estimates of HGT in the oceans, with as high as 47% of the culturable natural microbial community confirmed as gene recipients. These findings suggest a plausible mechanism by which marine bacteria acquire novel traits, thus ensuring resilience in the face of environmental change.     

牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的克隆及序列分析

为了解牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的特点,根据GenBank已公布的牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因序列设计4对引物,每个基因分两段扩增,测序并拼接,首次克隆牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因。序列分析表明,扩增到的牦牛应激型 HSPA1A基因全长2 134 bp,开放阅读框全长1 926 bp,编码641个氨基酸,分子质量为70.26 ku; HSPA2基因全长1 911 bp,开放阅读框全长1 911 bp,编码636个氨基酸,分子质量为69.85 ku。将 HSPA1A和 HSPA2基因开放阅读框编码的氨基酸序列进行ScanProsite分析,均得到3个HSP70蛋白家族标记。核苷酸序列同源性分析表明, HSPA1A和 HSPA2基因具有较高的保守性,牦牛与牛的 HSPA1A和 HSPA2基因核苷酸序列同源性最高,分别为99.8%和99.1%。遗传进化关系分析表明,牦牛与牛的应激型 HSPA1A和 HSPA2基因亲缘关系最近。     

前后盘吸虫梅花鹿源分离株的种类鉴定及遗传进化分析

旨在研究温州地区的梅花鹿源前后盘吸虫的种类和遗传进化,利用形态学和分子生物学方法,对虫体样本进行染色显微镜观察及pcox1和pnad1序列的PCR扩增和序列分析。形态学鉴定结果表明,前后盘吸虫梅花鹿源分离株在外部形态、大小以及内部组织器官与鹿前后盘吸虫(Paramphistomum cervi)相近。序列比较分析结果表明,3株前后盘吸虫梅花鹿源分离株样本的pcox1和pnad1序列完全一致,扩增产物长度分别为446和505bp,与GenBank中鹿前后盘吸虫(KT198987)同源性最高,分别为98.2%和97.7%。遗传进化分析表明,3株前后盘吸虫梅花鹿源分离株与鹿前后盘吸虫位于同一分支。表明,分离的虫株在形态学和遗传进化分析上均与鹿前后盘吸虫具有高度的一致性,提示获得的前后盘吸虫梅花鹿源分离株为鹿前后盘吸虫。     

Phylogenetic Relationships of Sorghum and Related Species Inferred from Sequence Analysis of the nrDNA ITS Region

Analysis of phylogenetic and evolution in six species of Sorghum was based on internal transcribed spacer （ITS） sequences in nuclear ribosomal DNA. Results showed that the length of the ITS regions among the six species ranged from 588 to 589 bp and the contents of G＋C in ITS （ITS1 ＋5.8S＋ITS2） regions ranged from 60.27 to 61.05%; the length of ITS1 ranged from 207 to 208 bp and the contents of G ＋ C in the ITS 1 regions ranged from 53.91 to 61.54%. The length of the 5.8S rDNA and ITS2 regions in the six species was 164 and 217 bp respectively, and the contents of G ＋ C ranged from 56.10 to 58.54% in the 5.8S rDNA region and 66.36 to 67,28% in the ITS2 region. Among regions of ITS, ITS1, ITS2, and 5.8S, the best sequence for genetic relationship analysis in the six species was the ITS region. On the basis of the Jaccard coefficient and phylogentic tree, S. sp. was more related to S, propinguum than to other species. This was consistent with the fact that S. sp. is derived from S. propinguum. From the phylogenetic tree based on ITS1, S. halepense, silk sorghum and S. sudanense, are identical in the ITS 1 sequence, whereas the phylogenetic tree based one shows that S. sudanense has a closer genetic association with S. almum rather than with S. halepense and silk sorghum.     

重庆地区玉米叶内生细菌的分离及其与草地贪夜蛾肠道菌的比较

为进一步了解重庆地区玉米叶内生细菌的组成以及这些内生细菌与入侵重庆地区草地贪夜蛾肠道微生态的相互关系,以采集自巫山地区被草地贪夜蛾入侵的玉米地里的玉米嫩叶为材料,运用传统微生物培养方法尝试对其内生细菌进行初步的分离培养,并通过16S rDNA测序开展了优势菌的属水平鉴定.此次共分离获得了22个细菌分离株,经16S rDNA序列同源性分析,将它们归类到11个分类单元,分属克雷伯氏菌属(Klebsiella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、微杆菌属(Microbacterium)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、无色杆菌属(Achromobacter)和丛毛单胞菌属(Comamonas).与前期研究得到的该地区草地贪夜蛾肠道微生物菌群数据比较可以发现,玉米内生细菌中包括克雷伯氏菌属(Klebsiella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)和金黄杆菌属(Chryseobacterium)在内的5个属可以在草地贪夜蛾肠道中分离到,表明草地贪夜蛾肠道微生物多数可能源自其食物,但是草地贪夜蛾肠道微生物中常见的假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、短波单胞菌属(Brevundimonas)和气单胞菌属(Aeromonas)并未在玉米嫩叶中分离到,说明它们可能是主要存在于草地贪夜蛾肠道中的微生物.该研究对草地贪夜蛾所取食的玉米叶中内生细菌的种类进行了初步分析,为后续研究玉米叶内生细菌和草地贪夜蛾肠道微生物的相互关系奠定了基础.     

重庆地区草地贪夜蛾肠道细菌的分离鉴定

为了解入侵重庆地区草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)肠道所携带的细菌组成,以采集自巫溪、巫山地区玉米地里的草地贪夜蛾为材料,运用传统培养方法分离了其肠道优势细菌,并基于16S rDNA测序开展了优势菌的属水平鉴定,共获得了30个细菌分离株,经16S rDNA序列同源性分析,可归于5个属,分别为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)以及气单胞菌属(Aeromonas);其中,克雷伯氏菌属(Klebsiella)的丰度最高,占所有分离菌株的63%;假单胞属(Pseudomonas)和肠杆菌属(Enterobacter)菌株仅在巫山地区分离得到,气单胞菌属(Aeromonas)仅在巫溪地区分离得到.实验确定了入侵重庆地区草地贪夜蛾肠道优势细菌的种类及丰度,为后续研究草地贪夜蛾肠道微生物对宿主的生长发育以及迁飞等重要问题奠定了基础.     

耐盐碱解磷菌的筛选鉴定及对绿豆的促生作用

从大庆耐盐碱植物的根际土壤中分离得到100株解磷菌,对筛选得到的菌株解磷量进行测定,并结合其他促生特性检验,选出3株耐盐碱高效解磷菌.通过生理生化试验和16S rRNA鉴定出JC8、JC11和JP8这3株菌,分别为Pseudomonas sp.,Acinetobacter sp.和Microbacterium sp.;...     

Horizontal gene transfer of a syp homolog contributes to the virulence of Burkholderia glumae

Horizontal gene transfer (HGT) has been proved a major driving force in prokaryotic evolution. However, the molecular functions of these transferred genes in pathogenic bacteria especially plant pathogenic bacteria are still not fully investigated. In this study, the whole-genome in silico analysis was performed and found a syringopeptin synthetase (syp) homolog in Burkholderia glumae, which can cause bacterial panicle blight in rice, was predicted to be horizontally transferred from Pseudomonas ancestor with solid confidence by phylogenetic analysis. The comprehensive molecular experiments were performed to study the potential role of this gene in B. glumae. Inoculation of rice panicles with the syp mutant resulted in 60% lower disease index compared with the wild type (WT) parent strain, suggesting the requirement of syp for the full virulence of B. glumae. Chromatography analysis of exudates from B. glumae showed suppression of synthesis of metabolites analogous to syringopeptin in the mutants. All these data raise the possibility of HGT phenomenon in shaping the virulence and adaptation of B. glumae over evolutionary time.