豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因在转基因水稻中的表达特性研究

以豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)转基因水稻自交品系和其衍生的花培品系为实验材料，通过PCR扩增和CpTI表达蛋白活性的测定，研究了CpTI基因的遗传稳定性和表达特性。结果表明CpTI基因在转基因自交后代可以稳定遗传，而在部分花培品系中发生丢失。同时CpTI基因的表达表现出一定的时空特性，同一转基因品系中叶片CpTI蛋白的表达活性通常高于茎杆，而不同发育时期的CpTI蛋白的表达活性以分蘖期最高。除花培品系DH401外，转基因品系叶片和茎杆的蛋白酶抑制剂的活性随着水稻的生长发育呈下降的趋势。     

BnA7HSP70分子伴侣结合蛋白超表达能够提高甘蓝型油菜耐旱性

分子伴侣结合蛋白广泛参与植物生长发育过程, 在逆境下能够保护植物细胞免受胁迫。在甘蓝型油菜中超表达油菜含有HSP70热激蛋白结构域的分子伴侣基因BnA7HSP70, 所得到的转基因植株在缺水条件下延缓萎蔫。通过生理生化实验证明, 干旱条件下转基因植株有着更高的相对含水量、更强的渗透调节能力和较低的脂质膜过氧化性。另外, 转基因植株的幼苗在萌发期表现出对糖基化酶抑制剂衣霉素处理的耐受性。Evans blue染色实验证明, 转基因植株逆境下叶片死亡细胞数目比非转基因植株减少, 叶片衰老相关标记基因BnCNX1在转基因植株中下调表达证明, 超表达BnA7HSP70基因所介导的途径能够减轻逆境胁迫下的植株衰老, 保持叶片持绿性。在转基因植株中内质网和渗透胁迫产生的细胞死亡标记基因N-Rich蛋白BnNRP延迟表达证明, 在油菜中增强BnA7HSP70基因的表达能够缓解未折叠蛋白途径(unfold protein response, UPR)和NRP (N-rich pathway)途径介导的叶片黄萎, 并降低油菜叶片失绿的标记基因BnLSC222和BnLSC54的表达。研究结果表明, 在油菜中超表达BnA7HSP70基因能够提高植株在干旱条件下内质网胁迫的耐受性。     

寄主诱导的基因沉默干扰核盘菌致病基因OAH在甘蓝型油菜抗菌核病中的应用

油菜是我国第一大油料作物,菌核病是我国油菜面临的主要病害之一。本试验利用HIGS技术将核盘菌中关键致病基因SS1G＿08218 (OAH)的干扰片段转化到甘蓝型油菜中,获得含有siRNA的转基因油菜植株,研究HIGS介导的SsOAH基因沉默对油菜抗菌核病的影响。接种核盘菌后的抗病鉴定结果表明,SS.OAH.RNAi转基因油菜植株对核盘菌抗性增强;R18、R25和R36株系叶片接菌后病斑部位核盘菌菌丝内的OAH基因表达量均低于野生型,证明siRNA在转基因油菜中成功表达;在添加了转基因油菜叶片提取物的培养基上培养的核盘菌扩展面积显著小于野生型,分别降低35.29%、21.98%、31.53%,且菌丝生长显著迟缓,扩展长度较短,分支少,生长过程中发生断裂,生长异常,将其接种于正常的野生型油菜后,其致病力明显下降;对转基因油菜叶片接种核盘菌后观察发现,叶片上的菌丝扩展较为稀疏,生长受阻,侵染垫形成受到抑制,暗示在油菜中表达OAH基因的干扰片段影响了菌丝生长和扩展;进一步检测其病斑组织中的草酸含量发现,接菌36 h、48 h后转基因油菜病斑组织中的草酸含量为391μg g–1、446μg g–...     

pinⅡ基因在转基因大白菜DH纯系和试配F1代的遗传及表达

马铃薯蛋白酶抑制剂基因-Ⅱ(pinⅡ)是一类控制丝氨酸蛋白酶抑制剂PI-Ⅱ合成的抗虫基因.为了比较pinⅡ基因在转基因大白菜纯系和杂种中的表达特性,为抗虫新品种选育提供理论指导,本实验以转基因大白菜双单倍体纯系(DH系)的5个自交系和与常规育种亲本材料试配的3个F1杂交组合为试材,利用标记性状(除草剂抗性)对试材进行转...     

甘蓝型油菜防御素基因的克隆与表达分析

植物防御素具有广谱抗菌活性,不仅具有抗真菌、抗细菌、蛋白酶抑制和昆虫淀粉酶抑制等活性,而且参与调节植物的生长和发育。本研究根据白菜防御素基因序列设计引物,从甘蓝型油菜中克隆获得5个防御素基因,其c DNA全长325~461 bp,含有177~243 bp开放阅读框,编码58~80个氨基酸,含有8个保守Cys残基,具备Knot1功能域。系统进化分析表明,Bn PDF2.1、Bn PDF2.3、Bn PDF2.5与拟南芥PDF2亲缘关系较近,可能具有蛋白酶抑制活性。荧光定量分析表明,防御素基因具有组织表达特异性,在花蕾和叶中表达量较高,角果中次之;经1 mmol L–1水杨酸处理开花期油菜2 h后,防御素基因在茎、花蕾、角果中的表达量均有不同程度的上调,但在叶中表达有所下调,在根中表达无明显变化。     

BnMAPK1超量表达提高甘蓝型油菜菌核病抗性

植物MAPKs (mitogen-activated protein kinases)在多种生物和非生物胁迫中起重要作用。课题组前期克隆了甘蓝型油菜BnMAPK1基因,并获得BnMAPK1超量表达植株。本文以甘蓝型油菜中油821DH系为对照,以超量表达BnMAPK1的转基因油菜为试材,采用离体叶片接种的方法,测定染病叶片病斑的大小及病斑周围叶片的草酸含量,并用qRT-PCR检测转基因植株4个病程相关蛋白(OXO、Cu/ZnSOD、PR2、PR3)编码基因在核盘菌胁迫下的相对表达动态变化。结果表明,甘蓝型油菜BnMAPK1超量表达可显著抑制核盘菌对离体叶片的侵染,控制染病叶片内草酸毒素的积累,可能可以解除核盘菌对OXO表达的负调控,使另外3个病程相关蛋白基因(Cu/ZnSOD、PR2、PR3)表达上调。表明BnMAPK1超量表达可有效提高油菜菌核病抗性。     

转PPase基因对马铃薯无机焦磷酸酶活性和无机磷含量的影响

对转正义和反义无机焦磷酸酶(PPase)基因马铃薯PPase活性及其测定最适条件和无机磷(Pi)含量进行了研究,结果表明,PPase活性测定最适pH值是8.0,最适温度是42℃,二价阳离子以Mg2+最好.叶片中PPase活性和Pi含量较高,茎和生长期微型薯中PPase活性和Pi含量较低,贮存3个月的微型薯中PPase活性和Pi含量比生长期块茎更低.另外,与未转基因的对照相比,转正义PPase基因提高了转基因马铃薯中PPase活性和Pi含量,转反义PPase基因降低了转基因马铃薯中PPase活性和Pi含量.     

农杆菌介导抗除草剂基因bar和抗虫基因cry1ab/ac转化甘蓝型油菜的研究

为了获得同时具备抗虫和抗除草剂特性的甘蓝型油菜新种质材料,以湘油15下胚轴为外植体,将人工合成的抗虫融合基因cry1ab/ac与带有草铵膦抗性基因bar的植物表达载体pFGC5941连接,构建了植物表达载体pFGC-Bt。利用农杆菌介导油菜下胚轴遗传转化体系,将载体pFGC-Bt转入到油菜品种湘油15愈伤组织中。经愈伤组织分化和植株再生,获得了7株T0转基因植株。分株收获这7株转基因油菜的种子,种于花盆中,用除草剂basta喷洒,对存活下来的植株用检测引物进行PCR检测。挑选11株2个基因检测结果都呈现阳性的植株,进行Cry1Ab/Ac蛋白双抗体夹心免疫层析技术检测,在这11株油菜中都检测到了Cry1Ab/Ac蛋白。进行转基因油菜抗菜粉蝶幼虫(菜青虫)的离体鉴定,以非转基因湘油15为对照,结果显示,啃食了转基因油菜叶片的菜青虫停止运动和生长,大概7 d后陆续死亡,而非转基因油菜叶片上的菜青虫表现正常,3 d后叶片基本被其啃食干净。饲喂鉴定结果表明,转抗虫融合基因cry1ab/ac油菜对菜青虫具有明显抗性。得到了同时具有菜青虫和草铵膦双抗性的转基因植株,且抗性显著,为油菜的抗性育种提供了新的材料。     

以器官和发育特异性抗病双基因转化油菜

菌核病是我国油菜主产区的主要病害，系由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的子囊孢子在晚春直接侵染开花植株衰老的叶片，或先侵染飘落在衰老叶片上的花瓣后再产生菌丝侵入叶片和植株本体。几丁质是核盘菌菌丝体细胞壁的主要组成成分，几丁质酶破坏真菌菌丝尖端新合成的几丁质而抑制病菌的生长。草酸是核盘菌侵染寄主植物后分泌的毒素，草酸氧化酶能够分解草酸，缓解核盘菌在油菜体内的毒性。我们将几丁质酶基因和草酸氧化酶基因与拟南芥衰老叶片启动子PSAG12嵌合在一起构建成表达载体，使两外源抗病基因仅在转基因油菜的衰老叶片中表达，在发挥抗病作用的同时最大限度地节约了植物的能量消耗。本实验采用in planta的转化方法，转化效率在0．1％左右，每个转基因植株的插入位点为1——3个拷贝。对T1代转基因植株的RT-PCR分析表明，两个外源抗病基因在衰老叶片中的表达强于幼嫩叶片。转基因植株叶片尤其是衰老叶片对核盘菌的抗性及对草酸毒素的耐性均得到了增强。从转基因植株上飘落的花瓣也表现出对核盘菌抗性的提高。抗病双基因在叶片和花瓣发育的特定时期表达不仅提高了油菜对核盘菌侵染的针对性，还可能减轻转基因植株的能源消耗和生理扰乱。对转基因植株后代的农艺学和生理学研究正在进行之中。     

甘蓝型油菜BnADH3基因的克隆及转BnADH3拟南芥的耐淹性

利用RT-PCR技术从甘蓝型油菜耐淹品系WR-4中克隆获得Bn ADH3基因,其完整开放阅读框为1137 bp。该基因编码379个氨基酸,与甘蓝Bo ADH3基因和拟南芥At ADH3基因高度同源,同源性分别达到96%和91%。利用定量RT-PCR检测Bn ADH3基因在油菜耐淹系WR-4和不耐淹系WR-24中的表达表明,在淹水处理下该基因表达受到一定的诱导,淹水处理6 h后表达开始上调,说明Bn ADH3基因在油菜耐淹机制中发挥作用;将其转化到模式生物拟南芥中,采用幼苗淹水3 d后去水处理,测定表明转基因株系叶片和根系中乙醇脱氢酶活性均高于野生型;生长4周和6周的拟南芥植株淹水3 d后的表型显示,Bn ADH3的表达可增强拟南芥对淹水胁迫的耐性,处理的T2代转基因幼苗大部分恢复,但野生型幼苗枯死;调查表明,淹水5 d后野生型植株的存活率为26.7%,转基因株系ADH33和ADH44的存活率分别为80.0%和66.7%。