鸡传染性支气管炎病毒M41株毒种保存期试验

对保存于中国兽医微生物菌种保藏管理中心的4个不同年代(1991年4月、1996年6月、2001年1月、2006年12月)冻干的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41株毒种进行了对雏鸡的毒力和病毒含量测定试验,结果表明:4个不同保存年代的IBV M41株毒种均能使雏鸡100%出现鸡传染性支气管炎典型症状,病毒含量均≥10~(6.0)EID_(50)/0.1 mL。其中一支毒种在-70℃以下保存22年11个月,其毒力和病毒含量均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二○○○年版)规定,能够满足检验需求。本试验为探寻IBV M41株毒种更加合理的保存期提供了参考。     

鸡传染性支气管炎毒种保存期试验（一）

对３批不同时期制备的ＩＢＶＨ１２０毒种用ＳＰＦ鸡胚进行毒种保存期测定。用保存５年的ＩＢＶＨ１２０毒种经复壮后繁殖冻干毒种并进行全面鉴定。结果表明冻干毒种在－７０℃条件下保存４年、８年及１５年后毒种效价下降不明显,用保存１５年的ＩＢＶＨ１２０毒种复壮后繁殖、冻干的毒种其免疫原性、安全性等指标均符合规程规定标准。     

鸡新城疫活疫苗种毒HB1株和F株保存期试验

对不同保存年代的鸡新城疫活疫苗种毒HB1株（Ⅱ系）和F株（Ⅲ系）各3批进行了病毒含量测定和免疫原性试验。3批不同保存年代的鸡新城疫病毒HB1株和F株病毒含量均≥108.4EID50/0.1 mL,最小免疫量均≤2500 EID50。结果表明,鸡新城疫病毒HB1株和F株毒种在-70℃分别保存16年和19年,病毒含量和免疫原性仍符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》（二〇〇〇年版）规定。     

鸡传染性支气管炎毒种保存期试验（二）

对不同时期制备的３批鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）Ｈ５２毒种用ＳＰＦ鸡胚进行保存期测定,并用保存１５年的ＩＢＶＨ５２Ｅ２代毒种经复壮后繁殖冻干ＩＢＶＨ５２Ｅ４代毒种并进行全面鉴定,结果表明冻干的ＩＢＶＨ５２毒种在－７０℃条件下保存４年、７年、１５年毒种效价下降不明显,用保存１５年的ＩＢＶＨ５２毒种复壮后繁殖冻干的毒种其免疫原性、安全性等指标均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》［１］规定标准。     

伪狂犬病病毒囊膜蛋白ISCOMs免疫原性测定

应用伪狂犬病病毒囊膜蛋白与Quil A结合制备囊膜蛋白免疫刺激复合物(PRV-ISCOMs)，并通过ELISA、血清中和试验和淋巴细胞转化试验(Brdu-ELISA法)测定其诱导小鼠体液和细胞免疫应答水平。结果如下：1)小鼠分别接种3、7、10ug的PRV-ISCOMs后，于接种后PI7d血清中可测出ELISA IgG而抗体，随后抗体水平逐渐升高。间隔21d加强免疫后，FLISA IgG抗体水平进一步提高，且中和抗体效价均在1：22以上，而未加佐剂的囊膜蛋白对照组均无中和抗体；2)淋巴细胞转化试验初步结果表明PRV-ISCOMs能诱导小鼠的细胞免疫应答。3)免疫保护力测定显示免疫鼠能抵抗强毒攻击。上述结果表明PRV-ISCOMs具有良好的免疫原性，能诱导小鼠的体液免疫和细胞免疫应答。     

兔病毒性出血症病毒毒种的保存期试验

本试验对 3个不同代次的兔病毒性出血症病毒进行了最小致死量测定 ,并对经兔病毒性出血症病毒F1代毒种繁殖冻干的 1批兔病毒性出血症病毒F3 代毒种 (1998.4 .6冻干 )进行了血凝性、特异性、最小致死量、免疫原性鉴定。结果表明 ,三个不同代次的兔病毒性出血症病毒在 -70℃条件下分别保存 15年、10年、15年 ,其最小致死量均可达到 10 - 4稀释 ,家兔 3/ 4死亡 ,符合规程要求 ;繁殖毒种的鉴定结果也可达到规程规定的标准     

狂犬病灭活疫苗（Flury LEP株）等科技合作项目正式签约

2009年9月15日（南京）,在中国兽医药品监察所、中国动物保健品协会联合主办的第二届中国兽药大会上,狂犬病灭活疫苗（Flury LEP株）的研制、猪圆环病毒灭活疫苗研制、校企合作共建“兽药研究中心”等3个科技合作项目正式签约。签约总金额1.1亿元。     

猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及免疫原性初步研究

采集浙江某猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑、脾脏等组织病料,经PCR检测为猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒感染,用BHK-21细胞进行病毒的分离培养,结果显示该病毒能引起典型的细胞病变,第4代病毒液毒价达10^7.0 TCID_50/mL;PCR和动物回归试验结果表明该分离株为PRV,并将其命名为PRV ZJ株。将第4代病毒液制备成油乳剂灭活苗,免疫2 kg左右家兔,免疫后28 d采血并攻毒,测定其免疫原性,结果显示血清中和指数为13490,保护率为100%。本试验结果表明PRV ZJ株有很好的免疫原性,为进一步开展疫苗研究奠定基础。     

伪狂犬病病毒Guizhou-DY株gE基因主要抗原表位区原核表达及免疫原性研究

根据GenBank公布的伪狂犬病病毒GDSH株（EF552427）的gE基因序列设计1对特异引物,对伪狂犬病病毒 Guizhou-DY分离株的gE基因进行PCR扩增,将扩增产物克隆到pMD19-T载体上,构建重组质粒pMD19-T-gE636,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将gE基因主要抗原表位区亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,成功构建原核表达质粒pET-32a(+)-gE636,并将其转化至BL21(DE3)中,诱导表达目的蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳、Western blot分析,得到了约42.7 ku的条带,与预期大小相符,进一步提取、纯化目的蛋白,将目的蛋白加入弗氏佐剂免疫小鼠,免疫后采血检测抗体,结果显示目的蛋白能诱导小鼠产生一定的抗体,该研究为伪狂犬病亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

鸡传染性鼻炎灭活疫苗生产检验用副鸡禽杆菌Hpg-8株的保存期试验

对不同冻干年代的副鸡禽杆菌Hpg-8株菌种分别进行了毒力测定和免疫原性试验.分别用1991、1997、2001、2011年冻干的菌种,以约3万CFU/羽眶下窦接种2月龄SPF母鸡,结果均可使鸡5/5发病;分别用1991、1997、2011年冻干的菌种,经繁殖制备疫苗后接种SPF鸡,结果可提供8/8、7/7、7/7保护.结果表明,副鸡禽杆菌Hpg-8株在-70℃保存10、14、20年后的毒力和在-70℃保存14、20年后的免疫原性仍符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二○○○版)规定.     

狂犬病毒的增殖及保藏效果的初步研究

狂犬病是人和家畜的一各生中枢神经系统的疾病，严重地威胁人类和家畜的生命。狂犬病街毒的收集，增殖及对这些毒株进行妥当的保藏，有利于人们充分保护这些病毒资源，并为今后利用该病毒开展治病防病工作提供实验材料。     

嵌合犬瘟热病毒H基因的重组狂犬病病毒的构建及免疫原性研究

【目的】构建表达犬瘟热病毒（CDV）血凝素蛋白H基因的重组狂犬病病毒（RABV）,并研究其生物学特性及免疫原性。【方法】在RABV HEP-dG株基因组G与L基因之间插入CDV H基因,构建重组全长cDNA质粒pHEP-dG （H）。将pHEP-dG （H）与辅助质粒共同转染BHK细胞,拯救携带CDV H基因的重组RABV HEP-dG （H）。将重组病毒接种BHK细胞,分析病毒的扩散能力;将重组病毒接种小鼠,分析病毒的致病性和免疫原性。【结果】RT-PCR及直接免疫荧光显示,传至第3代的病毒仍能检测到H基因,表明CDV H基因已成功插入RABV基因组中,并在HEP-dG （H）中稳定遗传和正确表达。HEP-dG （H）在BHK细胞中的生长曲线与HEP-dG毒株相似,病毒滴度在96 h达到峰值,但HEP-dG （H）的滴度在每个时间点略低于HEP-dG。以感染复数（MOI）为0.005感染BHK细胞,HEP-dG （H）的扩散能力比HEP-dG毒株低。HEP-dG （H）与HEP-dG对6周龄成年小鼠均不致死,但HEP-dG （H）对成年小鼠体重的影响弱于HEP-dG。HEP-dG （H）与HEP-dG均能诱导小鼠产生抗RABV的中和抗体,免疫后7 d抗体已达到保护水平（0.5 EU/mL）;此外,HEP-dG （H）可诱导产生CDV中和抗体。HEP-dG （H）与HEP-dG免疫小鼠3周后,均能抵御RABV标准攻毒毒株CVS-24的攻击。【结论】本研究成功构建重组RABV HEP-dG （H）,其具有良好的免疫原性和安全性,可作为RABV-CDV新型二联基因工程候选疫苗。     

一株狂犬病病毒街毒株的分离鉴定与组织培养

对来自河北省无极县某地区疑似狂犬病病犬脑组织进行FAT、电镜观察、RT-PCR扩增,以及MIT法等确诊为狂犬病,对分离到的这株狂犬病街毒命名为WJ07-1,分析N蛋白和G蛋白序列,主要抗原位点发生轻度变异,同源性分析发现N基因与ZhejiangWz(H)株同源性最高为99.0%,G基因与JSL27株同源性最高为99.4%。对分离到的狂犬病病毒进行组织培养发现这株狂犬病病毒街毒株对细胞的适应性和感染性很弱,需要进行多次传代培养,才可以适应N2a、BHK-21细胞。     

狂犬病病毒Flury-LEP株全基因组的克隆与序列分析

用RT-PCR法获得了涵盖狂犬病病毒Flury LEP株全基因组的3个重叠的cDNA片段,将获得的cDNA片段分别克隆至pMD18-T Simple载体上并进行序列测定,对测序结果进行拼接,得到全长cDNA序列,结果表明,Flury LEP株全长为11 924 bp,3-′UTR长58 bp,编码区核苷酸为11 723 bp,5-′UTR为131 bp。     

鹿源狂犬病野毒8202株基因型的研究

为了从基因水平确定鹿源狂犬病野毒8202株与其它狂犬病病毒的进化关系,应用RT-半嵌套式PCR技术,利用3条引物对病毒的核蛋白基因进行扩增、克隆及序列测定,并与已发表的狂犬病病毒株3aG、PV、CVS、HEP-Flury、RC-HL、Nishigahara、SADB19的核蛋白基因进行了比较分析。结果表明,8202株与其它7个病毒株均来源于同一个进化枝,属于基因Ⅰ型。     

CDV-N重组狂犬病病毒的毒力及其免疫原性测定

为了探究CDV-N重组狂犬病病毒的毒力及对小鼠的免疫效果,将CDV-N重组狂犬病病毒于BSR细胞上扩毒培养、浓缩后测定其FFD₅₀及LD₅₀;将浓缩后的重组病毒液与复合佐剂按一定比例混匀,按不同免疫剂量、不同免疫方式分组免疫接种小鼠,利用ELISA试剂盒对狂犬病、犬瘟热的特异性抗体进行定性/定量检测。结果显示,重组病毒浓缩后的FFD₅₀值为7.85logFFD₅₀/0.1 mL,LD₅₀值为7.67logLD₅₀/0.03mL;免疫接种后第14天抗体阳性率达100%,小鼠血清中的特异性抗体IgG水平随着免疫剂量的递增而递增。试验结果可为CDV-N重组狂犬病病毒制备口服弱毒疫苗的进一步研究提供试验数据。     

狂犬病病毒口服疫苗株SRV9基因组全长cDNA的克隆及特性分析

为了解狂犬病病毒口服疫苗株SRV9的基因序列与生物学特性的关系，明确其作为疫苗株的分子基础，通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，获得了贯穿全基因组的3个重叠的cDNA片段。将获得的cDNA片段分别克隆至pMD-18T载体上并进行序列测定，对测序结果进行拼接得到全长cDNA序列(GenBank登录号：AF499686)。SRV9株与亲本株SAD B19全序列比较分析显示，二者同源性为99．8％，SRV9的变异主要发生在糖蛋白的编码区域，共有5个碱基发生改变．在转录酶蛋白编码区出现2个碱基的改变，其他蛋白编码基因均未出现突变；氨基酸比较分析显示，在转录酶蛋白氨基酸序列发生2个改变；糖蛋白成熟肽的第34位、292位、333位和338位氨基酸分别发生了Gly→Glu。Ala→Thr，Arg→Ser，Ile→Val的改变，其中第34位氨基酸位于第1抗原区，第333位和338位氨基酸位于第1抗原区。这些抗原位点的突变可能是引起病毒蚀斑特性改变、毒力降低和免疫原性及安全性提高的重要原因。     

狂犬病病毒野毒株DRV磷蛋白基因的克隆及序列分析

通过对狂犬病病毒鹿源(DRV)野毒株总RNA的提取,用RT-PCR方法扩增磷蛋白(NS)基因并与T载体连接、克隆,将其转化到大肠杆菌JM109细胞中,测定NS蛋白基因的序列,与其它已经发表的国际标准株、疫苗株等进行比较,分析其氨基酸的同源性,构建系统进化树,为狂犬病病毒野毒株全基因序列的测定奠定基础。