ω-3脂肪酸脱氢酶在高、低油大豆品种中的克隆与序列分析

α-亚麻酸（ALA）被称为必需脂肪酸,对人体有一系列的保健作用。ω-3脂肪酸脱氢酶（FAD）催化亚油酸（LA）生成ALA。大豆种子中ALA含量较高,为了比较高、低油大豆ω-3FAD的序列差异,用RT—PCR方法从大豆品种鲁豆11和郑9525的未成熟种子中扩增GmFAD3C的cDNA,获得的cDNA长度为1174bp,编码380个氨基酸。在推测的氨基酸序列中发现19处差异,为研究GmFAD3C基因在高、低油大豆种质中的差异表达奠定了基础。     

向大豆导入琉璃苣Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的初步研究

采用RT-PCR法扩增出中国境内生长的琉璃苣Δ6-脂肪酸脱氢酶基因,序列分析表明,该基因全长为1 359个核苷酸,与美国德克萨斯州的琉璃苣Δ6-脂肪酸脱氢酶基因同源性可达到99%。将克隆到的基因连接pRTL2质粒的35S启动子,构建重组载体pPTN-D6D,并通过农杆菌介导的子叶节转化系统,将该基因导入到垦农18和小粒豆2个大豆品种中。经PCR检测分析,初步证明琉璃苣Δ6-脂肪酸脱氢酶基因已导入并整合到大豆基因组中。     

大豆低亚林酸突变体合成位点MGDG的脂肪酸行为

本文比较了大豆低亚麻突变体（Ａ５）及其诱导有体（Ａ６）亚麻酸合成位点ＭＧＤＧ的脂肪酸变化。研究结果表明低亚麻突变体Ａ５的下胚轴、子叶、上胚轴和真叶中叶体被膜亚麻酸合成位点单半乳糖苷本酯酰（ＭＧＤＧ）上亚麻酸（１８：３）水平均高于Ａ６相应组织。子叶中亚麻酸合成前体磷脂酰胆碱（ＰＣ）配比１８：０／１８：３，８１：１／１８：３以及１８：２／１８：３分别呈主度显著正相关或负相关，Ａ６夫叶中１８：３水平毕高     

大豆低亚麻酸突变体合成位点MGDG的脂肪酸行为

本文比较了大豆低亚麻突变体（Ａ５）及其诱导前体（Ａ６）亚麻酸合成位点ＭＧＤＧ的脂肪酸变化。研究结果表明低亚麻突变体Ａ５的下胚轴、子叶、上胚轴和真叶中叶绿体被膜亚麻酸合成位点单半乳糖苷二酯酰（ＭＧＤＧ）上亚麻酸（１８∶３）水平均高于Ａ６相应组织。子叶中亚麻酸合成前体磷脂酰胆碱（ＰＣ）配比１８∶０／１８∶３（ｒ１８∶０／１８∶３＝０．８７２＊＊），１８∶１／１８∶３（ｒ１８∶１／１８∶３＝－０．９５８＊＊）以及１８∶２／１８∶３（ｒ１８∶２／１８∶３＝－０．９６５＊＊）分别呈高度显著正相关或负相关。Ａ６真叶中１８∶３水平皆高于上胚轴、子叶、下胚轴和幼根。诸组织中１６∶０、１８∶２和１８∶３水平变化尤为明显，而１８∶０和１８∶１变化较小。幼根中１６∶０和１８∶２水平均高于其他组织，且１８∶２高于１８∶３。     

脂肪酸去饱和酶FAD3蛋白特征及其在大豆中的遗传演化分析

微体ω-3脂肪酸去饱和酶(Fatty Acid Desaturase 3,FAD3)是植物种子α-亚麻酸生物合成的关键酶。尽管很多FAD3基因被分离和鉴定,植物FAD3蛋白结构特征及遗传演化研究较少。为了探究脂肪酸去饱和酶FAD3蛋白特征及其在大豆中的遗传演化情况,本研究分析了37个物种(包括33种植物、2种蓝藻和2种真菌)的51个FAD3蛋白的序列特征和进化关系,并分析了大豆3个GmFAD3(GmFAD3A、GmFAD3B和GmFAD3C)基因在598份材料中的单倍型及其编码蛋白构象。结果发现,植物FAD3蛋白序列和结构较为保守,其进化关系与植物分化进程一致。GmFAD3A、GmFAD3B和GmFAD3C分别包含14,4和4种单倍型。GmFAD3A-1(Hap1/2)在各大豆种植区域均有分布,Hap3/4/5除华南和西北地区外,其他地区均有分布。虽然GmFAD3A-1(Hap1/2/4)和GmFAD3A-1(Hap3/5)编码蛋白构象差异较大,但可能与地理分布并无关联。而GmFAD3A-2(Hap1～5)编码蛋白构象基本相同,表明GmFAD3A-2可能并未受到选择。GmFAD3B(H...     

花生△12脂肪酸脱氢酶基因FAD2的克隆及反义表达载体的构建

从花生的幼嫩叶片中提取总DNA，应用PCR方法分离到了两个FAD2基因片段，分另4命名为FAD2-1和FA192-2，将反向的FAD2-1和FAD2-2片段分别与所克隆的大豆油体蛋白基因启动子片段oleosin-a与oleosin-b相连，在中间表达载体pSPROK中构建了三个带T-nos的融合基因，进而把融合基因构建到植物表达载体pCAMBIA1300中，酶切鉴定后进行测序，结果表明，所构建的三个植物表达载体均分别带有Oleosin启动子和反义FAD2基因序列，FAD2-2的长度为593bps，与引用序列的同源性达到97％，包含一个起始密码子；FAD2—1的长度为1175bp，与引用序列的同源性达到99％，包含一个起始密码子与一个终止密码子。将构建好的植物表达载体已经转化农杆菌LBA4404并用于侵染花生外植体。     

花生△12-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

根据已报道的△12-脂肪酸脱氢酶基因(FAD)的氨基酸保守序列设计引物进行RT-PCR扩增,得到花生△12-脂肪酸脱氢酶基因881bp部分cDNA序列,然后通过快速扩增cDNA末端技术(RACE),向两端延伸得到1410bp的花生△12-脂肪酸脱氢酶基因全长cDNA序列。序列分析表明有一个长1140bp、编码379个氨基酸残基的开放阅读框,所编码蛋白质的大小约为43kDa。推测的氨基酸序列具有膜整合蛋白酶特异性的3个组氨酸保守区;氨基酸疏水性分析结果表明,所编码的氨基酸序列存在2个具有膜固定蛋白(membrance-anchored protein)重要特征的疏水结构,2个疏水区共跨膜4次,这些特性表明所获得的序列为△12-脂肪酸脱氢酶基因。     

花生Δ12脂肪酸脱氢酶基因FAD2的克隆及反义表达载体的构建

从花生的幼嫩叶片中提取总DNA,应用PCR方法分离到了两个FAD2基因片段,分别命名为FAD2-1和FAD2-2,将反向的FAD2-1和FAD2-2片段分别与所克隆的大豆油体蛋白基因启动子片段oleosin-a与oleosin-b相连,在中间表达载体pSPROK中构建了三个带T-nos的融合基因,进而把融合基因构建到植物表达载体pCAMBIA1300中,酶切鉴定后进行测序,结果表明,所构建的三个植物表达载体均分别带有Oleosin启动子和反义FAD2基因序列,FAD2-2的长度为593bps,与引用序列的同源性达到97%,包含一个起始密码子;FAD2-1的长度为1175bp,与引用序列的同源性达到99%,包含一个起始密码子与一个终止密码子。将构建好的植物表达载体已经转化农杆菌LBA4404并用于侵染花生外植体。     

花生△12脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B在酿酒酵母中的表达及功能分析

花生油中亚油酸(LA,C18:2Δ9,12)含量很高,为了研究花生Δ12脂肪酸脱氢酶(Δ12 FAD)的功能,用RT-PCR方法从花生未成熟种子中扩增出AhFAD2B的cDNA,连接到酵母表达载体p416中,并转化酿酒酵母K601,得到工程菌Kp4AFAD2B。气相色谱分析脂肪酸成分,结果表明该基因能在酵母K601中表达,并使菌株产生了两种新的脂肪酸即棕榈二烯酸(C16∶2Δ9,12)和亚油酸(C18∶2Δ9,12),含量分别占总脂肪酸的2.1%和9.2%,棕榈油酸(C16∶1Δ9)和油酸(C18∶1Δ9)含量与对照相比相应地下降,证明该基因编码的Δ12脂肪酸脱氢酶除能作用于C18∶1Δ9,还具有催化16碳的C16∶1Δ9底物在Δ12位脱氢生成C16∶2Δ9,12的功能,但在两种底物之间可能更偏爱C18∶1Δ9。     

大豆PAL2-3基因的克隆及转化研究

大豆异黄酮是苯丙氨酸代谢途径中合成的一类次级代谢产物,在苯丙氨酸代谢途径中,苯丙氨酸解氨酶(PAL)是关键酶和限速酶。本课题组前期研究发现PAL基因的相对表达量与大豆异黄酮含量具有明显的协同增减趋势,并且在PAL基因家族成员时空表达模式分析中发现,PAL2-3(XM_003542493)是PAL基因家族中相对表达量较高的主要表达成员之一。本试验首先通过克隆大豆中PAL2-3基因;然后构建pCAMBIA3301-GmPAL2-3植物过表达载体,将构建好的pCAMBIA3301-GmPAL2-3表达载体重组质粒转化到根癌农杆菌EHA105中;采用农杆菌介导的大豆子叶节转化体系获得转化植株,并对T1代转化植株进行PPT检测,外源标记基因Bar检测以及荧光定量PCR检测,对转基因阳性植株进行大豆籽粒异黄酮含量的测定。结果表明T_1代转基因植株中PAL2-3基因的表达量是对照的5.11~11.24倍,总异黄酮含量最高的(2 587.63μg·g~(-1))是对照(1 616.90μg·g~(-1))的1.6倍。因此在大豆中过量表达PAL2-3基因可以提高大豆籽粒中异黄酮含量。     

花生ω-3△~(15)-脂肪酸脱氧酶基因AhFAD3A的克隆及其表达

花生油中的α-亚麻酸含量在不同种质资源中存在着差异,与籽仁的不同发育时期也密切相关。本研究通过生物信息学分析并利用RACE的方法,从萌发的花生子叶中克隆了一个参与花生α-亚麻酸合成的ω-3△15-脂肪酸脱氢酶基因,命名为AhFAD3A。利用荧光定量PCR分别比较分析了AhFAD3A和Ah FAD8基因在花生不同组织、籽仁发育不同阶段、萌发过程中的表达特征,结果表明:AhFAD3A基因主要在花期的叶片组织和根部、籽仁形成期表达,在其它发育阶段该基因的表达量比较低,证实该基因的表达与花生籽仁中α-亚麻酸的形成呈正相关;AhFAD8基因在花生的整个生育阶段的绿色组织中表达、非光合组织中几乎不表达。以上研究结果为进一步确定AhFAD3A基因的功能、表达调控及其与花生籽仁中α-亚麻酸形成的关系提供了研究基础。     

蓖麻三磷酸甘油脱氢酶基因 (RcGPDH)的克隆及功能分析

为了阐明蓖麻三磷酸甘油脱氢酶基因（glycerol-3-phosphate dehydrogenase, RcGPDH）在蓖麻油累积过程中的作用,本研究根据已报道的蓖麻种子表达序列标签（Expressed Sequence Tags,EST）设计引物,通过RACE（rapid-amplification of cDNA ends)方法克隆蓖麻RcGPDH基因的全长并对其序列进行分析,构建了该基因的酵母表达载体PYES2.1/V5-His-TOPO-RcGPDH,以载体PYES2.1/V5-His/lacZ质粒DNA为对照,转化酵母野生型菌株BY4742,运用分光光度法测定转基因酵母的生长曲线,通过香草醛法测定稳定生长期的转基因酵母的油脂含量。结果表明,转基因菌株比转空载体对照菌株生长慢,两者均在培养18h后进入平台期;两个菌株的油脂含量没有明显的差别,表明RcGPDH基因对酵母油脂的累积没有起到积极的作用,在蓖麻种子中可能还存在另一个GPDH同源基因参与TAG的合成。     

基于多元素和脂肪酸指纹特征的中国北方大豆产地鉴别研究

为探讨数据融合技术用于邻近区域大豆产地鉴别的可行性,在黑龙江省农垦九三管理局和绥化地区采集216份大豆样品,测定镁（Mg）、铝（Al）、磷（P）等13种矿物质元素含量和棕榈酸、硬脂酸、油酸等5种脂肪酸含量。分别利用矿物质元素、脂肪酸、数据级融合和特征级融合数据建立4种核函数的支持向量机（Support Vector Machine,SVM）模型。通过网格搜索算法结合五折交叉验证进行参数优化后,模型识别准确率分别提升至90.77%、92.31%、89.23%、95.38%。结果表明,特征级数据融合技术对邻近区域大豆产地鉴别效果显著,优于其他三种数据识别技术。采用特征级数据融合技术建立支持向量机产地鉴别模型,能够对邻近区域大豆产地进行准确、有效的区分,为地理标志产品保护技术提供了新的研究方向。     

大豆胞囊线虫病抗性候选基因GmRSCN-6 克隆与表达分析

大豆胞囊线虫病（Heterodera glycines,Soybean cyst nematode,SCN）是世界性大豆病害之一,具有致病力强、传播范围广、休眠体（胞囊）存活时间长等特点。因此,大豆胞囊线虫病极难防治。筛选并利用抗病基因是加快大豆抗线育种进程的有效途径之一。本文以东农L-10为材料,克隆GmRSCN-6 基因并分析GmRSCN-6蛋白的性质,同时对该基因在抗感病品种进行表达分析。结果表明GmRSCN-6 在SCN3号生理小种侵染10 d内逐渐上调表达。3 d时表达量出现小高峰,推测GmRSCN-6 基因响应SCN3号生理小种入侵信号,10 d时GmRSCN-6 基因的表达量达到最大,且抗病品种中的表达量远高于感病品种,表明GmRSCN-6 基因参与大豆胞囊线虫病3号生理小种抗性反应。     

皖豆33对SMV株系SC3的抗性遗传分析及分子标记定位

大豆花叶病毒(soybean mosaic virus, SMV)病严重影响我国大豆产量及品质。本研究利用抗病高产稳产大豆品种皖豆33配制抗×感和抗×抗杂交组合,接种SMV优势株系SC3,研究皖豆33的抗性遗传方式及其与不同品种抗性基因间的等位性关系。结果表明:接种SC3后,抗感组合(W illiams82×皖豆33)及(皖豆33×南农1138-2)的F1单株均表现抗病,卡方测验结果显示F2群体符合3抗∶1感的分离比,F2∶ 3家系分离比符合1抗∶2分离∶1感,表明皖豆33对SC3的抗性由1对显性基因(命名为RSC3(w))控制;抗×抗组合科丰1号、齐黄1号和大白麻×皖豆33的抗性基因等位性研究显示,科丰1号与皖豆33携带对株系SC3的抗性基因是等位的或紧密连锁的,齐黄1号、大白麻与皖豆33携带抗SC3的基因是不等位且独立遗传。利用皖豆33×南农1138-2的392株F2群体将皖豆33携带SC3的抗性基因RSC3(w)定位在大豆2号染色体SSR标记BARCSOYSSR_02_0610和ZL-52之间,遗传距离分别为0.29cM和0.35 cM,物理距离约为175 kb。     

水稻脆秆突变体bc1-wu3的鉴定与基因克隆

【目的】茎秆机械强度与植株抗倒伏性直接相关。发掘脆秆突变体,克隆其相关基因有助于了解茎秆机械强度遗传机制,为抗倒伏育种提供理论依据。【方法】在经~(60)Co-γ诱变的粳稻品种武育粳3号后代群体中获得一个脆秆突变体,命名为bc1-wu3(brittle culm 1 from Wuyujing3),以突变体bc1-wu3为母本,Kasalath为父本构建相应的F_2分离群体,采用图位克隆的方法定位相应脆秆基因。【结果】与野生型相比,突变体的叶片、叶鞘、茎秆等组织在全生育期始终表现为脆性,易折断;穗长和粒长显著降低,粒宽显著增加。茎秆细胞细胞壁糖成分测定表明,细胞壁中纤维素含量极显著下降,而木糖、葡萄糖及阿拉伯糖含量则显著增加。茎秆切片观察发现突变体茎秆的厚壁细胞层数减少,厚壁细胞细胞壁极显著变薄。遗传分析表明,bc1-wu3脆性性状受1对隐性核基因控制。采用图位克隆的技术将该基因定位于第3染色体标记MK12与MK18之间,物理距离为57 kb,在此定位区段内包含1个已克隆的脆性基因BC1(LOC_Os03g30250)。测序结果表明,突变体bc1-wu3中BC1基因第2外显子内(CDS 659处)有1个碱基的替换(G-T),导致编码氨基酸由半胱氨酸变异为苯丙氨酸。实时荧光定量PCR结果表明,BC1基因在脆秆突变体bc1-wu3茎秆中的表达量显著降低。【结论】据此推断本研究中定位的脆秆基因bc1-wu3为BC1新等位基因。相关结果加深了对BC1基因功能的认识,有助于阐明水稻茎秆强度遗传机制。     

甘蓝型油菜转录因子FUS3的克隆、表达分析及其与脂肪酸组分的关系

 为了探讨油菜转录因子FUS3的功能及其与脂肪酸组分的关系,从甘蓝型油菜湘油15中克隆到BnaFUS3基因的两个拷贝BnaA2.FUS3和BnaA6.FUS3。它们的CDS区序列分别长927bp和948bp,编码309和315个氨基酸,氨基酸序列变异多发生在C端。转录因子BnaA2.FUS3和BnaA6.FUS3属于含B3结构域的蛋白家族,是亲水性蛋白,无跨膜区,均是膜外蛋白。系统进化树分析表明,BnaA2.FUS3、BnaA6.FUS3两者都是BraFUS3和AtFUS3的同源基因。荧光定量PCR分析表明,BnaA2.FUS3在根、茎、叶、角果皮中均有表达,在种子中相对稳定表达,但在角果皮25d达到峰值;BnaA6.FUS3为种子特异表达,在种子35d达到峰值;两者在角果皮中表达量均呈“M”形趋势。分析脂肪酸积累规律与BnaFUS3表达关系发现,授粉30d后,BnaA2.FUS3和BnaA6.FUS3表达迅速升高,此时各脂肪酸也进入快速增长期;授粉后45d~50d时,两拷贝表达量变化较小,脂肪酸积累亦进入缓慢增长期,并趋于平稳。表明BnaFUS3在甘蓝型油菜的胚胎形成和发育中具有重要影响,对脂肪酸的合成和油脂积累起到重要作用。     

大豆GmWRI1a基因启动子克隆及其功能分析

为了探究大豆种子油脂合成与储存基因GmWRI1a的调节,分析其启动子功能,从大豆品种东农50基因组中扩增获得GmWRI1a基因转录起始位点上游1669bp的启动子序列,转化拟南芥。GUS染色确定了启动子的有效性,继而根据顺式作用元件的分布,分别扩增得到4个启动子5'端缺失片段1138bp,1087bp,690bp和437bp。4个启动子缺失片段分别转化拟南芥后,通过GUS组织染色结果发现,这些启动子片段能够驱动下游GUS基因表达。GUS酶活表明,启动子存在乙烯、茉莉酸、赤霉素3种激素响应元件,其中乙烯、茉莉酸和赤霉素的响应元件分别分布在-1138^-1087bp、-1087^-690bp和-690^-437bp。     

矮化大豆GmEXPA5基因的克隆与表达分析

以矮化大豆HK808的顶芽cDNA为模板,根据植物α-膨胀素基因保守区设计简并引物,并克隆保守区片段,结合RACE 技术克隆得到一个新的膨胀素全长基因,将其命名为GmEXPA5（登录号为JN207916.1）,该基因全长1 233bp,其中开放阅读框636bp,编码211个氨基酸;推导的氨基酸序列经分析发现,该序列含有两个膨胀素保守域domain1（expansin EG45）和domain2（expansin CBD）,无明显的信号肽序列,属于α膨胀素亚家族。构建pEASY-Blunt E1-GmEXPA5重组质粒,获得稳定的原核表达体系,IPTG 诱导后SDS-PAGE 结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。实时荧光定量PCR（real-time PCR）表达分析表明GmEXPA5基因在矮化大豆HK808与野生型大豆东农42两种材料的不同器官中均有表达,而在野生型茎尖及茎部的表达量显著高于矮化大豆,推测该基因与大豆矮化性状的形成可能有一定的关系。     

大豆膨胀素GmEXPA4基因的克隆及表达分析

根据其他植物膨胀素基因保守区设计简并引物,以大豆矮化突变体HK808幼芽的cDNA为模板,克隆到530bp的膨胀素基因保守区片段,并结合RACE 技术克隆得到expansin基因全长序列,将其命名为GmEXPA4基因。生物信息学分析结果表明,该基因属于膨胀素中的α-expansin亚家族。GmEXPA4基因的实时荧光定量相对表达分析表明,该基因在东农42及其矮化突变体HK808中的各个时期都有表达,且与植物的生长量密切相关。