甘蔗镰孢菌插入突变体库的构建、致病变异突变体筛选及突变基因定位

由镰孢菌复合种引起的甘蔗梢腐病（pokkah boeng disease, PBD）是甘蔗的主要病害之一。在广西,甘蔗镰孢菌（Fusarium sacchari）是PBD的优势病原菌。尽管PBD的研究已有较长的历史,但甘蔗镰孢菌的致病分子机理远未得到阐明。为研究甘蔗镰孢菌的致病分子机理,本研究采用农杆菌介导的遗传转化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT）技术构建甘蔗镰孢菌FF001菌株的T-DNA插入突变体库。采用携带潮霉素B磷酸转移酶基因pTHR1-AH双元载体的农杆菌菌株AGL-1介导转化F. sacchari分生孢子,获得3018个转化子;随机选取12个转化子进行PCR检测和Southern杂交分析,结果显示所有检测突变株均插入潮霉素B磷酸转移酶基因,多数为单拷贝插入。采用离体叶片接种评价转化子的致病力,获得致病力明显减弱21个和致病力增强9个,共30个突变体。通过TAIL-PCR扩增测序并与甘蔗镰孢菌基因组序列比对,确定了其中27个突变株的T-DNA插入位点。观察到多个插入位点伴随有基因组片段缺失,导致1...     

河南省花生根、茎和荚果部镰孢菌的分离鉴定

花生根腐、茎腐和果腐病在我国各花生产区发生严重,其病原菌的组成和优势种群尚不明确。本研究于2020年从河南省6个市的花生种植区采集病株样品,共分离得到151个菌株,其中花生根腐病菌41株、茎腐病菌71株、果腐病菌39株。真菌形态鉴定和利用rDNA-ITS和EF-1α序列进行分子鉴定的结果表明,这些菌株均为镰孢菌,分别属于木贼镰孢菌(Fusarium equiseti)、变红镰孢菌(F.incarnatum)、尖孢镰孢菌(F.oxysporum)、层出镰孢菌(F.proliferatum)和茄病镰孢菌(F.solani);从花生根腐和茎腐病样品中都可以检出这5种镰孢菌,果腐病样品中未能检出层出镰孢菌。尖孢镰孢菌在供试的花生根腐、茎腐和果腐病样品中检出率最高,分别为39.02%、30.99%和56.41%。根据柯赫氏法则验证了这5种镰孢菌均对花生具有致病性。本研究明确了河南省花生根腐、茎腐和果腐病的致病镰孢菌组成和优势种群,为病害防控奠定了基础。     

水稻恶苗病致病镰孢种类及菌系研究

水稻恶苗病致病镰孢种类及菌系研究罗俊国（华中农业大学植物保护系,武汉４３００７０）关键词：水稻恶菌病;镰孢;菌系ＳｔｕｄｉｅｓｏｎＰａｔｈｏｇｅｎｉｃＦｕｓａｒｉｕｍＳｐｅｃｉｅｓｏｆＲｉｃｅＢａｋａｎａｅＤｉｓｅａｓｅａｎｄＳｔｒａｉｎｓ￥ＬＵＯＪ...     

小麦茎基腐镰孢菌致病力的快速测定

为建立快速、简便测定小麦茎基腐镰孢菌致病力的方法,将5mm的菌碟套接在催芽3d的小麦胚芽基部,接种后的小麦置于垫有湿滤纸的培养皿中,25℃下光暗(12h/12h)交替培养5d后测量麦苗的长度,以小麦苗长的降低率作为镰孢菌致病力的指标。结果发现,用该方法对12个菌株的致病力的测定结果与湿纸巾法有很强的相关性。经该方法测定,CF0915菌株的野生型和Tri5基因敲除突变体的致病力有显著差异。     

上海地区鲜食玉米穗腐病致病镰孢菌的分离与鉴定

为明确上海地区鲜食玉米穗腐病致病镰孢菌的组成和分布,2020年在上海地区各鲜食玉米种植区采集66份穗粒腐果穗病样,通过组织分离、单孢纯化,获得272株单孢分离物。采用形态学和分子生物学等方法对单孢分离物进行鉴定,共鉴定到8个镰孢种203株镰孢菌,其中拟轮枝镰孢、变红镰孢、亚洲镰孢、产黄色镰孢、木贼镰孢、层出镰孢、新知镰孢和居群镰孢的分离频率依次为67.98%、9.36%、6.90%、5.91%、5.42%、2.96%、0.99%和0.49%。在不同采样区拟轮枝镰孢菌占比存在差异,崇明、奉贤和青浦地区采集的样品中拟轮枝镰孢菌分别占76.25%,71.62%和48.98%。结果表明,拟轮枝镰孢在上海地区鲜食玉米种植区广泛分布,为上海地区鲜食玉米穗腐病的主要优势致病菌。     

美国引进甘蔗材料对梢腐病菌（Fusarium sacchari）的室内抗性评价

为了筛选抗甘蔗梢腐病的优异种质材料,采用室内离体接种方法对70份甘蔗种质材料进行梢腐病抗性鉴定。根据发病程度划分的抗性等级和聚类分析的方法综合评价种质材料的抗性。结果表明,甘蔗分蘖期对梢腐病菌的免疫力较伸长期差。参试的70个种质材料中,高抗材料6个,占8.57%;抗病材料15个,占21.43%;中抗材料13个,占18.57%;中感材料12个,占17.14%;感病材料13个,占18.57%;高感材料11个,占15.71%。在2次不同生育期接种过程中‘HoCP02-263’均未发病,很可能是对Fusarium sacchari免疫的材料。系统聚类分析的结果与材料的抗性表现基本一致。甘蔗梢腐病的抗性评价较佳时期为分蘖期。     

运用同工酶标记对玉米穗、茎腐病串珠镰孢菌亲缘关系的研究

运用同工酶标记技术研究了沈阳、河北、北京等地区玉米穗、茎腐病串珠镰孢菌的亲缘关系 ,以明确引起玉米穗、茎腐病的串珠镰孢菌是否存在寄生专化性或生理分化现象。结果表明 ,各地区玉米穗、茎腐病串珠镰孢菌同源性高、亲缘关系近 ,相似性系数在 0 .86～ 0 .98间 ,菌株间差异仅表现为个体间多样性。     

玉米穗腐病样本中温和镰孢菌的鉴定及其生物学特性

为明确引起玉米穗腐病的一种不常见镰孢菌病原菌及其生物学特性,对采集的镰孢菌穗腐病样本进行病原菌分离和纯化,并通过柯赫氏法则（Koch''s Rule）、形态学特征和分子生物学技术对菌株进行鉴定。结果表明,分离到的菌株ZBSF002为温和镰孢菌（Fusarium temperatum）,是玉米穗腐病的致病菌。对其生物学特性研究表明,温和镰孢菌的最适碳源是可溶性淀粉,最适氮源是酵母浸粉,生长温度范围为10℃~35℃,最适温度为30℃。在pH值为4~11的培养基上均能生长和产孢,在pH值7~10培养基上菌丝生长较快且产孢量较大。光照对菌丝生长和产孢量影响不显著,菌株在光照、黑暗、交替光照3种培养条件下均能生长和产孢,连续光照条件下菌丝生长较快,且产孢量较大。病原菌菌丝和分生孢子致死温度为65℃、10 min。     

运用同工酶标记对玉米穗,茎腐病串珠镰孢力亲缘关系的研究

动用同工酶标记技术研究了沈阳、河北、北京等地区玉米穗、茎腐病串珠镰孢攻的亲缘关系,以明确引起玉米穗、茎腐病的串珠镰孢菌是否存在寄生专化性或生理分化现象。结果表明,各地区玉米穗、茎腐病串珠镰孢菌同源性高、亲缘关系近,相亿性系数在０．８６￣０．９８间,菌株间差异仅表现为个体间多样性。     

尖镰孢菌和禾谷镰孢菌引起的大豆根腐病生物防治研究

以大豆与禾谷类作物轮作体系中引起大豆根腐病的尖镰孢菌(F.oxysporum)和禾谷镰孢菌(F.graminearum)为研究对象,测试分离于大豆和小麦根部及根际土壤的生防菌对2种病原菌防治效果.结果表明:拮抗试验中所测试的生防菌对2种镰孢菌抑菌效果差异不显著,生防菌HJ-ZT1、HJ-MM7、HJ-ZT2、CH-Tr...     

甘蔗镰孢菌碳水化合物结合模块效应基因Fs11724的分离鉴定及功能分析

甘蔗镰孢菌(Fusarium sacchari)是引起毁灭性病害甘蔗梢腐病(sugarcane pokkah boeng disease,PBD)的主要病原菌之一.病原菌分泌的效应蛋白在病原与植物互作中发挥至关重要的作用.本研究基于课题组前期甘蔗镰孢菌全基因测序数据,设计基因特异性引物,通过RT-PCR扩增得到一个新的...     

甘蔗梢腐病菌Fusarium sacchari CYP51基因克隆及遗传转化

甾醇14α-去甲基化酶（CYP51）是生物细胞膜合成所需的一个非常重要的酶,在病原菌的耐药性、致病性和生长繁殖等方面发挥着非常重要的作用。研究表明干扰真菌的CYP51基因表达导致其无法正常生长,显著降低其致病性。本研究以甘蔗梢腐病菌甘蔗镰刀菌（Fusarium sacchari）为试验材料,根据基因组测序数据设计特异性引物克隆得到了FsCYP51基因全长和CDS全长。生物信息学分析表明,该基因序列全长1947 bp,编码区由2个内含子和3个外显子组成,CDS全长1554 bp,编码517个氨基酸,编码蛋白理论相对分子量为58.61 kDa。其编码蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规卷曲构成,具有典型的CYP51保守结构域。预测其亚细胞定位于细胞膜,且存在2个跨膜区域。系统进化分析表明,FsCYP51基因属于CYP51C这一类,与串珠镰刀菌（F. verticillioides）的CYP51C基因亲缘关系最近。同时,根据克隆到的基因全长和CDS全长构建了多价HIGS植物表达载体,并利用基因枪介导的遗传转化方法将干扰片段成功转化至甘蔗受体材料,为研究FsCYP51基因功能和创制抗梢腐病甘蔗种质奠定基础。     

甘蔗响应梢腐病菌侵染的蛋白质组学分析

本文旨在解析甘蔗响应梢腐病菌侵染过程中的生理生化机制,为甘蔗抗梢腐病育种及病害防治提供理论指导和科学参考。以我国甘蔗梢腐病主要致病菌Fusarium verticillioides孢子悬浮液为病原,以高抗梢腐病品种YT94/128和高感梢腐病品种GT37为宿主材料,在温室条件下进行针刺法接种,提取病情指数最严重时期,即接种后第14天的甘蔗叶片蛋白质进行iTRAQ定量表达分析。结果显示,从GT37中成功鉴定3707个蛋白,获得542个差异表达蛋白,其中上调表达187个,下调表达355个;从YT94/128中成功鉴定到3068个蛋白,获得差异蛋白449个,其中上调表达191个,下调表达258个。这说明遗传背景不同的甘蔗品种在蛋白质组成上有很大差异,推测这是不同甘蔗品种间抗梢腐病性差异的重要分子基础。     

茶树GAGP基因克隆及表达分析

采用SSH技术分析了VA菌根处理后福鼎大白茶根系基因差异表达情况,获得了差异序列,序列比对显示,在下调表达序列中可能包含了10种未知功能的基因;在上调表达序列中可能包含了5种可能的基因。采用RACE技术获得GAGP基因长3β146βbp（GenBank,登录号KJ946251）,具有2β769βbp开放阅读框（1^st~2β769^th）,编码923个氨基酸。分子生物信息学分析表明,GAGP蛋白分子量约106.9βkD,等电点为8.42,定位于线粒体内。定量PCR分析表明,GAGP在茶树叶片中表达强度存在明显的品种差异,GAGP对生物性和非生物性胁迫均有明显响应。     

茶树根系Actin基因克隆及表达分析

采用SSH技术分析了VA菌根处理后福鼎大白茶根系基因差异表达情况,获得了差异序列,序列比对显示,在下调表达序列中可能包含了10种未知功能的基因;在上调表达序列中可能包含了5种可能的基因。采用RACE技术获得了Actin基因全长序列,Actin基因长1β606βbp (GenBank, 登录号KJ946252),具有1β131βbp开放阅读框（1^st~1β131^st）,编码377个氨基酸。分子生物信息学分析表明,Actin蛋白分子量约30.69βkD,等电点为5.27,定位于细胞核等亚细胞区位。研究还显示,Actin在不同品种中表达无显著差异,对非生物性胁迫响应也较弱。     

Cloning and Expression Analysis of a Mitogen-Activated Protein Kinase Gene OsMPK14 in Rice

Mitogen activated-protein kinases(MAPKs)are important components in signal transduction pathways responding to various biotic and abiotic stresses.An MAPK gene,OsMPK14(GenBank Accession No.GQ265780)from rice(Oryza sativa L.),was cloned by RT-PCR.The full-length cDNA of OsMPK14 consists of 1660 bp in size,containing an open reading frame of 1629 bp,which encodes a 542-amino-acid polypeptide and has a typical protein kinase domain and a phosphorylation activation motif TDY.Sequence alignment and analysis reve...     

无核荔枝ABA生物合成关键酶LcNCED基因克隆及其在生理落果阶段中的表达分析

9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoids dioxygenase,NCED)是ABA生物合成途径的关键限速酶,本研究利用RT-PCR技术从A4无核荔枝中分离得到NCED的3条c DNA序列(命名为LcNCED1、LcNCED2和LcNCED3)。通过同源比对和系统进化树分析,LcNCED基因编码的氨基酸序列与拟南芥等30个物种中的NCED氨基酸序列同源性都在65%以上,从而确定LcNCED属于NCED家族;通过与7条拟南芥及5条苹果NCED家族基因进行系统进化树分析,LcNCED2与调控苹果花瓣脱落MdNCED2、MdNCED4基因具有较高的同源性。Real-Time PCR表达分析发现,3个LcNCED基因在不同样品间表达存在显著差异,其中LcNCED2在各样品间的表达水平显著高于LcNCED1和LcNCED3,且LcNCED2表现出显著的组织特异性表达特点,花后15~75 d,LcNCED2在离区(果柄离层部位上下0.2 cm)中的表达量均高于种脐和果皮中,在花后45 d达到峰值,花后75 d稍有下降,基因表达的峰值略早于A4无核荔枝落果高峰期。而LcNCED1和LcNCED3在各组织样品中基因表达变化趋势规律不明显。上述结果表明,LcNCED2在离区中表达量变化比较符合A4无核荔枝生理落果趋势,推断LcNCED2基因可能与无核荔枝采前落果关系密切。      

水稻促分裂原活化蛋白激酶基因OsMPK14的克隆及表达分析

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是生物体内信号转导的重要组分,受多种生物及非生物胁迫的刺激活化。利用RT-PCR方法克隆了水稻促分裂原活化蛋白激酶基因OsMPK14的cDNA序列(GenBank登录号为GQ265780)。该序列全长1660bp,包含1个1629bp的开放阅读框,编码蛋白由542个氨基酸组成,包含典型的蛋白激酶结构域及磷酸化位点TDY基序。序列比对和分析显示,OsMPK14基因位于水稻第5染色体上,其编码区由9个外显子和8个内含子组成。采用半定量RT-PCR技术,检测了光照、低温、高盐、干旱和脱落酸对该基因在水稻地上部分和根中表达的影响。结果显示高盐、低温、脱落酸都能上调其表达,而干旱对其表达具有微弱的抑制效应,光照可以降低该基因在水稻地上部分的表达,提高在根中的表达。基因可能在水稻非生物胁迫的应答中具有重要作用,其表达受多种因素调控。