芒果AP2/ERF转录因子MiERF2基因的克隆及表达分析

芒果(Mangifera indica L.)是热带地区主要的经济作物之一,也是典型的呼吸跃变型水果,其成熟衰老与乙烯有关。AP2/ERF转录因子在植物中广泛存在,研究发现这类转录因子参与果实内源乙烯合成的信号转导,是乙烯信号通路中的关键基因,在植物生长发育、逆境胁迫响应及贮藏运输过程中发挥重要作用。为了探究AP2/ERF转录因子对采后芒果成熟衰老的影响,本研究以贵妃芒果品种为研究对象,通过PCR技术克隆得到了1个长度为915 bp,编码305个氨基酸的MiERF2基因。通过生物信息学分析得知：MiERF2蛋白分子式为C₁₄₄₉H₂₂₅₉N₄₃₃O₄₇₀S₁₁,分子量为33 618.16 Da,总原子数为4622,理论等电点为7.66,带30个正电残基,带29个负电残基,蛋白具有亲水性,结构不稳定;MiERF2蛋白不含信号肽和跨膜区域,磷酸化修饰以苏氨酸为主,包含1个AP2保守结构域;二级结构以66.12%的无规则卷曲为主,还含有24.67%的α-螺旋、1.32%的β-折叠、7...     

香蕉中 8 个 WRKY 转录因子的克隆及表达分析

WRKY 转录因子在植物生长发育和抗逆过程中发挥重要作用。为了解香蕉 WRKY 转录因子的功能,本研究 在香蕉根系中克隆了 8 个 WRKY 家族基因,与香蕉基因组数据库比对后,将其分别命名为 MaWRKY2、MaWRKY21、 MaWRKY44、MaWRKY47、MaWRKY125、MaWRKY136、MaWRKY139 和 MaWRKY147。序列分析和遗传进化树结果表 明,MaWRKY2 和 MaWRKY47 属于第 I 类家族,其余 6 个属于第 II 类家族。对 8 个基因在香蕉的根、球茎、假茎、 叶、花和果中的表达进行分析,结果表明,这 8 个基因在所有的器官中均表达,说明这些基因在香蕉的生长发育过程 中起作用。对 8 个基因在盐、低温、干旱、水杨酸、茉莉酸、ABA、乙烯和香蕉尖孢镰刀菌生理 4 号小种胁迫处理的 香蕉苗根系中的表达进行分析,结果表明 8 个基因对这些胁迫均有响应,说明香蕉中的这 8 个 WRKY 基因参与了生物 胁迫、非生物胁迫和激素信号途径。     

龙眼体胚Myb转录因子基因的克隆及序列分析

以龙眼同步化调控的鱼雷形胚为材料,设计特异上下游引物,采用RT-PCR法,获得了797 bp的基因序列。通过NC-BI的BLAST软件进行核苷酸序列和氨基酸序列的同源性搜索及相似度分析,结果表明,所获得的核苷酸序列和翻译的氨基酸序列与其他物种的Myb转录因子有较高的同源性,推断该基因序列属于龙眼Myb转录因子基因。已在GenBank登录,登录号为HQ661039。     

番木瓜NAC转录因子的克隆与表达分析

为探究番木瓜NAC转录因子的序列特征及功能,以‘大庆7号’番木瓜果肉为试验材料,采用RTPCR克隆出2个不同的NAC类基因,命名为CpNAC1(Gene Bank KT364871)和CpNAC2(Gene Bank KT372241),其开放阅读框(ORF)长度分别为609 bp和805 bp,分别编码202个和268个氨基酸,其N端含有NAM保守结构域。采用实时荧光定量PCR研究其在乙烯利及清水对照处理后果实不同成熟时期中的表达情况,结果发现,CpNAC1和CpNAC2基因随着处理后时间的增加,表达量呈先下降后缓慢上升的趋势,且均与果实成熟呈负相关。但CpNAC1表达趋势与果实成熟过程中乙烯的表达量相反,受乙烯抑制降低表达量,从而参与了番木瓜果实的成熟衰老进程,而CpNAC2基因在乙烯处理后番木瓜果实中表达量与对照处理相比没有显著变化,说明CpNAC2基因不是通过乙烯信号传导途径来调控果实成熟。     

菠萝COL基因的克隆及响应乙烯的表达特性分析

COL(CONSTANS Like)基因不仅响应光周期调控,还参与植物器官的发育及非生物胁迫的响应.本研究克隆了4个菠萝COL(AcCOL)同源基因,预测其蛋白的结构理化性质和启动子顺式作用元件,并探究AcCOL基因在乙烯利处理后的时空表达模式.结果表明:AcCOL1、AcCOL2基因分别编码387、243个氨基酸,都...     

芒果MiCOL6基因的克隆及其生物信息学和表达分析

CONSTANS（CO）是光周期途径的核心调控因子,其可以整合光质和生物钟输出的信号调控植物成花。在前期转录组研究的基础上,设计基因特异性引物,通过RT-PCR扩增得到芒果的1个CO基因的cDNA全长,序列长度为678 bp,根据与拟南芥CO家族基因的相似性,将其命名为MiCOL6。生物信息学分析显示,该基因编码226个氨基酸,分子量为26.88 kDa,等电点为4.85,属于亲水性的非分泌蛋白。保守结构域和进化树分析显示,该基因仅含1个CCT结构域,属于CO基因家族的第4组;二级结构分析表明,该蛋白主要以无规卷曲和α-螺旋为主;亚细胞定位预测显示该蛋白定位在细胞质膜上的概率最大;不同花发育时期表达模式分析表明,MiCOL6基因在杧果的花芽分化期表达量最高。本研究结果为进一步研究芒果MiCOL6基因在芒果中的功能提供理论基础。     

小麦WRKY转录因子TaWRKY72B的克隆、亚细胞定位及表达分析

WRKY蛋白是一类转录因子，参与调控植物的多种生长发育和胁迫应答过程。为进一步探究WRKY在小麦响应逆境中的作用，本研究克隆了小麦中国春的TaWRKY72B基因，并对其进行了生物信息学、亚细胞定位和表达模式分析。结果表明，中国春的TaWRKY72B基因编码320个氨基酸，蛋白序列包含典型的WRKY保守结构域和C2H2锌指结构，分子量为33.94 kDa，理论等电点为6.60，是酸性亲水的不稳定蛋白，无信号肽序列，属非跨膜蛋白。二级结构预测表明，TaWRKY72B主要由无规则卷曲( 61.25%)、α-螺旋(23.12%)、延伸链(11.88%)和β-转角(3.75%)组成。TaWRKY72B定位于细胞核，符合转录因子特征。系统进化树分析显示，TaWRKY72B蛋白与节节麦、大麦和水稻等禾本科作物的WRKY亲缘关系较近。启动子顺式作用元件预测结果表明，该基因含有多个与生长发育、激素信号途径以及非生物胁迫应答相关的顺式调控元件。TaWRKY72B表达受激素、高温、低温和盐诱导，推测该基因可能参与小麦逆境胁迫应答和多种激素信号途径。     

茶树CsRAV2转录因子基因的克隆与表达特性分析

RAV转录因子是AP2/ERF家族的成员之一,在植物生长发育和逆境调控中起着重要作用。本研究以安吉白茶和迎霜这两个茶树（Camellia sinensis）品种为试验材料,通过PCR和RT-PCR方法分别从两种茶树的DNA和cDNA中克隆得到CsRAV2基因。分析显示,来源于两种茶树中的CsRAV2基因全长均为1 089 bp,没有内含子,分别编码362个氨基酸,含有相对保守的AP2结合域和B3结构域,具有典型的植物RAV类转录因子特征。从氨基酸组成成分、理化性质、亲水性/疏水性、三级结构上分析显示,茶树中CsRAV2转录因子是亲水性蛋白。茶树中CsRAV2转录因子与拟南芥AtRAV具有相似的三级结构。实时定量PCR分析表明,茶树中CsRAV2基因在茶树根中表达量最高,高温、低温、NaCl处理均能诱导该基因表达,不同品种间存在差异。     

芒果果实bHLH家族转录因子的生物信息学分析

bHLH家族作为植物中较大的转录因子家族之一,在真核生物生长发育调控中具有重要作用。本研究基于芒果果实转录组数据,利用生物信息学方法鉴定出87个bHLH家族蛋白,其中酸性蛋白所占比例较大,大部分为不稳定蛋白,且均为不含信号肽的亲水性蛋白,除CL10714.Contig1为膜结合转录因子外,其余均不含跨膜结构。芒果bHLH蛋白结构域有多个氨基酸位点保守性较高,87个芒果bHLH蛋白中73个（83.91%）具有E-box结合功能。GO分析发现芒果bHLH蛋白共注释到生物学过程、细胞组分和分子功能3大类功能的17个亚类。进化树分析发现芒果bHLH蛋白与拟南芥有较高的保守性,并基于进化树对部分bHLH蛋白的功能进行了预测。本研究结果将为下一步芒果bHLH蛋白的功能研究奠定基础。     

茶树转录因子基因CsDREB-A4的克隆与温度胁迫响应的分析

基于本实验室茶树品种迎霜的转录组数据,通过PCR方法从迎霜的DNA中克隆得到CsDREB-A4基因。分析显示,该基因含开放阅读框长708βbp,编码235个氨基酸,含有AP2/ERF家族转录因子典型的保守AP2结合域,并且与大豆、番茄、葡萄、拟南芥等的DREB转录因子有高度同源性。从进化树、亲/疏水性、无序化特性、二级和三级结构等方面进行预测与分析,结果表明,该转录因子属于AP2/ERF家族中的DREB亚族的A4组,大多数氨基酸属亲水性氨基酸,无序化特征比较明显,三级结构与AtERF1相似。利用实时荧光定量PCR分析表明,在迎霜、安吉白茶、云南十里香3个茶树品种中CsDREB-A4基因均受高温、低温诱导表达。在4℃处理下,在上述3个茶树品种中CsDREB-A4基因表达量均在24βh时达到最大值,分别为对照的23、4、43倍,并且CsDREB-A4基因在迎霜和云南十里香中均比安吉白茶的基因表达上调时间更长,上调程度更大。在38℃处理下,CsDREB-A4基因在迎霜和云南十里香中表达受抑制,均只在8βh时表达量高于对照,而在安吉白茶中表达量显著增加,在12βh时高达对照的2β720倍。     

芒果MiFY基因克隆和表达模式分析

FY是拟南芥自主途径中调控成花的基因,FY通过与RNA结合蛋白FLOWERING CONTROL LOCUS A (FCA)相互作用下调成花抑制基因FLOWERING LOUS C (FLC)的表达从而促进开花。目前关于FY基因如何调控芒果成花的机制尚无研究报道。通过挖掘芒果转录组数据克隆获得1个FY基因,命名为MiFY。生物信息学分析显示,MiFY基因的ORF全长为2178 bp,编码725个氨基酸,蛋白质分子量为799.59 kDa,理论等电点为8.72,氨基酸序列中含有WD40和Cytadhesin_P30两个保守结构域。基因表达模式分析显示,MiFY基因在2个芒果品种的开花期均具有较高的表达水平,而在营养生长期表达水平较低。因此推测MiFY基因可能在调节芒果成花中起着重要作用。     

芒果MinMYB10基因的克隆及表达分析载体的构建

MYB（myeloblastosis）转录因子主要参与调控植物类黄酮代谢、植物生长发育等。为了研究在芒果果实中类黄酮代谢调控机制,本研究从金煌果肉中克隆得到一个MYB基因,将其命名为MinMYB10,其全长cDNA序列为1021 bp,开放阅读框为837 bp。该基因编码的蛋白有278个氨基酸残基,分子重量为31.60 ku,等电点为5.89。通过系统发育分析发现MinMYB10与拟南芥是亲缘关系较近的蛋白。本研究还构建了基因沉默载体pTRV2-MinMYB10和过表达载体 pGreenII 62-SK-MinMYB10,以期在后续研究中探明MinMYB10基因在芒果果实花青素代谢中的作用。     

芒果MiAGL80基因特征及表达模式分析

AGL80/FEM111属于Type I型MADS-box基因家族,调控拟南芥中央细胞及胚乳的发育。目前,AGL80在木本植物中鲜有研究报道。本研究从芒果转录组数据中获得并命名为MiAGL80基因。生物信息学分析表明：MiAGL80基因位于1号染色体上,ORF全长为897 bp,无内含子,编码299个氨基酸,理论等电点为4.95,蛋白质分子量为73.19 kDa,氨基酸序列中含有1个MADS_SRF_like保守结构域。系统进化树分析表明：芒果MiAGL80与阿月浑子PvAGL80最为接近,且同源性最高,氨基酸相似性为64.29%。启动子序列分析显示：芒果MiAGL80基因的启动子包含光响应元件、逆境响应元件、转录因子结合位点以及激素响应元件等,其中光响应元件相较其他元件数量较多,不仅包含光调节相关元件,还包含昼夜节律表达所必需的区域元件;激素响应元件中包括赤霉素响应元件、生长素响应元件和乙烯响应元件;逆境响应元件主要是干旱响应元件。基因表达模式分析显示：在芒果果实中,MiAGL80随着芒果果实的逐渐发育,其在果肉中的表达水平持续下降,在花后100 d的果实与成熟果中的表达水平很低;在种胚发育过程中其表达水平先上升后下降,在花后100 d的胚和成熟胚中表达水平也很低;在种胚萌发发育期,其表达水平再次升高。在成花发育不同时期的组织器官中：MiAGL80主要在叶片中表达,其表达量先降低后逐渐升高,然后再降低,在花器官发育末期达到最大值;在花芽中的表达水平也显著高于营养芽;但在茎中表达量极低,几乎不表达。说明MiAGL80在芒果果实发育、种胚发育、种子萌发以及成花调控方面发挥作用。以上研究结果为深入研究MiAGL80基因的功能提供参考。     

香蕉乙烯受体基因cDNA的克隆及其表达分析

提取香蕉果实总RNA，根据有关文献报道的乙烯受体基因序列设计引物，通过RT-PCR方法扩增其开放读框(open reading frame，ORF)，结果同时扩增出2个长短不同的特异cDNA序列。测序结果表明：其中较长的cDNA序列与该报道的香蕉乙烯受体cDNA序列的对应区段(ORF)长度一致，同源性为99．1％；另一较短cDNA序列为新序列，其与该报道序列的同源性达97．2％，但缺少该报道序列中的19和1036 bp的区段。RT-PCR扩增结果显示，报道的cDNA序列在香蕉果实的几个成熟阶段均有表达，而在根和叶片等组织中检测不到其表达，说明其表达具有果实组织特异性。Southern杂交结果显示，该报道基因序列在香蕉基因组中为单拷贝存在。因此，推测新克隆的缺失cDNA序列可能来自同一基因的转录后剪辑，其可能为1个新的香蕉乙烯受体基因。     

番木瓜干旱胁迫相关CpDHN基因的克隆与原核表达

本研究基于转录组获得的CpDHN转录本序列,以番木瓜‘台农二号’组培苗叶片为材料,采用RT-PCR技术克隆了该基因包含完整ORF在内的425 bp cDNA序列。序列分析表明,CpDHN预测编码93个氨基酸,其理论分子量为10.50 kDa、等电点为6.62、总平均疏水指数为-1.984、核定位。除保守的K片段外,蛋白还含有1个S片段,可归为KS型脱水素。在拟南芥中的10个脱水素中,CpDHN与AtLEA8的亲缘关系最近,相似性为53.3%。值得注意的是,虽然CpDHN的编码区不存在内含子,但其3°UTR含有1个与AtLEA8类似的内含子。表达谱分析显示,该基因在根和叶片中均受干旱胁迫诱导。此外,还构建了CpDHN的原核表达载体,SDS-PAGE分析显示,该蛋白在大肠杆菌中可高效表达。这些结果为下一步的功能鉴定奠定了坚实的基础。     

芒果MiFRI1和MiFRI2基因的克隆与表达分析

FRIGIDA(FRI)是植物春化途径中影响成花的关键基因之一.本研究克隆了2个芒果FRI基因,分别命名为MiFRI1和MiFRI2.序列生物信息学分析结果显示,MiFRI1和MiFRI2基因的ORF长度分别为1752、1815 bp,编码584、605个氨基酸,蛋白质分子量为64.98、66.86 kDa.进化树分析...