马铃薯接骨木镰刀菌的分子检测

接骨木镰刀菌是马铃薯干腐病的主要致病菌,给黑龙江省马铃薯造成了一定的经济损失。采用马铃薯干腐病引物LDJ1对马铃薯干腐病、马铃薯晚疫病、马铃薯早疫病、马铃薯黑痣病的致病菌的ITS序列进行测定,只有马铃薯干腐病菌扩增出560 bp特异性片段。再分别对接骨木镰刀菌、燕麦镰刀菌和茄病镰孢变种的ITS序列进行BLAST比对分析,针对接骨木镰刀菌设计了特异引物L2,扩增特异性产物为278 bp,该引物所建立的PCR检测体系可检测DNA含量在50 pg/μL以上的目的基因。     

玉米全基因组批量化SSR多态性标记开发及PCR扩增验证

简单序列重复在真核生物的基因组中含量非常丰富,且常常随机、均匀分布于整个基因组中。SSR标记广泛应用于动、植物基因定位、群体遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建、指纹图谱构建、种质鉴定、分子标记辅助选择等方向。随着大量全基因组序列的公布,NCBI等数据库中可利用的序列信息量激增。但在常规分子生物学研究中,仍然延续传统的小规模SSR标记开发模式,开发标记数量非常有限、效率较低。结合MISA脚本指令、Primer3引物设计软件、e-PCR特异性扩增分析软件,对玉米全基因组水平SSR位点进行搜索、引物设计、特异性扩增分析以及扩增长度差异分析,开发高密度的SSR标记。通过引物合成、PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳,从常规分子生物学水平验证所开发标记的可靠性。     

小麦AFLP_SCAR标记的开发及应用

为给小麦DNA指纹及基因或QTL定位等研究提供更多、更具有特异性的分子标记,将760条小麦AFLP（Amplification fragment length polymorphism）片段回收、克隆和测序,通过与美国农业部Grain-Genes数据库中的DNA序列进行比对,在760条AFLP片段中有155条与GrainGenes中的片段高度同源,其余605条片段为新发现的小麦DNA序列。利用同一AFLP引物组合扩增的同长度片段的DNA序列差异设计了178对AFLP-SCAR（Sequence Characterized Amplified Region）引物。115对引物在不同小麦品种中扩增出稳定清晰的多态性产物,其中46对引物在小麦品种间能够扩增出DNA片段长度多态性,可检测DNA位点59个,可在种子纯度鉴定、遗传作图和构建小麦DNA指纹等方面得到应用;另69对引物的扩增产物在品种间无长度多态性,但具有SNP多态性（Single nucleotide polymorphism）。     

小麦铁结合蛋白基因的同源克隆

为了寻找一种简捷的克隆同源基因的途径,以小麦铁蛋白基因的同源克隆为例,利用玉米的铁结合蛋白基因序列比对小麦的EST库,在网上进行电子延伸后以起始密码子为起点,终止密码子为终点设计特异性强的引物进行基因克隆,经过引物Ol和Fcds扩增片段的测序及Blast比对,证实本试验已成功地从小麦的基因组和cDNA中克隆出铁结合蛋白基因.最后对基于同源序列克隆基因的策略及引物设计技巧进行了探讨.     

小麦铁结合蛋白基因的同源克隆

为了寻找一种简捷的克隆同源基因的途径,以小麦铁蛋白基因的同源克隆为例,利用玉米的铁结合蛋白基因序列比对小麦的EST库,在网上进行电子延伸后以起始密码子为起点,终止密码子为终点设计特异性强的引物进行基因克隆,经过引物O1和Fcds扩增片段的测序及Blast比对,证实本试验已成功地从小麦的基因组和cDNA中克隆出铁结合蛋白基因。最后对基于同源序列克隆基因的策略及引物设计技巧进行了探讨。     

AFLP-SCAR标记的开发及应用

为给小麦DNA指纹及基因或QTL定位等研究提供更多、更具有特异性的分子标记,将760条小麦AFLP(Amplification fragment length polymorphism)片段回收、克隆和测序,通过与美国农业部GrainGenes数据库中的DNA序列进行比对,在760条AFLP片段中有155条与GrainGenes中的片段高度同源,其余605条片段为新发现的小麦DNA序列.利用同一AFLP引物组合扩增的同长度片段的DNA序列差异设计了178对AFLP-SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)引物.115对引物在不同小麦品种中扩增出稳定清晰的多态性产物,其中46对引物在小麦品种间能够扩增出DNA片段长度多态性,可检测DNA位点59个,可在种子纯度鉴定、遗传作图和构建小麦DNA指纹等方面得到应用;另69对引物的扩增产物在品种间无长度多态性,但具有SNP多态性(Single nucleotide polymorphism).     

低磷胁迫柱花草差异表达基因分析研究

研究柱花草在低磷条件下生长的分子机理和反应机制。采用cDNA-SRAP分子标记技术分离柱花草茎和叶在低磷胁迫下相关基因的差异表达片段,并对其进行生物信息学分析。结果表明,8对引物组合共扩增出差异片段195条,其中抑制型表达片段56条,诱导型表达片段92条,上调表达型差异片段36条,下调表达型片段11条,大小均在50~1000 bp之间。二次扩增后将特异性条带回收后进行测序,通过BLAST比对,共比对出14条差异片段的同源序列,其中8个差异表达的核苷酸序列与已知功能基因（JCVI-FLLj-1K4未知mRNA、NBS-LRR型抗病蛋白、ATP合成酶、醛固酮还原酶、叶绿体RF2）有较高同源性,5个序列与假定基因或预测基因（UPF0051蛋白、蛋白酶启动子、SCEI结合酶、吲哚-3-丙酮酸盐单氧酶）同源性较高。本研究为筛选柱花草响应低磷胁迫的差异基因提供参考。     

利用DDRT-PCR分析茶树冬季冷驯化过程中基因表达的差异

采用DDRT-PCR方法对茶树冬季冷驯化过程中3个样品基因差异表达进行初步研究。结果表明,抗寒性不同的茶树存在基因差异表达。从134条差异片段得到稳定扩增的差异片段31条。根据差异片段的序列设计引物对部分片段进行RT-PCR鉴定假阳性,得到10个阳性片段,其中6个表达量增加,4个表达量降低。经过BLAST比对分析,这些基因与多种植物基因同源性较高,如nectainⅢ蛋白基因(3)、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶蛋白家族基因(48)、微管蛋白特异性C伴侣基因(52)、光合系统Ⅱ蛋白D1基因(80、138)、卵磷脂胆固醇酰基转移酶(147),15、82、134和葡萄的蛋白同源性较高。72经比对没有同源性序列。     

基于同源克隆技术分离玉米漆酶基因片段

漆酶是木质素生物合成途径的关键酶,其高度保守的铜离子结合区以及N末端糖基化位点使利用同源克隆技术成为可能。本研究利用GeneBank中公布的黑麦草漆酶基因全长cDNA序列及在玉米数据库中的比对结果设计特异引物,以8份AS系列玉米自交系为模板进行PCR筛选。经过提取质粒、测序及对推导的氨基酸序列进行比对,发现所克隆基因片段中含有保守的H-A-H基元和N末端糖基化位点,为以后玉米漆酶基因全长的克隆以及饲用玉米改良打下了基础。     

线粒体ISSR与SCAR标记鉴定大豆细胞质雄性不育系与保持系

通过提取细胞质雄性不育系和同型保持系的线粒体基因组DNA,用100条ISSR引物进行筛选,发现引物ISSR829的扩增片段在不育系和保持系间存在差异。对差异片段进行测序发现,该序列仅存在于保持系线粒体基因组中,且位于基因Atp6上游2 000 bp处,推断其可能与不育有关。利用测序获得片段设计引物,用目前已育成的5个大豆杂交种的不育系母本和同型保持系的基因组DNA为模版,进行PCR扩增,发现不育系母本未出现特异片段,而对应保持系出现目的片段,表明该特异片段转化为SCAR标记,可用于不育系的筛选和不育系种子纯度鉴定。     

烟草青枯病菌巢式PCR检测方法的建立及应用

利用细菌16S-23S r DNA内源转录间隔区通用引物L1/L2扩增烟草青枯病菌基因组DNA,并对其扩增产物进行克隆测序,经与近缘种序列多重比对分析后,设计1对特异性引物Rs F/Rs R,用于包括烟草青枯病菌在内的15种不同细菌、5种真菌、3种卵菌基因组DNA的PCR扩增。结果表明:在优化的反应体系与程序条件下,该对引物只能从烟草青枯病菌中扩增出241 bp的特异片段,并通过序列测定验证了其准确性;将引物Rs F/Rs R与细菌通用引物L1/L2进行巢式PCR扩增后,其检测灵敏度在DNA水平上可达0.4 fg/μL,较常规PCR提高1 000倍,表明该对引物能有效地用于烟草组织及土壤中青枯病菌的检测。此结果对烟草青枯病的早期诊断、快速检测及病害流行学研究具有重要意义。     

转基因大豆插入位点分析及特异性PCR检测方法的建立

采用TAIL-PCR方法研究转基因大豆外源基因LEC1插入位点序列特征,并根据此特征建立了LEC1转化事件特异性检测方法。依据正义表达载体上T-DNA区段侧翼序列设计特异性引物和简并引物,获得4个同源序列。对获得的序列进行Blastn分析发现,p69、p148、p225均为载体T-DNA区段一部分,未见大豆基因组序列;P217插入片段的序列分析表明,该序列长863 bp,其中T-DNA左边界序列长143 bp,720 bp为大豆基因组片段,与大豆光系统II类囊体膜蛋白(Thylakoid membrane proteins)的206-926区段同源性为99%,这表明,外源DNA插入了大豆基因组中类囊体膜蛋白编码区的206位。根据分离的序列建立事件特异性定性检测方法,扩增片段大小为277 bp。该事件特异性检测方法具有高度的特异性和良好的灵敏性,为转基因大豆品种LEC1的身份识别提供了有效的方法。     

太空诱变玉米雄性不育突变体的DNA-AFLP分析

利用AFLP标记及克隆测序技术对太空诱变玉米雄性不育突变体的基因组DNA进行分析,寻找与不育性状紧密连锁的分子标记。在供试的56对引物中,32对引物能够扩增出稳定、清晰的条带,4对引物能够在不育株和可育株之间扩增出多态性条带。通过对多态性片段的回收、克隆测序及序列分析结果表明,不育株特有的条带(Zmd1-302)与玉米基因组的克隆(AC187265)和玉米雄配子cDNA文库中的EST序列(gi33771201)同源性都很高,推测该片段和玉米太空诱变核不育之间的育性差异有关。将具有多态性的AFLP标记转化为SCAR标记,3对SCAR引物在8个不育单株和8个可育单株中均有扩增,通过聚丙烯凝胶电泳未检测到不育和可育之间的长度多态性,序列比对分析发现不育与可育之间存在多个单碱基差异。     

应用PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌

根据马铃薯环腐病菌16SrDNA基因片段核苷酸序列设计引物(引物1∶5-′TGTACTCGGCCAT-GACGTTGG-3′和引物2∶5-′TACTGGGTCATGTTGGT-3)′,进行马铃薯环腐病菌PCR特异性扩增试验。合成的引物能从马铃薯环腐病菌总基因组DNA和细菌纯培养,以及人工接种和自然发病的马铃薯块茎中特异性扩增环腐病菌16SrDNA基因片段1046bp。该试验结果为马铃薯环腐病的鉴定、检测及病害流行学研究提供了新的技术和方法。     

芥菜型油菜A09染色体BAC重叠群的构建及分析

利用定位在芥菜型油菜A09染色体上的分子标记对芥菜型油菜（Brassica juncea）ZBjuH BAC文库进行PCR步移筛选。共筛选出725个BAC,测定了315个BAC的末端序列,获得564条BAC末端序列,BLAST分析表明这些末端序列对应白菜（Brassica rapa）基因组序列支架45、支架81、支架40,支架134、支架145和支架59的同源区域,构建了芥菜型油菜A09染色体大约6.3 Mb的BAC重叠群,为芥菜型油菜A09染色体物理图谱构建奠定了基础。     

小麦AFLP片段序列多态性分析和AFLP-SCAR标记的研究

为了解相同长度的AFLP片段中DNA序列的多态性,对70条小麦AFLP片段进行回收、克隆以及测序分析,比较了不同品种间相同长度的AFLP片段、一条AFLP片段的不同单克隆以及品种间非多态性AFLP片段的DNA序列.对70个片段构成的98对同长片段进行DNA序列比对,结果表明:(1)只有3对片段的序列100%相同,其他95对片段之间DNA序列差异为1%～70%;(2)不同小麦品种间同长的AFLP片段中普遍存在DNA序列完全不同、部分不同和具有SNP的现象;(3)一条回收的AFLP带纹的不同单克隆之间也存在DNA序列完全不同、部分不同和具有SNP的现象;(4)品种间有些非多态性AFLP片段的DNA序列也存在多态性.揭示了小麦三套基因组间AFLP等位基因的多态性,以及不同AFLP位点同长片段的DNA序列多态性,对AFLP标记的使用提出了一些不同看法,并提出了利用AFLP片段的序列多态性设计SCAR引物的方法.     

一个木薯候选STK类抗病基因的分离及其生物信息学分析

根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类(STK)结构域Ⅰ和Ⅷ氨基酸保守序列设计了1对简并引物,以细菌性萎蔫病抗/感木薯种质E1340和GR911基因组DNA为模板,通过PCR扩增,均获得大小约0.5 kb的扩增片段。两个片段纯化、克隆、测序后获得完全一致的505 nt序列,比对发现,木薯种质AM560带有和该序列高度同源的核苷酸片段。对包括同源片段上下游各约2.0 kb的大片段序列进行基因预测,获得1个有4个外显子、ORF全长1866 nt的预测基因,命名SSK1。序列分析表明,该基因编码621 aa,有细胞壁受体激酶结合、偶联位点和8个跨膜结构域,具有典型的STK类抗病基因的保守结构,是一个候选的抗病基因,可能在木薯抗病反应中发挥重要作用。     

小麦ramosa3基因cDNA的克隆及其编码序列分析

为进一步研究小麦花序形态建成,依据Genbank中已公布的玉米等禾本科植物中 ramosa3 基因的保守区和小麦 EST序列设计特异性引物,利用 RT-PCR 从普通小麦中国春幼穗总RNA 中克隆得一长度为657 bp的cDNA片段,该片段编码 219 个氨基酸.蛋白序列比对表明,该编码序列与禾本科植物 ramosa3有较高的同源性,可推测此基因是小麦的 ramosa3基因.蛋白质结构预测表明,小麦 ramosa3具有6-磷酸海藻糖酶的结构特征,属于TPP酶家族成员.     

簇毛麦基因组特异DNA序列标记的建立和应用

为建立簇毛麦基因组特异DNA序列的分子标记,以普通小麦中国春、绵阳11、川农17和R111以及多年生簇毛麦、硬粒小麦一多年生簇毛麦双二倍体TDB-3为材料,用120条随机引物进行RAPD分析,筛选出一个多年生簇毛麦的特异性RAPD片段。克隆测序表明该片段全长为937bp（记为OPM2 937）。以OPM2 937的DNA序列为基础设计了一对特异引物,并用该特异引物对多年生簇毛麦、二倍体簇毛麦以及中国春-二倍体簇毛麦附加系CSDA1V～CSDA7V与小麦-多年生簇毛麦衍生后代进行了扩增,结果表明,凡具有簇毛麦染色体的材料均可扩增出目标DNA片段,而不具簇毛麦染色体的材料均未能得到扩增。将OPM29 937在NCBI中进行序列比对,发现它是一个新的序列,说明OPM2 937为簇毛麦基因组的一个特异序列,该DNA序列标记可用于快速跟踪检测小麦背景中的簇毛麦染色体。     

基于CHD基因利用PCR技术进行鸡早期性别鉴定

为建立鸡早期性别鉴定的快速方法,根据鸡CHD基因在性染色体Z和W上的序列长度差异,从鸡血样中提取基因组DNA,利用2550F/2718R和SF/SR引物分别对鸡CHD基因片段进行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。引物2550F/2718R 的PCR扩增结果显示,公鸡为1条带,约600 bp,母鸡为2条带,分别约为600 bp和450 bp;引物SF/SR PCR扩增结果显示,公鸡为1条带,约500 bp,母鸡为2条带,分别约为500 bp和350 bp;两对引物扩增的条带清晰明亮,特异性强,鉴定的