病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术及其在大豆基因功能研究和育种中的应用潜力

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是植物体抵抗病毒侵染的一种自然防御机制,近年来已发展成为一种基因功能研究的有效手段。与突变体筛选、转基因、基因敲除等技术相比,VIGS技术因具有周期短、成本低、可迅速观察表型等优点而被广泛应用于基因的功能鉴定。文章对VIGS技术的分子机理、病毒载体系统、稳定遗传VIGS植株的获得策略及其在大豆中的应用等内容进行了综述并对今后的发展趋势进行了讨论。     

病毒诱导的基因沉默在植物抗病基因功能研究中的应用

病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)是一种植物抵抗病毒侵入的自然机制,现在已被开发成通过插入目的基因片段的重组病毒来抑制植物内源基因表达的遗传技术,主要用于研究目标基因的功能。作为一种新型的基因鉴定和功能研究的技术工具,VIGS具有无需事先知道目的基因全长序列、快速获取表型、无需获得转基因植株等诸多优点,已越来越广泛地被应用于植物基因功能研究领域。本文从VIGS的作用机制、VIGS体系的优点及局限性以及VIGS在植物抗病机制方面的研究进展等几个方面对病毒诱导的基因沉默进行了综述。     

病毒诱导的全新tae-miR9663的沉默影响叶片发育和籽粒大小

MicroRNA(miRNA)是一类长度为18~24nt的非编码小分子RNA,参与植物各种发育进程。tae-miR9663是新发现的在小麦幼苗、旗叶和籽粒中高表达的miRNA,但其生物学功能未知。为了探索taemiR9663的功能,通过人工合成tae-miR9663的小串联模拟靶标(short tandem target mimic,STTM),将其构建到大麦条斑花叶病毒(barley stripe mosaic virus,BSMV)载体上,利用病毒介导的基因沉默(virus-inducing gene silencing,VIGS)技术转染小麦宁春16五叶一心期的第5片叶,转染20d后观察叶片表型并取旗叶进行实时定量PCR,成熟时观察种子大小。叶片表型观察结果表明,与BSMV:00相比,接种BSMV:STTM-taemiR9663的9株幼苗中出现4种叶片表型,即第6片叶有白点或白条纹,旗叶(第7片叶)有白点或白条纹,第6片叶边缘有锯齿状,旗叶叶尖处有皱缩。实时定量PCR分析结果表明,STTM-tae-miR9663过表达植株的tae-miR9663表达丰度下降,说明BSMV-VIGS技术可通过过表达STTM有效地沉默内源miRNA。成熟种子大小观察结果表明,与BSMV:00比较,接种BSMV:STTM-tae-miR9663的植株种子的长和宽均减小。     

油菜黑胫病抗性相关基因BnWRKY70的功能研究

WRKY转录因子是植物信号传导过程中的重要成员,在植物抗病过程中发挥着重要作用。为了解BnWRKY70在油菜黑胫病抗性反应中的作用机理,本研究对油菜响应黑胫病菌侵染产生的特异基因BnWRKY70进行序列分析;将克隆得到BnWRKY70基因CDS 308bp特异区段,利用烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus, TRV）载体构建了基于病毒诱导的油菜基因沉默体系;利用qRT-PCR验证目的基因的表达水平;最后进一步通过表型观察和病情指数统计分析评价BnWRKY70基因沉默植株在接种黑胫病菌之后油菜的抗病性。结果表明,BnWRKY70基因最长ORF为858bp,编码285个氨基酸,含有一个WRKY保守结构域,属于Ⅲ类WRKY转录因子。BnWRKY70基因沉默后的表达量显著下降,说明在油菜中成功构建了VIGS体系。表型观察发现基因沉默油菜株系叶片比未沉默株系更易感病,病斑面积更大,且病情指数显著高于对照,说明BnWRKY70基因沉默减弱了油菜的抗病性。本研究为揭示BnWRKY70在油菜病原菌分子互作机制中的作用奠定基础。     

小麦高分子量麦谷蛋白基因沉默研究进展

高分子量麦谷蛋白是小麦种子贮藏蛋白的重要组成部分,其数量和质量对小麦面筋含量及面粉烘烤品质有直接影响.因此,小麦高分子量麦谷蛋白基因的表达与沉默备受关注.本文主要介绍了高分子量麦谷蛋白基因沉默材料的发现及其沉默机理的研究现状,认为小麦高分子量麦谷蛋白基因沉默包括两种情况即在一个基因座位上所有编码基因均不表达和只有一个编码基因不表达.第一种情况可能是染色体部分缺失的结果,有时也被认为是由于调控元件发生了突变;而基因突变即DNA调控序列和/或编码区的微小缺失及其他变化则可能是第二种情况发生的机制.本文还简要介绍了离子束生物技术、转基因技术、化学诱变、组织培养等可以用于创制基因沉默材料的技术.     

转基因植物中外源基因沉默的机制与对策

转基因植物中外源基因沉默现象是利用基因工程技术进行作物品种改良的一大障碍。结合近年来国内外在转基因沉默研究方面所取得的成果,综述了转基因植物中外源基因沉默的分子机理及提高外源基因表达的方法和策略。     

RNAi研究及在植物中的应用

RNAi（RNA interference）技术可通过降解靶基因的mRNA进行基因干涉，是研究多种生物基因功能的有效手段。概述了RNAi的作用机制、特点及其植物RNAi载体的构建。同时介绍了RNAi在植物的基因功能、抗病性、雄性不育等方面的应用。     

VIGS技术在禾本科植物中的应用研究进展

病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)是一种转录后基因沉默现象.近年来在植物基因功能研究中,VIGS技术作为一种快速、高效、高通量的反向遗传学新技术发挥了重要作用.尤其在禾本科植物基因功能研究中VIGS技术得到了广泛的应用.本文阐述了VIGS技术的发现及作用机制,并重点介绍了在禾本科植物中应用的VIGS载体及功能基因组学研究的应用实例,最后探讨了VIGS技术在禾本科植物中影响沉默效率的因素、局限性及应用前景.     

RNAi研究及在植物中的应用

RNAi(RNA interference)技术可通过降解靶基因的mRNA进行基因干涉,是研究多种生物基因功能的有效手段.概述了RNAi的作用机制、特点及其植物RNAi载体的构建,同时介绍了RNAi在植物的基因功能、抗病性、雄性不育等方面的应用.     

利用VIGS技术初步验证WSR1基因功能的研究

为进一步了解小麦淀粉合成酶转录因子对淀粉合成的影响,以水稻 RSR1基因为探针,首先利用同源克隆技术和RACE技术获得了小麦 WSR1基因的全长cDNA;生物信息学分析表明,该基因含有AP2保守结构域。随后,以大麦条纹花叶病毒(BSMV)为载体,八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因为指示基因,利用VIGS技术和qRT-PCR技术对 WSR1基因的功能进行研究。结果表明,在接种5 d后, WSR1基因的相对表达量下降到50%, 25 d后下降到12%; WSR1基因沉默后的冀麦325籽粒内支链淀粉、总淀粉和抗性淀粉含量均较对照显著增加;直链淀粉含量、千粒重较对照极显著增加。以上结果表明 WSR1基因负向调控小麦的淀粉合成。     

豆科MIKC型MADS-box基因家族生物信息学分析

MIKC型MADS-box是一类生物功能丰富的转录因子家族,参与调控植物的生长发育。为深入研究豆科MIKC型MADS-box基因家族生物学特性,利用生物信息学方法在大豆和蒺藜苜蓿中分别鉴定出92和45个MIKC型基因,并将其分为15个亚类。蛋白基序分析发现,大豆与蒺藜苜蓿不同亚类的共同基序不同,基因结构发生变化;共线性分析及KS分析表明,大豆90.5%的基因对和蒺藜苜蓿87.1%的基因对产生于双子叶植物共同经历的三倍化事件之前;大豆基因表达模式分析表明,大豆幼苗期总体表达量高于其他时期,其中SVP、SOC1、AGL12亚类表达量较高;蛋白互作网络分析表明,大豆SVP蛋白与CO、FT和TFL1蛋白相互作用,一起调控植物开花发育。本研究为进一步揭示MADS-box家族基因的生物学功能奠定基础。     

木薯MeSAP13基因的克隆及其抗细菌性枯萎病功能鉴定

胁迫相关蛋白（stress-associated proteins, SAPs）在植物对胁迫应答和胁迫调控中起重要作用。木薯是我国重要的粮食作物和经济作物,细菌性枯萎病（cassava bacterial blight, CBB）已严重危害我国木薯产业的健康发展。为了探讨木薯MeSAP基因在抗细菌性枯萎病中的作用,本研究克隆了我国主栽木薯品种‘华南8号’（SC8）的MeSAP13基因,分析该基因在细菌性枯萎病病原菌侵染时的表达模式及其编码蛋白的基本特性。利用基于木薯花叶病毒介导的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS）技术抑制了MeSAP13基因在木薯SC8叶片中的表达,通过接种细菌性枯萎病病原菌XpmHN11对MeSAP13的抗病功能进行抗性鉴定。结果发现：在病原菌XpmHN11侵染叶片3 d后MeSAP13基因表达量显著上调,说明木薯MeSAP13基因能够响应病原菌的侵染;在VIGS载体转化木薯叶片40 d后发现,与转化pCsCMV-A载体的对照叶片相比,MeSAP13在转化pCsCMV-MeSAP13叶片中的表达量显著下调了40%~60%,表明通过VIGS技术成功抑制了MeSAP13在木薯叶片中的表达。将病原菌XpmHN11接种至MeSAP13基因沉默叶片和对照植株叶片,发现MeSAP13基因沉默植株接种叶片的水渍状病斑面积显著大于对照植株接种叶片。分析侵染后0、3、6 d病原菌XpmHN11的繁殖情况发现,在侵染后3 d和6 d的MeSAP13基因沉默植株接种叶片中,其病原菌数量显著高于对照植株接种叶片。以上研究结果表明,抑制MeSAP13基因的表达,降低了木薯对细菌性枯萎病的抗性。     

施用不同豆科绿肥对酸性土壤无机磷分级的动态影响

采用尼龙袋法,研究酸性土壤施用4种豆科绿肥(尖叶木蓝、铺地木蓝、扁豆与链荚豆)后,在1年内不同时间,土壤无机磷各组分含量的动态变化。结果表明:不同绿肥对于土壤无机磷影响的效果存在显著差异,但总体上施用豆科绿肥可显著降低酸性土壤无机磷的总量,对于土壤无机磷各组分,施用绿肥可显著增加土壤铁磷(Fe-P)以及铝磷(Al-P)的含量,但显著降低土壤中钙磷(Ca-P)以及闭蓄态磷(O-P)的含量;施用绿肥对于土壤无机磷的影响随施肥时间的变化而不同。     

小麦TaAAC基因克隆及功能的初步验证

为明确ATP/ADP转运蛋白在小麦籽粒粒重及淀粉合成方面的作用,以百农207 cDNA为模板,利用RT-PCR技术获得TaAAC的基因全长。生物信息学分析表明,TaAAC基因CDS长度为1 143 bp,编码380个氨基酸;TaAAC蛋白位于线粒体内膜和质体膜上。随后,以大麦条纹花叶病毒(BSMV)为载体,以GFP基因为指示基因,利用VIGS和qRT-PCR技术对TaAAC基因的功能进行研究。结果表明,在病毒诱导接种后24 d和29 d,TaAAC基因的相对表达量分别较对照下降51%和67%。BSMV病毒诱导TaAAC基因沉默后的百农207籽粒内总淀粉含量和千粒重均较对照显著降低。以上结果表明TaAAC基因正向调控小麦籽粒的淀粉合成,提高该基因表达有助于增加小麦粒重。     

间作豆类作物对玉米田中杂草防控作用的研究

采用玉米/豆科植物间作技术,通过在玉米行间撒播和条播豆类植物,研究玉米/豆科植物间作对抑制杂草生长的作用,防治玉米田杂草危害。结果表明,豆科植物通过与杂草的空间竞争,对玉米田中经常发生的杂草马唐、牛筋草、反枝苋、马齿苋等具有明显的控制效果,并对玉米有一定的增产作用。综合比较,绿豆撒播的种植方式对杂草的防控效果和对玉米的增产作用最好。