利用发根农杆菌体系检测大豆CRISPR/Cas9系统的靶点

作为一种基因编辑的新技术,CRISPR/Cas系统已被广泛应用于各种生物的基因工程中.但CRISPR/Cas9基因编辑系统还存在着一定的脱靶现象,确定基因编辑靶点选择的可行性可提高基因编辑效率.本研究选用大豆GmCO基因为靶标,使用CRISPR/Cas9基因编辑系统来构建靶点的基因敲除载体,并且利用发根农杆菌K599菌...     

高油酸低脂氧合酶(FAD-LOX)多基因编辑大豆优异种质创制

大豆是植物油和蛋白质的主要来源。不饱和脂肪酸的含量是影响植物油品质的主要因素,油酸是不饱和脂肪酸中含量最丰富的成分之一,具有较强的氧化稳定性和热稳定性。增加油酸的含量可以提高大豆油的耐储存性,也有利于人体健康。GmFAD2-1A和GmFAD2-1B是大豆编码脂肪酸去饱和酶,调控油酸向亚油酸转化的关键基因。脂氧合酶是大豆种子中的抗营养因子之一。它在酶促氧化的条件下产生豆腥味,限制了大豆产品的应用。为满足不同人群的需要和降低加工成本,有必要培育无脂氧合酶的突变品系。大豆中GmLOX基因(包括GmLOX1、GmLOX2、GmLOX3)编码脂氧合酶。脂氧酶也能催化亚油酸氧化生成脂质氢过氧化物,然后形成豆腥味。因此,降低亚油酸的含量有助于减少豆腥味的形成。同时编码脂氧酶也能延缓豆油的酸败。本研究利用CRISPR/Cas9对中吉602的GmFAD2-1A、GmFAD2-1B、GmLOX1、GmLOX2和GmLOX3基因进行编辑。通过农杆菌介导的大豆遗传转化,在T₂代分离到7个具有不同等位变异的优异新种质。与中吉602相比,突变体种子中脂氧合酶活性显著降低,油酸含量提高至81....     

大豆BBX32基因生物信息学分析及基因编辑靶点设计

BBX32基因是一种含锌指结构的转录因子,广泛的参与植物生长和发育过程,但在大豆中,BBX32基因的具体生物学功能还尚未被解析.为研究大豆BBX32基因在大豆中的分子机理和生物学功能,本研究通过同源比对分析发现,大豆中含有两个与拟南芥BBX32同源的基因,分别命名为GmBBX32a和GmBBX32b.同时,通过检索RN...     

大豆NIN和NLP基因生物信息学分析及敲除载体构建

为促进大豆NLP家族基因突变大豆材料的获得及大豆NIN和NLP基因功能的研究,本研究对大豆NIN和NLP基因进行生物信息学分析,通过CRISPR/Cas 9基因编辑技术构建基因敲除载体,并且通过大豆毛根转化实验验证靶点的有效性。结果表明：大豆基因组中一共存在4个NIN基因和10个NLP基因家族成员,这些基因都具有RWP-RK和PB1两个保守结构域。亚细胞定位预测表明所有成员都定位在细胞核中,此外GmNIN1b和GmNIN2a还定位于叶绿体。GmNIN1a/b、GmNIN2a/b、GmNLP2a/b及GmNLP3b在根瘤中的表达量相对较高,推测这些基因可能对结瘤过程具有重要的调控功能。成功构建了NLP4和NLP5两个敲除载体,得到可敲除GmNLP4a/b的3个有效靶点和敲除GmNLP5a/b的2个有效靶点。本研究获得了大豆NIN和NLP基因家族的生物信息学依据和创制GmNLP4a/b和GmNLP5a/b基因突变体的技术依据。     

OsYABBY4基因调控水稻株高的功能研究

株高是影响水稻产量、光合速率、抗倒性的重要农艺性状,赤霉素对株高形成具有重要调控作用。YABBY家族基因作为植物特有的转录因子,参与GA信号途径,调控水稻株高。通过CRISPR/Cas9技术定向突变了OsYABBY4基因,成功创制了3种不同突变类型的osyabby4突变体。表型分析发现,osyabby4突变体结实率下降,倒1和倒2节间的伸长受到抑制,导致株高显著降低。α-淀粉酶诱导及赤霉素相关基因差异表达实验表明,OsYABBY4通过参与GA信号转导调控水稻的株高。本研究为水稻理想株型育种提供了新材料,同时进一步完善了水稻株高分子调控网络。     

CRISPR/Cas9介导的多基因编辑系统在大豆中的应用

自CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)基因组编辑技术发现以来,迅速在作物中得到广泛应用.但是,CRISPR/Cas9多基因编辑系统在大豆中的研究尚待开发.本文利...     

吉林省不同年代育成大豆品种根瘤数量、 鲜重和体积的变化

对吉林省1923年以来育成的20个主要栽培大豆品种不同生育期根瘤数量、根瘤鲜重和根瘤体积的变化进行了比较研究结果表明,大豆根瘤数量、根瘤鲜重和根瘤体积在四叶期（V4）根瘤形成很少,品种间也无差异,盛花期（R2）最大,结荚期（R4）略有下降,鼓粒期（R6）期最低。R2期、R4期大豆根瘤数量、根瘤鲜重和根瘤体积与育成年代和产量呈正相关,其中R2期与育成年代和产量关系最为密切, R6期成负相关,但不显著。现代品种根瘤数量、根瘤鲜重和根瘤体积在R6期均呈下降变化,而老品种根瘤数量、根瘤鲜重和根瘤体积在R6期则表现增加的变化趋势。     

CRISPR/Cas9定点编辑水稻穗发育Osa1基因

CRISPR/Cas9是一种快速发展的基因组定点编辑技术。利用该技术对水稻穗发育基因Osa1进行定点编辑,精准敲除Osa1基因,获得Osa1功能缺失突变体,为Osa1基因功能的深入研究提供了准确可靠的突变体材料。     

大豆根瘤豆血红蛋白含量与产量关系研究

为明确大豆豆血红蛋白与产量的关系,以12个吉林省审定推广的吉农系列大豆品种为材料,在盛花期(R2)、结荚期(R4)、鼓粒期(R6)和成熟期(R8)测定根结瘤特性和根瘤中豆血红蛋白的含量测量产量,并分析不同品种根瘤数量、干重和豆血红蛋白含量变化规律及其与产量的相关关系。结果表明:吉农51、吉农39和吉农41产量处于较高水平,显著高于吉农38、吉农43和吉农45,并且在R6和R8期吉农51、吉农41和吉农39根瘤豆血红蛋白含量比其它品种高12.4%～95.7%和14.6%～88.1%。R6和R8期根瘤豆血红蛋白的含量与根瘤数量和干重呈显著正相关,且R6期相关性更大。R6和R8期根瘤干重和根瘤数量与产量均呈显著正相关,大豆根瘤豆血红蛋白含量与产量呈极显著正相关。结果说明豆血红蛋白与产量的关系密切,豆血红蛋白含量可以作为筛选高固氮结瘤能力大豆品种的指标。     

基因驱动技术研究进展及风险管控

基因驱动是指特定基因有偏向性地遗传给下一代的自然现象,近年来成为生物学研究热点,用来防治害虫、控制传染病、清除物种入侵等.实验室已经证实,基于CRISPR/Cas9基因编辑系统的基因驱动技术可提高特定基因的遗传率.虽然基因驱动技术有非常多的潜在益处,但在伦理和社会安全方面也面临巨大挑战.本文综述了基因驱动的原理及类型,...     

CRISPR/Cas9编辑芥菜型多心皮油菜BjROP10基因的研究

油菜多心皮性状可显著增加油菜的每角果粒数,在油菜高产育种中有潜在的应用价值。前期研究发现,芥菜型多心皮油菜 J163-4 可形成稳定的四心皮性状,且小 G 蛋白基因 BjROP10 可能参与调控其多心皮的形成,但其分子机制尚不明确。本研究利用 CRISPR/Cas9技术,构建了BjROP10的双靶点载体,并遗传转化芥菜型多心皮油菜 J163-4。在 T₀代,通过筛选鉴定获得了 20 株阳性苗,其中 13 株心皮数目发生改变。通过测序分析了 7株心皮数发生变化的转基因阳性植株的 BjROP10 序列突变情况,结果显示其目标基因序列发生变异,导致无法编码形成正常的 BjROP10 蛋白。本研究对进一步解析 BjROP10 基因响应 CLV 信号调控油菜心皮数发育的功能提供了材料基础,也为研究油菜多心皮性状发育的分子机制奠定理论基础。     

Progress of CRISPR/Cas9 technology in breeding of Brassica napus

Gene editing technology provides important technical basics for the research in plant functional genes and crop genetic improvement. CRISPR/Cas9-mediated gene editing is an effective experimental tool for crop genome directed editing in recent years, which has been widely used in many crops as rice, wheat and other crops. CRISPR/Cas9 system was expected to be a powerful experimental tool in genetic improvement and molecular design breeding of rapeseed. This paper, which based on the development history and the latest research of CRISPR/Cas9-mediated gene editing technology in rapeseed, summarized the progress of CRISPR/Cas9 including plant type improvement, yield traits, quality improvement, disease and stress resistance improvement, yellow seed creation and other utilizes at present. The application scope, development direction and target analysis method of this technology in rape were focused. The problems of CRISPR/cas9 system in rapeseed breeding were analyzed and the improvement strategies were discussed. Finally, views on direction of rapeseed breeding by gene editing were emphasized.     

水稻抽穗期基因OsDof6功能的初步研究

【目的】以前期通过穗发育芯片筛选到一个水稻Dof家族转录因子OsDof6为研究对象,进一步探究OsDof6的表达模式与生物学功能。【方法】对OsDof6的基因、蛋白及启动子序列进行生物信息学分析,利用CRISPR/Cas9技术对该基因进行定点编辑,通过实时定量PCR和亚细胞定位技术分析该基因的表达模式。【结果】对该基因的启动子序列分析表明,该基因启动子中存在大量与光响应、激素响应及胁迫响应相关的顺式调控元件。利用CRISPR/Cas9技术获得了2种不同突变类型的功能缺失突变体9522^Dof6-3和9522^Dof6-4。对突变体T₁株系进行表型观察发现,相较于对照,两种突变体在营养生长阶段分蘖数明显降低,转入生殖生长阶段后,两种突变体的抽穗时间推迟约3 d。实时定量PCR结果显示OsDof6在水稻根、茎、叶和穗中均有不同程度的表达,在穗发育后期相对表达量明显提高;通过亚细胞定位分析发现OsDof6定位于细胞核。【结论】初步判断OsDof6基因会影响水稻分蘖数与抽穗期。     

利用 CRISPR/Cas9 系统编辑拟南芥 2 个双链结合蛋白

CRSPR/Cas9 系统可对植物的内源基因进行有效定点编辑,为获得基因缺失突变体提供了新的方向。本研究在双链结合蛋白（dsRNA-binding protein,DRB）DRB3 和 DRB5 两个基因外显子的保守序列设计 2 个靶点,并构建与 tRNA 串联的双靶点 CRISPR/Cas9 表达载体。通过一次转化,获得了 DRB3 或 DRB5 单独被编辑或同时被编辑的拟南芥突变体 dcl2drb4 转基因 T1 代植株,为研究 DRB3、DRB5 是否参与 DCL4 介导的抗病毒 RNA 沉默通路奠定基础。     

利用CRISPR/Cas9系统定向编辑水稻SD1基因

【目的】半矮秆水稻品种的选育和应用是水稻育种的最重大成果之一。半矮秆品种大多是半矮秆基因SD1(semi-dwarf1)功能缺失突变体,为了获得sd1突变体,本研究对SD1基因进行了定向编辑。【方法】利用CRISPR/Cas9系统,以SD1基因为靶基因,构建基因编辑载体CRISPR-SD1,用农杆菌介导的方法转化水稻恢复系申繁17和申繁24。【结果】在2个转化受体的T₀代均获得了纯合的sd1突变体,并且在T₁代株系中分离出了不含转基因序列的植株。2个品种的sd1突变体与各自的野生型相比,株高分别下降了25%左右。【结论】利用CRISPR/Cas9系统可以有效地对目的基因进行编辑,在水稻分子育种领域具有巨大的应用价值。     

利用CRISPR/Cas9创建osarf7突变体及其农艺性状调查

[目的]探究OsARF7基因在水稻生长发育中的生物学功能及其对水稻农艺性状的影响.[方法]利用CRISPR/Cas9技术,在粳稻中花11背景下对OsARF7进行定向编辑,获得OsARF7基因突变植株,并考查其农艺性状.[结果]获得22株T0代转基因株系,经PCR扩增潮霉素基因鉴定出20株阳性植株.提取T2代转基因植株的...