马银花愈伤组织RoWUS基因及其启动子的克隆与表达分析

WUSCHEL(WUS)基因是植物干细胞的标志基因。采用同源克隆法结合RACE技术从马银花愈伤组织中克隆得到Ro WUS c DNA全长序列,采用染色体步移法克隆得到该基因的启动子序列,登录号分别为KF365488、KF861578。马银花Ro WUS c DNA全长1 123 bp,编码302个氨基酸;DNA序列2 001 bp,包含2个内含子和3个外显子;启动子序列3 122 bp。生物信息学分析表明:Ro WUS亚细胞定位于细胞核,是不稳定的亲水蛋白,无信号肽,具有跨膜结构,包含homeodomain功能位点。系统进化树分析结果表明:Ro WUS单独形成一个分支,与葡萄、大豆和苜蓿的亲缘关系最近。对Ro WUS的启动子进行分析表明,该启动子除了含有丰富的TATA-box和CAAT-box等基本元件以外,还含有多个光响应元件、逆境胁迫响应元件、激素应答元件和其他功能元件。q PCR结果表明:Ro WUS基因在马银花愈伤组织不同生长时期中呈先上升后下降的趋势,在第5个继代周期时表达量最高。外源赤霉素和脱落酸浓度为15 mg/L时表达量最高,说明Ro WUS基因在该浓度时对赤霉素和脱落酸的响应最强。     

大豆线粒体细胞色素b基因的克隆及系统分析

根据实验室测序的大豆线粒体基因组片段设计线粒体细胞色素b(Cytochrome,cob)基因特异引物,PCR扩增获得1173 bp大豆(JLGM-1B)线粒体cob基因保守区序列.经序列分析,该基因编码391个氨基酸,A+T含量58.1％,G+C含量41.9％.Southern杂交表明cob基因在栽培大豆线粒体基因组中...     

大豆基因组GmGAI同源基因的生物信息学分析

利用Phytozome数据库、NCBI站和MEGA4.0、ClustalX软件对大豆(Glycine max)基因组中GAI(GA insensitive)同源基因进行生物信息学分析,发现大豆GAI基因有7个拷贝,都不含有内含子,分别分布于第4、5、6、8、10、11和18号染色体上,它们都属于GRAS家族,都存在DELLA (34-106)和GRAS(158-513)2个结构域.氨基酸序列比对和系统进化树分析表明,大豆GAI的7个拷贝进化距离并不是最近的,而是分别有与之最近的其他物种,推测大豆GAI的7个拷贝在进化的过程中功能上发生了一些变化,对植物的生长发育可能会产生不同的影响.     

大豆JAZ基因家族的鉴定及其对疫霉胁迫的响应

JAZ(Jasmonate ZIM-domain)蛋白是茉莉酸信号途径中重要的负调控因子,对植物的防御反应具有重要意义。然而,鲜有关于大豆JAZ基因的报道,为了揭示大豆中JAZ基因家族的特征和潜在功能,本研究利用生物信息学方法从大豆基因组中鉴定到24个JAZ基因,分别命名为GmJAZ1～GmJAZ24,并对这24个基因进行基因结构分析、保守基序分析、系统进化树构建、染色体定位、启动子顺式作用元件分析以及大豆疫霉菌胁迫下的响应分析。结果表明:(1)24个GmJAZs基因不均匀的分布在大豆的14条染色体上,其中9号染色体上分布的数目最多,为4个;(2)大豆、拟南芥和水稻的JAZ基因家族可分成5个亚组(C1～C5),其中大豆与拟南芥的JAZ基因亲缘关系最近;(3)该家族成员大多含有响应茉莉酸和脱落酸等激素的顺式作用元件,少数含有响应逆境胁迫的顺式作用元件;(4)大豆疫霉菌处理后,C4亚组成员显著上调表达,C1亚组成员微弱上调,而C2、C3和C5亚组成员下调表达,表明大豆JAZ基因家族成员对大豆疫霉菌的胁迫具有不同的响应模式。     

大豆耐胁迫相关蛋白编码基因GmSAMDC1的克隆及表达分析

S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosine methionine decarboxylase,SAMDC)是亚精胺和精胺合成的关键酶,更是多胺生物合成的限速酶之一,在植物耐胁迫反应中发挥重要调控作用。为研究大豆SAMDC编码基因的结构和表达特性,本研究从抗病大豆品种科丰1号中克隆了位于大豆基因组2号染色体上的GmSAMDC1(Glyma. 02G128000)基因,分析结果表明:其完整ORF长度为1 068 bp,编码一个由355个氨基酸组成的包含1个SAM_decarbox结构域的蛋白; GmSAMDC1基因所编码蛋白的理论等电点为4. 86,相对分子质量为38 987. 13 Da,为亲水性蛋白,不含跨膜区;大豆中共有8个GmSAMDC1的同源基因,GmSAMDC1与红车轴草(PNY09439. 1,82. 64%)和拟南芥(At SAMDC3,67. 22%)中的SAMDC蛋白编码基因亲缘关系最近; GmSAMDC1启动子序列包含防卫和胁迫响应元件、植物激素应答元件、光应答元件等许多顺式作用元件; GmSAMDC1在花中的表达量最高,与其大豆同源基因Glyma. 01G071300(序列相似性为94. 6%)、Glyma. 18G278800(66. 8%)和Glyma. 08G25580(66. 5%)的组织特异性表达模式比较相似; Glyma. 02G128000-GFP融合蛋白在细胞膜和细胞质上表达。本研究结果为进一步阐明大豆GmSAMDC1基因在大豆耐胁迫过程中的作用提供了理论依据。     

大豆DNA甲基化酶生物信息学分析

植物DNA甲基化酶对建立与维持基因组甲基化,调控基因表达,确保植物快速应对多种逆境具有重要作用。本研究利用多种生物信息学网站和软件初步明确了大豆中四类DNA甲基化酶蛋白及相应基因序列,并分析了进化关系和基因拷贝数,确定了基因在染色体上的物理位置及酶蛋白的理化性质与亚细胞定位,同时揭示了大豆DNA甲基化酶蛋白的结构域和组织表达部位特异性。这些研究结果对全面认知大豆DNA甲基化酶蛋白的特征以及从遗传学上对其展开深入研究和剖析具有重要的理论指导作用。       

广谱抗病基因chi和hrpZpsta双价表达载体的构建及其在大豆中的遗传转化

大豆的真菌性病害已经成为了限制大豆产量增长及品质提高的主要原因,利用基因工程技术培育出具有广谱性抗病能力的大豆新品种,已成为目前提高大豆抗性的有效途径之一。本研究构建了含2种广谱抗病基因chi和hrp Zpsta的双价植物表达载体,利用农杆菌介导技术导入大豆中,获得了能够在转录水平上表达2种外源抗病性基因的转基因大豆。对经抗性筛选得到的阳性苗及后代植株进行PCR检测、Southern杂交、荧光定量PCR检测,共得到T0代阳性植株7株,T1代阳性植株27株。转化植株的基因组在整合外源基因时出现不同情况,chi-hrp Zpsta双价载体分别以单价和双价两种形式随机整合到受体大豆基因组中并且能稳定遗传,同时在转录水平上亦有不同。     

HSSP基因植物表达载体构建及其对大豆的遗传转化

大豆中含硫氨基酸匮乏,限制了大豆的营养价值和商业价值。为了提高大豆的含硫氨基酸含量,利用人工设计合成的高含硫氨基酸贮藏蛋白基因(HSSP)转化大豆。以载体p TF101.1为骨架,构建植物表达载体p TFGS,利用农杆菌介导法转化大豆品种东农50,经PCR及试纸条检测,获得转基因大豆16株,基因的转化效率为1.94%。对转基因大豆株系GSDL5进行组织特异性分析,结果表明,HSSP基因在种子中超量表达,而在其它组织部位仅有微量表达。采用接头PCR方法对株系GSDL5基因组插入位点侧翼序列进行克隆,获得与大豆基因组序列匹配的436 bp侧翼序列,HSSP基因插入2号染色体基因的非编码区。经研究,获得了遗传背景明确的,仅在大豆种子中超量表达HSSP的转基因株系GSDL5。     

转HAL1基因大豆侧翼序列分析及特异性检测方法研究

为方便HAL1转基因大豆的研究和检测,以转HAL1基因大豆T3代基因组DNA为模板,使用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法分离其外源基因插入位点的侧翼序列,获得了插入片段DNA序列(T-DNA)的左翼序列和右翼序列。通过比对大豆基因组序列确定其整合位点,确定了HAL1基因的T-DNA在大豆基因组1号染色体非编码区49468395位点以单拷贝插入,转基因事件不影响大豆基因组功能基因的正常表达,而且在200 mmol·L~(-1)NaCl盐胁迫下转基因植株生长力明显强于对照材料。蛋白定量检测结果表明,在叶片中蛋白含量最高可达0.03 mg·g~(-1),在根茎花中也有表达,但是含量较低。根据整合位点处的左右侧翼序列设计两对特异性PCR检测引物,PCR检测结果显示只有转HAL1基因大豆阳性材料才能扩增出926和816 bp DNA片段。本研究建立的转HAL1基因大豆特异性定性检测方法,对转基因大豆的研究具有重要的意义,也为大豆转基因受体材料的管理与检测提供参考。     

农杆菌介导大豆遗传转化研究进展及转基因作物现状

利用转基因技术将目的基因导人植物受体细胞,使目的基因在植物受体中表达,从而获得优良性状的植株,达到快速培育植物新品种的目的.将植物基因工程技术与常规育种技术相结合,在培育优质、高产和抗逆植物新品种中具有巨大潜力.目前,在各种转基因物种中,大豆仍是难转化的作物之一,建立有效的转化系统是改良大豆品质性状和研究大豆功能基因的先决条件.综述农杆菌介导大豆遗传转化分子机理,影响大豆遗传转化因素,提高大豆转化效率的最新研究进展及转基冈大豆生产现状.     

黄曲霉毒素阻控与花生超级结瘤耦合效应研究初报

花生、大豆是我国重要的油料和经济作物,因易受黄曲霉毒素污染,严重威胁食品安全,制约产业发展,因此,黄曲霉毒素防控一直是国内外研究的热点难题。本团队首次提出将黄曲霉毒素绿色阻控与促进根瘤固氮耦合的研究思路,研发了生物菌剂ARC-BBBE,本文报道生物菌剂ARC-BBBE对黄曲霉毒素及其产毒菌阻控的大田应用效果,调查其对花生生物学性状及经济性状的影响,探索ARC-BBBE对花生、大豆根系结瘤及根瘤固氮的影响,为从田间源头阻控黄曲霉毒素及促进根瘤固氮、实现减肥减药提供理论依据和科学指导。连续2年在我国花生主产省开展田间防控试验,将绿色阻控生物菌剂ARC-BBBE于花生播种期以30 kg/hm²用量与基肥一起撒施于土壤中。同时开展室内花生、大豆盆栽试验。使用涂布法调查土壤中黄曲霉毒素产毒菌丰度,使用高效液相色谱法检测花生样品中黄曲霉毒素,使用乙炔还原法测定根瘤固氮活性,采用5点取样法调查统计根瘤数、根瘤重。结果表明,应用ARC-BBBE显著降低了土壤中黄曲霉毒素产毒菌的丰度（平均降低66.5%）和花生中黄曲霉毒素的含量（平均降低83.5%）。应用ARC-BBBE后,花生根系普遍出现超级结瘤现象,实验验证表明其根瘤具有固氮活性,平均结瘤数增加10倍以上（土壤贫瘠地区50倍以上）,瘤重增加8.8倍,每克根瘤固氮酶活性提高5倍以上。饱果率、产量均明显提高,叶色浓绿。花生室内盆栽结果表明,ARC-BBBE处理组根系结瘤数是对照组的2.2倍,固氮酶活性是对照组的4倍,叶绿素含量较对照组增加21.3%。大豆室内盆栽苗期实验结果表明,ARC-BBBE同样可诱发大豆结瘤及固氮效应：播种后第26天,处理组瘤数增加13.5倍、瘤重增加19.8倍;而且处理组有固氮活性,而对照组无固氮活性;苗期处理组的根长、根重、鲜重、叶绿素等生物学指标显著提升。ARC-BBBE对花生黄曲霉毒素及其产毒菌污染阻控效果极为明显,既可从生产源头有效阻控花生黄曲霉毒素产毒菌,降低黄曲霉毒素污染风险,同时大幅增加了花生根瘤数量和固氮酶活性,具有显著的促生长、增产量、控病害、保安全作用,具有显著的经济、社会、生态效益。对未来减施农药、化肥,保护农田生态,推动花生、大豆产业高质量绿色发展具有重要意义,在花生、大豆等豆科作物生产中应用前景广阔。     

不同大豆品种田间结瘤固氮有效性的评价

利用相关和通径分析对田间种植的４０份大豆品种（系）的结瘤固氮性状（结瘤分级，有效瘤数，有效瘤干重，有效结瘤指数，植株干重和植株全氮含量）的研究表明：有效瘤数，有效瘤重和有效结瘤指数可以有效地作为对大豆固氮种质的评价指标，其相对重要性为有效瘤重＞有效瘤数＞有效结瘤指数。在此基础上并结合籽粒产量因子筛选出２份结瘤固氮及产量较高的种质。研究同时也获得了七份在有效瘤重与有效瘤数或有效瘤重与效结瘤指数上表现     

基于CRISPR-Cas9基因编辑技术创制大豆gmnark超结瘤突变体

为研究豆科作物结瘤自我调节机制(autoregulation of nodulation, AON)的作用机理,运用CRISPR-Cas9基因编辑技术创制大豆品种华春6号超结瘤gmnark突变体,设计3条靶向目的基因GmNARK的特异sgRNA,构建CRISPR-Cas9敲除载体。通过毛根转化试验选取sgRNA-B和sgRNA-C两条编辑效率较高的sgRNA用于大豆稳定转化,在T1代筛选出8种不同突变类型的突变体,在T2代通过营养液水培试验证明其中5种突变体有超结瘤的表型。选取gmnark-A突变体作进一步表型分析,发现其具有超结瘤、植株矮小和叶片深绿的表型。本研究所创制的gmnark突变体是研究AON途径作用机制与根瘤发育的重要遗传材料,同时此新种质资源具有作为"绿肥"与其它作物进行间作或轮作的巨大潜力。     

大豆根瘤菌HH103ΩNopAAΩNopD双突变体构建及结瘤能力鉴定

大豆—根瘤菌的共生模式为大豆提供了丰富的氮源。根瘤菌Ⅲ型效应因子是影响共生结瘤的关键信号分子之一,通过对HH103ΩNopAA与HH103ΩNopD的结瘤鉴定表明两个突变体对绥农14和ZYD00006的宿主亲和性不同,而后通过三亲杂交方法在HH103ΩNopAA基础上构建HH103ΩNopAAΩNopD的双突变体。利用绥农14与野生豆ZYD00006对突变体进行结瘤鉴定,HH103ΩNopAAΩNopD的根瘤数与根瘤重与HH103ΩNopAA无显著性差异。而后利用前期收集的100份大豆资源进行结瘤鉴定,分析NopAA与NopD的突变在不同遗传背景下的大豆品种的结瘤特性,绝大多数品种根瘤数明显减少,部分品种根瘤数在接种单突变体与双突变体存在显著差异。该研究为后续解析NopAA与NopD的共生信号传导以及根瘤菌与大豆品种亲和性提供新的思路。同时可以根据基因型的差异,筛选与不同根瘤菌均有较高亲和性的大豆品种,为进一步培育高结瘤、高固氮的大豆品种提供支撑。     

根瘤菌和复合促生菌对大豆结瘤和生长的影响

为了研究不同根瘤菌和复合促生菌单独使用及复合后对大豆结瘤和生长的影响。采用大豆单独接种2种快生大豆根瘤菌、2种慢生大豆根瘤菌及根瘤菌分别与复合促生菌交叉接种,再种植的方法,观察大豆结瘤与生长情况。结果表明:(1)大豆结荚初期大豆快生和慢生根瘤菌处理的大豆地上部鲜重、地下部鲜重、结荚数、豆荚鲜重等生物学性状显著优于其它处理;快生根瘤菌处理的大豆结瘤率显著高于其它处理,慢生根瘤菌处理的总根瘤数和根瘤重量显著高于其它处理;(2)大豆结荚后期,对照处理的地上部鲜重、根鲜重显著高于其它处理,慢生根瘤菌和复合促生菌处理的根瘤数显著高于其它处理,快生根瘤菌剂处理的大豆粗蛋白含量显著高于其它处理,而复合促生菌处理的大豆产量显著高于其它处理。虽然快生根瘤菌两处理有利于地上部、地下部、有效根瘤数、土壤碱解氮的提升,但复合促生菌处理的大豆产量、土壤速效磷和土壤有效钾都显著高于其它处理,因此表明复合促生菌处理能增加大豆产量。     

澳洲坚果实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选

澳洲坚果是重要的热区经济作物,目前国内外尚无关于澳洲坚果实时荧光定量PCR分析内参基因的报道。选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析准确性的先决条件。为筛选澳洲坚果实时定量PCR最适内参基因,以澳洲坚果的根、茎、叶、果皮、果仁为材料,利用实时荧光定量PCR技术,对18S rRNA,Actin,CYP,EF1a,EF1b,GAPDH,MDH,TUBa,TUBb,UBQ,UBC等11个常用的内参基因在澳洲坚果不同组织中的表达稳定性进行了分析。geNorm软件分析的最适内参基因数目为2,最稳定内参组合为MDH和EF1b,TUBa基因的稳定性最差。BestKeeper分析结果认为,MDH基因表达最稳定,EF1b次之,与geNorm结果一致。NormFinder软件稳定性分析显示,GAPDH最稳定,其次是CYP基因;TUBa基因表达最不稳定。ΔCt算法结果表明,18S基因表达最稳定,其次是GAPDH基因,MDH和EF1b排第3和第4。RefFinder综合排序为：MDH>18S>GADPH>EF1b>CYP>UBC>EF1a>Actin>TUBb>UBQ> TUBa。因此,MDH基因在澳洲坚果不同组织中表达最稳定,初步确认可以作为实时荧光定量PCR分析的校正内参基因,在澳洲坚果的基因表达模式分析中具有重要意义。     

大豆DELLA基因家族鉴定及分析

DELLA基因家族是调控植物与环境互作和植物发育的重要调控因子,可以促进微生物与植物共生关系建立过程中侵染线的形成,是参与赤霉素信号通路的负调控蛋白,在影响植物激素相关基因表达,调节植物与微生物共生固氮和生长发育方面具有重要的作用,但是在大豆中DELLA基因家族的结构特征还没有详细分析。本研究对大豆中DELLA基因家族的基因结构、定位信息、蛋白结构、保守基序分析、系统进化树、顺势作用元件、与拟南芥同源基因的共线性关系和基因表达模式进行了研究。结果发现,大豆基因组中共有7个DELLA基因家族成员,分布在7条不同的染色体上,这些基因都只有一个外显子,一个N端DELLA结构域,并且基序分布相似,证明其基因编码序列结构域高度保守。系统进化树分析表明DELLA家族有三个亚族,其启动子区域含有大量的顺式作用元件,这些元件参与植物激素反应、干旱诱导和光反应。大豆DELLA基因Glyma.11G216500、Glyma.18G040000、Glyma.08G095800和Glyma.05G140400与拟南芥中的AT1G14920、AT1G66350和AT2G01570呈共线性关系;其中Glyma.1...     

Continuous Application of Biochar Inoculated with Root Nodule Bacteria to Subsoil Enhances Yield of Soybean by the Nodulation Control using Crack Fertilization Technique

Abstract

Crack fertilization is a soybean cultivation technique for nodulation control in which midterm subsoiling is used to supply fertilizing materials to deep soil just before the flowering stage. This study examined the effects of fertilizing materials and the continuous application of nodulation control, on soybean yield enhancement in two field experiments. The survival of nodule bacteria in deep soil was also evaluated by a bioassay of nodule bacteria in a root box. When the nodule bacteria on biochar were continuously applied without any other chemical fertilizers for three successive years, seed weight was significantly heavier being up to 1.34 times that of the control. The application of nodulation control in the previous year but not in the experimental year did not have residual effects on seed weight. The enhancement of seed weight in a farm field converted from a paddy was much lower. This may be partly attributed to the midterm tillage practice, whichdestroys the crack structure after the nodulation control, together with soil water status and cultivar differences. Nodule growth and nitrogen fixation activities significantly increased in the soybean plants grown on the soil collected from the subsoil to which nodule bacteria on biochar had been applied the previous year. This suggests that nodule bacteria in the subsoil survived in the biochar habitat for at least a year after application. These results indicate that nodulation control by the crack fertilization technique leads to yield enhancement when nodule bacteria on biochar are continuously applied.     

高粱高效Ubiquitin启动子的克隆及活性鉴定

在转基因植物的研究中，启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一。植物泛素（ubiquitin）基因启动子以启动效率高、甲基化程度相对较低、遗传性状稳定等特点成为单子叶植物中应用较为广泛的启动子。其中，玉米的Ubi-1是最常使用的Ubiquitin启动子之一。本研究旨在克隆高粱高效Ubiquitin启动子，为高粱及其他单子叶植物的遗传转化研究提供新的组成型启动子选择。本研究从NCBI数据库中查找到多个polyubiquitin基因，下载其起始密码子上游3000 bp的序列。根据Ubiquitin启动子的特点，选择含有5′ UTR内含子且大小合适的序列，并通过在线启动子预测网站进行启动子分析，最后选择2个基因（LOC8076096、LOC8063786）进行启动子克隆，将其启动子序列分别命名为U1和U5。将这2个启动子片段PCR扩增后，连入含有GUS报告基因的植物表达载体Ubi-GUS，得到重组表达载体U1-GUS和U5-GUS。重组载体通过农杆菌介导法转化水稻和狗尾草，PCR筛选阳性转化苗，对阳性转化苗进行GUS染色分析，鉴定U1和U5的启动子活性。GUS染色观察发现，所有以U1和U5为启动子的水稻和狗尾草阳性转化苗的根、茎和叶均呈现较深的蓝色，比以玉米Ubi-1为启动子的阳性转化苗的蓝色略深，且以U5为启动子的阳性转化苗比以U1为启动子的蓝色更深，而非转基因的水稻和狗尾草小苗则完全染不上蓝色。因此，启动子U1和U5在水稻和狗尾草中均具有组成型强启动子的活性，可作为新的组成型启动子应用于高粱、水稻、狗尾草及其他单子叶植物的遗传转化研究。     

大豆不同生长阶段施用氮肥对生长,结瘤及产量的影响

以两种不同基因型的大豆品种为试材，研究不同阶段施用氮肥对大豆结瘤、生长及产量的影响。每公顷仅施２５ｋｇ的启动氮，两个大豆品种虽获得较高的根瘤干重，但仅靠其自身固氮功能，不能满足大豆生长及丰产的要求。在大豆开花期（Ｒ１）或种子形成始期（Ｒ５），每公顷再追施５０ｋｇ氮肥，两个大豆品种都获得了最高的干物质重和产量。在播种前或开花前期，施用过多的氮肥，严重抑制了两个大豆品种根瘤的生长，降低了其自身的生物固