羊驼Bclaf1基因cDNA部分序列的克隆及组织表达特征分析

为了获得羊驼Bclaf1基因cDNA序列,研究该基因在羊驼皮肤中的表达特征.本研究对已构建的羊驼皮肤cDNA文库进行筛选和ESTs分析,并运用免疫组化技术对Bclaf1在羊驼皮肤中的表达进行组织定位.结果,羊驼Bclaf1基因与褐鼠、小鼠、狗、人和黑猩猩Bclaf1基因相应cDNA序列的相似性分别为100%,92.9%、86.0%、81.1%和77.9%.Bclaf1在幼年羊驼毛囊中没有阳性细胞,在成年羊驼、白色和棕色羊驼毛囊的外根鞘处集中表达;根据光密度值分析得Belaf1在不同毛色羊驼毛囊中的表达差异显著.结果表明,Betaf1基因在羊驼皮肤中的表达和定位随年龄和毛色而变化.     

利用SMART技术构建羊驼皮肤全长cDNA文库

为了快速、经济和有效地寻找新基因,利用大规模测序及分析技术构建羊驼皮肤组织的基因表达谱,实验构建了羊驼皮肤cDNA文库。Trizol提取皮肤总RNA后,用SMART法构建文库：经反转录反应合成第一链eDNA,用LDPCR法将第一链产物再合成第二链和双链cDNA;经蛋白酶K和Sfi消化后,用CHROM AAPIN-400分离双链cDNA;将合适大小的ds cDNA通过16℃过夜孵育使其转入到载体中,将重组产物在22℃下用λ-phage孵育2h进行包装,制成文库。该cDNA文库的特征为：包装效率为10^6（pfu／mL）,重组率在80％以上。该cDNA文库质量可达到进行后续研究的要求。     

一个山羊Ⅰ型毛角蛋白基因的序列及其在皮肤中的表达

角蛋白家族包含表皮软角蛋白和毛发硬角蛋白，可以分为酸性Ⅰ型和碱性或中性的Ⅱ型角蛋白亚家族。从构建的成年山羊皮肤cDNA文库和ESTs分析中发现了和与绵羊羊毛角蛋白8C1和人Ⅰ型毛发角蛋白相应cDNA序列高度同源的序列，经序列分析证明是一个山羊毛发特异性角蛋白，命名为山羊Ⅰ型毛角蛋白1（gHa1），Gen Bank序列号为AY510110．1。推导的读码框ORF由413氨基酸组成，与绵羊8C1角蛋白的序列一致性为97．8％。原位杂交显示它在皮肤初级和次级毛囊的皮质层有强烈的表达。     

KAP7-1基因在内蒙古白绒山羊皮肤中的表达

角蛋白关联蛋白是羊绒主要的结构蛋白之一,依据氨基酸的成分,基本上可分为超高硫、高硫和富含甘氨酸/酪氨酸三种角蛋白家族.从构建的成年山羊皮肤cDNA文库和ESTs分析中发现了与绵羊KAP7-1cDNA高度同源的gKAP7-1cDNA,在核苷酸水平的同源性达到96.8%,编码85个氨基酸,甘氨酸和酪氨酸的含量为30.12%.在GeneBank中的注册号是AY510121.1,有3个拷贝数.原位杂交显示它在皮肤初级毛囊的皮质层、表皮层和次级毛囊的皮质层有强烈的表达.     

羊驼细胞色素C氧化酶VIc亚基基因序列的测定与分析

本研究通过克隆分析羊驼细胞色素c氧化酶VIc亚基基因的序列,对羊驼细胞色素c氧化酶的VIc亚基基因的结构和功能进行了初步探索。实验利用免疫印迹技术（Southern blotting）对已有羊驼皮肤cDNA文库进行筛选并测序,结果表明该基因大小为424bp,含一个完整的ORF,位于36～266bp,编码77个氨基酸。对该基因序列分析表明：该基因编码的蛋白质含有疏水性区域、一个跨膜区并具有信号肽。同源性分析表明,核苷酸序列同源性为76％～100％。     

Agouti在不同颜色被毛羊驼皮肤组织中的表达

哺乳动物毛色是一个多基因控制的性状,Agouti是研究哺乳动物毛色发生的一个主要的候选基因。为研究Agouti基因在羊驼毛色发生过程中是否表达及其作用机理如何,本研究分别采用半定量RT-PCR技术和免疫组化技术对白色和棕色被毛成年羊驼皮肤组织进行研究。半定量RT-PCR显示,Agouti基因在白毛羊驼皮肤组织中高量表达,而在棕色毛羊驼皮肤组织中表达量较低;免疫组织化学显示,棕色被毛羊驼皮肤组织毛囊外结缔组织中有少量的Agouti阳性着色,白色羊驼毛囊内根鞘有大量的Agouti阳性着色,且形成了集中的Agouti特异性阳性着色圈。研究结果说明:Agouti基因在不同被毛羊驼皮肤组织中均有表达,在白色被毛羊驼真皮毛乳头表达的Agouti基因可能与白色被毛发生相关。     

绵羊毛角蛋白Ⅱ型中间丝9基因的扩增及表达

本试验旨在构建绵羊毛角蛋白Ⅱ型中间丝9(keratin type Ⅱ intermediate filament 9,KIF Ⅱ-9)基因cDNA的毛囊特异性表达载体,转染辽宁绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达外源基因并可用于核移植的转基因细胞克隆。通过PCR扩增得到的KAP6-1基因启动子,然后与RT-PCR扩增得到的KIFⅡ-9 cDNA 序列连接构成皮肤特异性表达载体pcDNA3.1-KK,将重组表达载体以脂质体介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得转基因细胞克隆,结果显示,外源KAP6-1启动子序列和KIF Ⅱ-9 cDNA整合到细胞基因组中,为下一步通过核移植方法获得转基因绒山羊提供了条件。     

羊驼MC1R基因克隆及其在不同毛色个体中表达水平研究

为了获取羊驼MC1R基因序列,探索MC1R基因表达水平与羊驼毛色之间的相关性,根据GenBank已发表序列(EU1358800)设计1对引物,以羊驼皮肤总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增并成功获得了中华白色羊驼MC1R基因cDNA序列,长度为1 081 bp,编码317个氨基酸,与已发表序列进行对比,同源性为99%,发现7处突变.根据所克隆序列设计引物,采用实时荧光定量PCR技术(QRT-PCR),分析MC1R基因在白色和棕色羊驼皮肤中的基因表达量,并对结果进行统计分析.结果表明:经过内参基因校正后,棕色羊驼皮肤中MC1R基因的相对表达量是白色羊驼相对表达量的4.32倍(P<0.01).MC1R基因表达量的差异与羊驼毛色表型之间可能存在一定的相关性.     

角蛋白家族基因及其与动物毛发性状关系的研究进展

角蛋白基因家族由众多结构和功能相似的基因组成,分为角蛋白中间丝蛋白(KIF)和角蛋白关联蛋白(KAP)2个基因家族.角蛋白是动物毛发的结构蛋白,决定毛发纤维的基本特征,是在寻找控制毛皮性状主效基因时的首选候选基因.角蛋白基因的表达与遗传多样性有关,角蛋白的多态性与毛皮动物的毛发性状具有相关性.本文从角蛋白基因的结构与定...     

β-catenin在不同毛色羊驼皮肤中的表达和定位

旨在研究β-catenin在不同毛色羊驼皮肤中的表达和定位,探索其与毛色的关系。以成年白色和棕色羊驼为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术、Western blot和免疫组织化学技术,对β-catenin在白色和棕色羊驼皮肤中mRNA、蛋白表达水平和定位进行研究。实时荧光定量PCR结果显示,β-catenin在棕色羊驼皮肤组织中的相对基因表达量是白色羊驼皮肤组织的1.662倍;Western blot结果显示,羊驼皮肤组织粗蛋白提取物中存在分子量约85 ku与兔抗β-catenin多克隆抗体发生免疫阳性反应的蛋白条带,棕色羊驼平均蛋白表达量显著高于白色羊驼;免疫组织化学结果显示,β-catenin在羊驼皮肤的表皮、毛乳头、毛根鞘和皮脂腺中表达,根据光密度值得出,除皮脂腺之外,在表皮、毛乳头和毛根鞘的表达差异极显著(P0.01)。结果提示β-catenin在白色和棕色羊驼皮肤组织中定位以及表达的差异,表明β-catenin参与毛色形成。     

Wnt3a在不同毛色羊驼皮肤中的表达和定位

本研究旨在探索Wnt3a在羊驼皮肤中的表达与定位.以不同毛色的成年羊驼为研究对象,应用荧光定量PCR技术分析不同毛色羊驼皮肤Wnt3a基因的相对表达量,并运用Western blotting及免疫组织化学法对Wnt3a蛋白在不同毛色羊驼皮肤中进行表达和定位研究.结果:荧光定量PCR结果显示棕色羊驼中Wnt3a mRNA相对表达量是白色羊驼的2.9702倍;Western blotting结果表明,羊驼皮肤组织组蛋白提取物中存在相对分子质量约39 ku的产物,棕色羊驼皮肤平均蛋白表达量显著高于白色羊驼;免疫组织化学结果显示Wnt3a在羊驼皮肤毛囊的根鞘和毛球部呈阳性表达,根据光密度值分析得出Wnt3a在棕色和白色羊驼毛囊中的表达差异显著(P＜0.05).通过以上研究显示Wnt3a可能与羊驼毛色形成具有相关性.     

催乳素及其受体在青年公羊驼皮肤中分布的研究

羊驼是一种经济价值很高的毛用动物，研究包括激素在内的各种因素对羊驼毛生长的调控极为重要。作者采用基因芯片杂交技术发现青年公羊驼皮肤中不仅存在PRL及其受体基因，而且还存在PRL相关蛋白基因，提示羊驼皮肤是PRL的一个垂体外合成部位，同时羊驼皮肤还可以合成PRL相关蛋白及PRL受体；通过荧光定量分析比较，认为羊驼皮肤合成的PRL是极少量的，垂体是PRL合成的主要部位；通过免疫组织化学技术确定PRL及其受体蛋白主要分布在羊驼毛囊上皮根鞘、表皮、皮脂腺等，提示PRL对羊驼皮肤及其衍生物可能以内分泌、自分泌和旁分泌的方式发挥作用。     

羊驼毛色相关基因研究进展的综述

羊驼毛纤维颜色丰富,具有22种天然色,与其他哺乳动物一样,主要由遗传基因决定。掌握控制羊驼毛色基因的改变,可以有效地控制羊驼毛色的转变。哺乳动物的毛色表型与动物体内黑色素的种类、数量、合成及分布有关。在羊驼皮肤组织中,Agouti基因、MC1R基因、酪氨酸酶基因家族、KIT基因、AIF基因、β-catenin基因、Wnt3α基因、Mitf-M基因、EDNRA基因、EDNRB基因、CDK5基因、PRS5基因、P基因及花斑突变都参与羊驼毛色的形成与调控。综述了羊驼毛色相关基因的研究进展。     

周期素依赖性蛋白激酶-5在不同毛色羊驼皮肤中的表达

本研究旨在探索周期素依赖性蛋白激酶-5(CDK5)在羊驼皮肤中的表达与功能。以不同毛色的成年羊驼为研究对象,采用免疫组织化学法对CDK5在羊驼皮肤中的表达进行定位和定性研究,并利用实时荧光定量PCR技术分析了不同毛色羊驼皮肤CDK5基因的相对表达量。免疫组织化学结果显示CDK5在羊驼皮肤毛囊的外根鞘和毛球部呈阳性表达,根据光密度值分析得出CDK5在不同毛色羊驼毛囊中的表达差异显著(P0.05)。实时荧光定量PCR结果显示棕色羊驼中CDK5mRNA相对基因表达量是白色羊驼的1.6245倍。结果提示CDK5可能与羊驼毛色形成相关。     

microRNAs在动物皮肤及毛囊发育中的调控作用研究进展

基因表达调控是动物被毛生长和发育的决定性因素。microRNA作为一种新发现的基因调控元件,在多种哺乳动物皮肤及毛囊中均有表达,并在转录后水平调节皮肤和毛发的生长和发育过程。从microRNA水平上解析绵羊、山羊及羊驼等被毛生长特点及发生机理,为提高毛用型经济动物的毛发品质和产量提供新的思路,同时也为更深入地研究皮肤组织中microRNA的功能提供更多的理论依据。作者主要针对目前已报道的在绵羊、山羊及羊驼等哺乳动物皮肤及毛囊发育中microRNA的调控作用进行综述。     

羊驼皮肤结构基因（原）胶原的表达特点

为了揭示羊驼皮肤胶原蛋白（Collagen）在皮肤结构发生中的分子机制,本研究通过构建羊驼皮肤cD—NA文库并进行大规模测序分析,结果表明：在羊驼皮肤内发现只有纤维类胶原表达,即typeⅠ,typeⅢ,typeⅤ collagen,其中typeⅠ表达最高,typeⅢ和typeⅤ表达低;然而,在羊驼皮肤内未发现各类collagen相对应的原胶原（procollagen）,其成员procollagentype Ⅰ,typeⅢ,typeⅣ,typeⅥ,typeⅦ,typeⅩⅧ在表达,且typeⅠ远远高于其他家族成员的表达,由此推断collagen和procollagentypeⅠ在羊驼皮肤结构发生中起主要作用,羊驼皮肤内的蛋白水解机制可能使procollagen产生不同类型的collagen。