胰蛋白酶抑制剂SKTI3基因的克隆及其植物表达载体的构建

以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因SKTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654 bp,与已发表的SKTI3基因序列同源性达99%。将目的基因片段插入到pB I121 35S启动子下,构建重组质粒pB ISKTI3,采用冻融法将该重组质粒转入农杆菌EHA105中,获得了植物表达载体。     

胰蛋白酶抑制剂SKTI3基因的克隆及其植物表达载体的构建

以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因SKTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654 bp,与已发表的SKTI3基因序列同源性达99%。将目的基因片段插入到pB I121 35S启动子下,构建重组质粒pB ISKTI3,采用冻融法将该重组质粒转入农杆菌EHA105中,获得了植物表达载体。     

大豆胰蛋白酶抑制剂KSTI3基因的克隆及其植物表达载体的构建

以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因KSTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654 bp,与已发表的KSTI3基因序列同源性达99%。将反义 正义基因片段插入到pBI121 35S启动子下,构建重组质粒pBIKSTI3。通过冻融法将该重组质粒转入根癌农杆菌EHA105中,获得了植物表达载体。     

Bt基因的克隆及植物表达载体的构建

试验将从质粒pB110上克隆得到的Bt基因的片段,连接到高效的植物表达载体质粒pBI121上,此重组质粒经过限制性内切酶酶切分析和PCR鉴定,证明含有抗虫基因的植物表达重组质粒已构建成功。     

豇豆胰蛋白酶抑制剂基因转化花椰菜的研究

通过根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导,将豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因导入花椰菜无菌苗的下胚轴和子叶中,卡那霉素(Kan)的筛选质量浓度为15mg／L,抑制农杆菌生长的抗生素选用羧苄青霉素(carbencillin),质量浓度为500mg／L,对所获得的转基因植株进行PCR扩增,结果显示大多数为阳性;FCR-Southern及Southern分子检测分析,结果证明CpTI基因已被整合到花椰菜植株的基因组中,转基因植株叶片的离体饲虫初步试验结果表明,埘鳞翅目害虫菜青虫的生长发育育一定的抑制作用。     

根癌农杆菌介导的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因转化芥菜的研究

为得到具有较强抗虫性的新的芥菜种质资源，用农杆菌介导将豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因导入芥菜，获得了Kan抗性植株。经PCR扩增、PCR-Southern blot和Northern blot分析，转化再生植株大部分呈阳性，而非转化的再生植株均为阴性，证明CpTI基因已存在于芥菜基因组中。在室内进行了喂虫试验，结果表明转基因芥菜抗虫性明显高于对照，转基因植株之间存在抗虫性差异。     

拟南芥AAP1基因的克隆及植物表达载体的构建

拟南芥氨基酸透性酶1(AAP1,也叫NAT1)是植物中第一个被分离的氨基酸转运蛋白,在拟南芥主根、侧根、根毛及根表皮细胞中均有增加氨基酸含量的作用。本研究利用RT-PCR的方法,从拟南芥中克隆了该基因,测序结果与GenBank(NM-104616.4)中已发表的拟南芥AAP1(AtAAP1)基因的同源性高达99.93%;并将AtAAP1基因与pCAMBIA3300构建p3300-AAP1植物表达载体,为过表达AtAAP1基因,提高作物氨基酸含量,从而改善作物氮素利用效率提供参考。     

水稻耐盐相关基因ZRP4的克隆及其植物表达载体的构建

采用RT-PCR技术克隆了水稻O-甲基转移酶ZRP 4基因的cDNA片段,并进行了序列测定与分析。结果表明,该序列全长1 101 bp,编码366个氨基酸,与G enB ank中水稻ZRP 4基因序列比对,核苷酸同源性为99.8%,氨基酸同源性为99.7%。将克隆片段插入中间载体pBPFΩ7,经H indⅢ酶切回收带有P 35s启动子和nos终止子片段,连接pCAM B IA 1301载体,成功构建ZRP 4基因的植物表达载体。     

籼稻VQ6基因的克隆与植物表达载体构建

采用CTAB法提取籼稻的基因组DNA;根据TIGR数据库中Os VQ6基因序列设计合成特异性引物,通过PCR扩增成功地获得了籼稻Os VQ6基因。该基因具有VQ结构域,其编码区全长为351 bp,编码116个氨基酸残基。经T载体连接转化后测序,进一步构建了Ca MV 35S启动子驱动Os VQ6基因的植物表达载体p SN1301-Os VQ6。     

小麦DREB基因的克隆及植物表达载体构建

脱水应答元件结合蛋白在高等植物应答干旱、高盐和低温胁迫中发挥重要的作用。根据GenBank中小麦(Triticum aestivum L.)DREB基因的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术从小麦中克隆了DREB基因837 bp的编码区。为进一步研究小麦DREB基因的功能,以pMD18-T-DREB质粒为模板,PCR扩增DREB基因片段,构建了该基因的植物表达载体。经菌液PCR和测序鉴定后,转化到农杆菌LBA4404中,为通过转基因技术深入研究小麦DREB基因的功能奠定了基础。     

水稻SLR1基因的克隆及其植物表达载体的构建

[目的]为研究水稻中的SLR1蛋白的功能及寻找与其相互作用的GA信号转导蛋白奠定基础。[方法]以水稻品种日本晴基因组DNA为模板,根据水稻SLR1基因cDNA序列设计1对特异引物进行PCR扩增,回收PCR产物连接到pGEMT载体中,经筛选得到水稻SLR1基因的克隆pGEMTSLR。最后采用酚仿抽提和乙醇沉淀的方法构建水稻SLR1基因的正义和反义表达载体。[结果]通过PCR扩增获得了约为1.9kb的特异片段。回收PCR产物,将克隆片段和pGEMT载体连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,重组克隆经酶切鉴定后提取重组质粒pGEMTSLR1。该研究成功构建了SLR1基因的正义表达载体pCAMSLR(约0.7kb)和反义表达载体pCAMASLR(约1.2kb)。[结论]采用冻溶法可将表达载体pCAMSLR和pCAMASLR导入农杆菌并进行水稻的遗传转化。利用SLR1基因的正义和反义表达载体,可观察转基因植株中该基因的表达上调和下调对植物的影响。     

拟南芥CBF3基因克隆和植物表达载体的构建

[目的]克隆拟南芥CBF3基因并构建植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-CBF3。[方法]从模式植物拟南芥中克隆分离出转录因子CBF3与逆境诱导型启动子Rd29A的DNA序列,构建植物表达载体。[结果]克隆得到的CBF3与GenBank数据库所公布序列比对发现,同源性达到100%,全长为750bp;克隆克隆得到的Rd29A与GenBank数据库公布序列比对发现,同源性达到100%,全长为1425bp。[结论]以双元载体pCAMBIA1301为基础,植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-CBF3被成功构建,对提高植物耐盐、耐旱和耐寒性有很大帮助。     

加工番茄PG基因片段的cDNA克隆及表达载体构建

从加工番茄红熟果实中提取总RNA,根据已发表的多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因的序列设计合成一对特异引物,经过反转录PCR,扩增出一条697bp的目的片段。通过TA克隆,把它连接到pMD18-T vector上,测序鉴定其正确性。扩增片段经Sal I和Sma I双酶切插入到表达载体pBinAR CaMV 35S启动子和OCS终止子之间,用M13测序引物和目的片段引物进行PCR扩增鉴定,构建成含有PG基因片段的反义表达载体pBinAR-aPG,为进一步对加工番茄的遗传转化奠定了基础。     

转录因子DREB1A基因的克隆及植物表达载体的构建

研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用。根据GenBank中登录的DREB1A基因的序列设计引物,用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,利用基因重组技术成功构建了植物表达载体pCAMB1A1300-DREB1A。该结果为进一步利用DREB1A基因做遗传转化研究奠定了基础。     

矮牵牛PhDFR基因和抗除草剂Bar基因植物表达载体的构建及对烟草的遗传转化研究

[目的]构建矮牵牛PhDFR基因的植物表达载体,并对烟草进行遗传转化。[方法]从不同花色的矮牵牛中克隆了2个PhDFR基因,通过目的基因序列克隆、多步载体酶切、连接、转化等技术手段,将其连入通用植物表达载体pCAMBIA2300及pCAMBIA3301。利用冻融法将重组质粒导入农杆菌GV3101继而转化烟草。[结果]构建了含卡那霉素抗性筛选标记基因NPT11和除草剂抗性筛选标记基因Bar的GFP融合蛋白植物表达载体pCAMBIA2300-PhDFR-GFP和pCAMBIA3301-PhDFR-GFP。转基因植株的GUS染色结果进一步验证了所构建表达裁体的正确性和实用性。[结论]所构建的表达载体为进一步研究PhDFR基因在植物花色调控效应的功能及开展植物花色改良基因工程研究奠定了基础,为植物基因工程科研工作提供了优良的备选植物表达我体。     

FaDREB1基因RNAi的植物表达载体的构建

以pMD18-T-FaDREB1为基础,构建了由35s启动子调控的FaDREB1基因RNAi的植物表达载体pART27-FaDREB1(1)-FaDREB1(2),并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LB4404中。对于研究RNAi的机理和应用以及研究DREB类转录因子基因的功能和应用具有重要的理论价值。     

甘蔗ACC氧化酶基因的克隆与植物表达载体构建

[目的]为甘蔗的基因工程育种提供理论基础和技术储备。[方法]从甘蔗嫩叶中提取总RNA,根据GenBank中甘蔗ACC氧化酶cDNA序列设计2对引物,利用RT-PCR技术扩增甘蔗ACO cDNA序列。构建甘蔗ACO cDNA正义植物表达载体和反义植物表达载体,并利用含ACC氧化酶基因的植物重组表达载体转化根癌农杆菌感受态细胞。[结果]从甘蔗嫩叶中提取总RNA的OD260/OD280为1.90,说明提取RNA完整性好、纯度高,完全可满足cDNA逆转录的要求。所获得的甘蔗ACC氧化酶cDNA序列全长为969bp,与GenBank中甘蔗ACOcDNA的核苷酸序列同源性为98.6%,氨基酸序列同源性为97.5%。成功构建了正义植物表达载体pBIaco和反义植物表达载体pBIantiaco,并将其导入根癌农杆菌EHA105中。[结论]该研究为研究该基因的功能和培育甘蔗转基因新种质资源奠定了基础。     

毛栓菌漆酶基因克隆及其酵母表达载体的构建

[目的]研究毛栓菌漆酶基因克隆及其酵母表达载体的构建,为研制高品质酶制剂,实现其工业化生产和规模化应用奠定了基础。[方法]以毛栓菌总RNA为模板,通过RT-PCR克隆去信号肽的漆酶基因;通过BLAST比对,对毛栓菌漆酶基因序列的同源性进行分析;对质粒pPIC9K进行EcoRⅠ和NotⅠ进行酶切,构建其酵母表达载体p9K+Lac。[结果]去信号肽的漆酶基因编码框全长为1 512bp,编码506个氨基酸,分子量为54 KDa;毛栓菌漆酶基因与NCBI中提交的毛栓菌基因序列同源性达到了99%。[结论]通过RT-PCR得到了漆酶基因全长,重组毕赤酵母表达载体p9K+Lac的构建是完全正确的。     

尾穗苋凝集素（ACA）基因植物表达载体的构建

尾穗苋凝集素（Amaranthus caudatusagglutin in,ACA）是一种存在于尾穗苋种子中的贮藏蛋白,属苋菜凝集素家族,对同翅目害虫如蚜虫、褐飞虱、叶蝉等有明显的致死作用。植物表达载体pCAMB IA2300-35S-OCS带有35S启动子及终止序列、卡那霉素（Kan）抗性基因NPTⅡ。载体pGEMT-ACA含有ACA基因,通过PCR扩增出ACA基因。把植物表达载体pCAMB IA2300-35S-OCS和扩增后的ACA基因用KpnⅠ和SalⅠ双酶切后经连接酶连接,得到植物表达载体pCAMB IA2300-ACA。将该载体分别导入农杆菌GV3101和LBA4404进行保存。