红鳍东方鲀SREBP-1和SREBP-2基因克隆及表达分析

为了研究红鳍东方鲀SREBP-1和SREBP-2基因的功能及在脂肪代谢中的分子机制,从红鳍东方鲀脂肪组织提取总RNA,反转录获得c DNA模板,利用设计的引物PCR扩增获得SREBP-1和SREBP-2开放阅读框(ORF),SREBP-1基因ORF区的c DNA序列长度为3 330 bp,编码1 109个氨基酸,SREBP-2基因ORF区的c DNA序列为3 444 bp,编码1 147个氨基酸。实时荧光定量PCR检测SREBP-1基因在红鳍东方鲀不同组织中的表达特征,结果表明,SREBP-1在脑组织中表达丰度最高,其次为眼、脂肪组织、肠、鳃、脾脏、心脏及肝脏,在肌肉中表达丰度最低。将SREBP-1连接到原核表达载体p ET32a上,利用IPTG对重组质粒p ET32a-SREBP-1在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达,SDS-PAGE电泳显示在141 k Da处有特异性的条带出现。     

超声波辅助农杆菌介导SeNHX1基因转化紫花苜蓿的研究

为建立高效快速的紫花苜蓿遗传转化体系,以紫花苜蓿6个栽培品种为材料,采用超声波辅助农杆菌介导法,对影响紫花苜蓿遗传转化体系的若干因素进行了研究。结果显示,6个栽培品种对卡那霉素敏感性不同,维多利亚为40 mg/L,而其他5个品种为50 mg/L;通过梯度实验表明：根癌农杆菌侵染浓度OD600为0.4~0.5,侵染时间为10~15 min,超声波处理时间为10 min是实现紫花苜蓿子叶转化及抗性愈伤组织形成较为有利的组合。卡那霉素抗性愈伤组织DNA的PCR扩增显示,转化体和质粒DNA分别扩增出长度大约为546 bp的清晰条带,初步表明耐盐SeNHX1基因已整合至紫花苜蓿愈伤组织中。     

片球菌素基因的克隆及表达

从乳酸片球菌中提取质粒DNA作为模板,根据GeneBank公布的细菌素结构基因,设计一对特异性引物,进行PCR扩增片段,将该片段定向克隆到pTA2载体,测序,与发表的基因序列比较,同源性为100%,然后克隆到表达载体Pet-28a,转化到Escherichia coli DH5α,经过卡那霉素平皿筛选,质粒酶切,PCR两步验证,获得阳性重组质粒,并转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,以异丙基硫代-βD-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Tricine-SDS-PAGE电泳,显示在4 600 Da处出现条带,与已报道的细菌素分子量大小符合.表达产物对单核细胞增多症李氏杆菌有抗菌作用.     

郁金香主要病毒的分子检测研究

本研究以新疆郁金香种植区植株和进口种球为材料,利用特异性引物,对侵染郁金香的主要病毒黄瓜花叶病毒(CMV)、碎色病毒(TBV)的一步法RT-PCR分子检测技术进行了初步研究。根据两种病毒的基因序列,合成了两对特异性引物,并对RT-PCR中的引物浓度、退火温度和反应循环数等因素进行了筛选和优化。研究显示,阳性对照和带病毒植株均扩增出了与预期大小一致的特异性条带,而健康植株无任何扩增产物。一步RT-PCR的最佳反应体系为:模板RNA 1μL,2×1 Step Buffer 25μL,上、下游扩增引物各1μL,Prime Script 1 Step Enzyme Mix 2μL,加RNase Free dd H2O至50μL。黄瓜花叶病毒(CMV)和碎色病毒(TBV)特异性引物的最佳反应程序:c DNA合成50℃30 min;预变性94℃2 min,变性94℃30 s,退火(CMV)56℃/(TBV)52℃30 s,然后72℃延伸l min,30个循环,最后72℃延伸10 min。实验表明,种植区内栽培一年的郁金香植株部分已被CMV和TBV侵染,其中还有复合侵染的现象存在。本研究建立了基于核酸水平的高灵敏度的一步RT-PCR法郁金香病毒检测技术,能准确的检测出植株中的TBV和CMV,适用于郁金香黄瓜花叶病毒(CMV)、碎色病毒(TBV)的鉴定和检测,为脱毒组培苗的检测和脱毒体系的建立提供理论依据和技术支撑。     

甜瓜种质鉴定的高效引物(引物组合)适用性分析

以30份甜瓜种质资源为材料,采用RAPD(random amplified polymorphic DNA)、DAMD(directed amplification of minisatellite-region DNA)和SRAP(sequence-related amplified polymorphism)3种分子标记构建各自的DNA指纹图谱。针对图谱上扩增的条带分子量大小和分布,用统计软件逐一聚类,根据不同引物(引物组合)所得聚类图鉴别的品种数目,筛选出高分辨率的4个RAPD引物、3个DAMD引物和6个SRAP引物组合。同时,利用高效引物(引物组合)评价了甜瓜遗传多样性,将30份甜瓜分为薄皮和厚皮两类,厚皮甜瓜包括网纹和无网纹两种类型。     

小麦籽粒2A染色体PPO基因新分子标记的开发与应用

参照位于小麦2B染色体上的多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase)基因保守区序列(GenBank:AB254804)设计引物,以一组籽粒PPO活性两极端材料为扩增模板进行筛选,并以195份中国微核心种质材料对其有效性验证,旨在开发小麦籽粒PPO基因新分子标记。在设计的引物中,编号为F-4的引物PCR产物在籽粒PPO活性处于两极端的12份小麦品种中表现出规律性极强的多态性,在籽粒PPO活性极高的6个小麦品种扩增出了1条带(a),在籽粒PPO活性极低的6个小麦品种扩增出了3条带(a,b,c)。利用195个微核心种质材料对引物F-4进行有效性验证,其中123个材料扩增出了一条带(a带),其PPO均值为246.22A475U/(min·g·103),剩下的72个材料都扩增出3条带(a,b,c);其PPO活性均值为155.95A475U/(min·g·103);比前者低90.27A475U/(min·g·103),差异显著。在此基础上利用一套中国春缺体将b条带定位于2A染色体上。扩增序列Blast分析发现,b序列与EF070148序列(2Ab)重合区域为99%,相似达99%,基本可以认定为同一序列;a序列与EF070149序列(2Da)重合区域达99%,相似为98%,基本可以认定为同一序列。位于小麦2A染色体上的PPO基因分子标记F-4可以在小麦PPO活性分子育种中加以应用。     

植物病原菌诱导表达载体构建及在烟草中的瞬时表达研究

根据GenBank中植物病原物诱导型启动子碱基序列设计引物,以烟草基因组DNA为模板,扩增PPP3启动子。用PPP3替换pCAMBIA1301中与gus基因相连的35S启动子,构建重组质粒pCOMBIA ＋PPP3＋gus后导入农杆菌GV3101。通过农杆菌介导的瞬时表达技术将受PPPs控制的gus基因导入烟草。分别接种青枯菌和水杨酸24 h后,烟草叶片中检测到gus基因转录效率分别提高了27．94,17．69倍。表明PPP3启动子具有本底表达水平低、诱导表达活性强的特点。     

PVX介导的槟榔坏死环斑病毒CP蛋白在烟草中的表达和纯化

槟榔坏死环斑病毒(areca palm necrotic ringspot virus, ANRSV)是新发现的一种槟榔黄化病致病病毒。本研究利用马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)表达载体pgR107,在烟草中表达ANRSV的外壳蛋白(coat protein, CP),旨在分离纯化该蛋白并开展对病毒蛋白的功能研究和利用该蛋白制备多克隆抗体。为方便纯化,将8肽Strep蛋白标签序列融合到ANRSV-CP编码基因的3'端,利用In-Fusion无缝克隆策略将其克隆到PVX载体,构建重组表达质粒PVX-ANRSV-CP-Strep。采用电转化法将质粒PVX-ANRSV-CP-Strep转入根瘤农杆菌GV3101中,通过农杆菌介导注射侵染接种本氏烟,14 d后对收集的16 g表达ANRSV-CP-Strep蛋白、PVX侵染的本生烟草样品进行了蛋白提取,采用SDS-PAGE和Western blot检测ANRSV-CP-Strep蛋白的表达情况。测序结果显示植物病毒表达载体PVX-ANRSV-CP-Strep构建成功。经Strep-Tactin~?XT High Capacity亲和层析柱纯化,SDS-PAGE和Western blot检测结果显示ANRSV-CP-Strep重组蛋白可通过PVX载体在烟草中有效表达,其表达量为22μg/g (鲜叶质量)。本研究为后续利用该蛋白制备多克隆抗体并建立ELISA方法进行病毒检测提供了理论依据。     

小麦光腥黑粉菌对小麦三种防御酶活性的影响

为明确小麦光腥黑粉菌侵染小麦后对小麦茎、叶、穗部防御酶活性的影响,本研究以高感小麦光腥黑穗病品种'东选3号'和高抗小麦矮腥黑穗病品种'伊农18/兰考矮早8号'为供试材料,测定小麦被光腥黑粉菌侵染0～6 d后,小麦的过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧歧化物酶(SOD)的活性变化.研究表明,两个小麦品种的防御...     

马铃薯双抗病毒转基因技术初步研究

针对马铃薯生产中存在的病毒型退化和转基因本身存在的生物安全性问题,把新近发展迅速的RNA干扰技术和无标记转基因技术引入植物抗病毒基因工程,培育生物安全型抗多病毒转基因马铃薯,探索一条多抗甚至多免疫的生物安全型转基因新途径。通过农杆菌介导,将抗马铃薯X病毒和Y病毒的RNA干扰型基因结构转入马铃薯大西洋、克新1号等新疆主裁栽培品种,通过PCR检测获得对X病毒和Y病毒具有双重高抗或免疫的无标记基因的高生物安全型转基因马铃薯植株。最终,通过多次筛选试验,确定了农杆菌OD600为0.3~0.5时为宜,但以0.5最佳,预培养2 d,侵染时间为10 min,共培养2~3 d的最佳转化条件。通过特异性引物PCR扩增,部分再生植株得到与阳性对照一致的目的条带,初步确定RNAi基因已整合到马铃薯基因组中。本研究获得的抗病毒无标记转基因马铃薯,其目的基因为RNA干扰型结构,转基因植株的抗性是RNA沉默的结果。由于所转基因的m RNA已经降解成小片段,转基因植株不存在标记基因,规避了目的基因和标记基因潜在的生物安全性问题。     

山豆根基因组DNA高效提取方法的建立与优化

为了探寻优化山豆根DNA提取的方法,本研究以山豆根的叶片为材料,用3种改良的CTAB法提取山豆根DNA,并将提取的DNA经分光光度计和电泳检测,用于cpDNA引物筛选试验,找出最有效的山豆根DNA提取方法。结果显示,高PVP和β-巯基乙醇提取法和样品预处理法可用于提取山豆根基因组DNA。其中,样品预处理法山豆根DNA的效果最好,提取DNA浓度高、质量好,引物筛选结果条带清晰且单一。本研究建立了山豆根高质量的DNA提取方法,为进行分子生物学研究提供支持。     

航天搭载小麦种子SP3代的遗传变异分析

为探讨航天搭载对小麦籽粒的诱变效应,给航天诱变育种提供理论支持,本研究利用酸性聚丙烯酰胺电泳和SRAP技术对航天搭载小麦品种白硬冬2号SP3 代种子的醇溶蛋白和基因组DNA进行了分析,结果表明航天诱变能够诱发醇溶蛋白和基因组DNA发生变异。在15个SP3代材料中,有8个材料的醇溶蛋白组成发生了变异,醇溶蛋白四个分区对航天诱变的敏感程度不同,以ω区最为敏感,产生的变异最多。利用25对SRAP引物对15个SP3代材料的基因组DNA变异进行了分析,共扩增出227条多态性条带,15个小麦航天诱变后代材料与对照间的遗传相似系数为0.821-0.937。     

抗凋亡融合蛋白PTD-Bcl-xL原核表达载体的构建及表达纯化

人工抗凋亡蛋白PTD-Bcl-x L能保护多种因素引起的细胞异常凋亡,为了获得高纯度Bcl-x L与PTD(Protein transduction domains)的融合蛋白,首先采用TRIzol法提取SD大鼠肝脏总RNA,将RNA反转录为c DNA,设计引物以c DNA为模板,PCR扩增Bcl-x L基因,构建p UM19-T-Bcl-x L质粒,并对质粒双酶切鉴定和测序鉴定;其次设计包含PTD序列的Bcl-x L引物,以测序正确的p UM19-T-Bcl-x L质粒为模板,PCR扩增PTD-Bcl-x L序列,将扩增序列克隆入p ET28a载体,构建PTD-Bcl-x L蛋白的原核表达质粒p ET28a-PTD-Bcl-x L,并对p ET28a-PTD-Bcl-x L载体双酶切鉴定和测序鉴定;将p ET28a-PTD-Bcl-x L重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对IPTG诱导融合蛋白表达的浓度和诱导时间进行了优化;SDS-PAGE分析表达蛋白的可溶性情况,在变性条件下用Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白;最后用SDS-PAGE、Western Blot及质谱对融合蛋白进行鉴定。结果表明:双酶切p UM19-T-Bcl-x L质粒出现约774 bp大小条带,p UM19-T-Bcl-x L质粒测序结果与NCBI数据库比对序列一致,表明成功构建p UM19-T-Bcl-x L质粒;双酶切p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒出现约744 bp大小条带,p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒测序结果与预期序列一致,表明成功构建了p ET28a-PTD-Bcl-x L原核表达载体;在IPTG诱导下p ET28a-Bcl-x L重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出36 k Da大小蛋白,最优IPTG诱导浓度为0.1 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为6 h;SDS-PAGE电泳显示融合蛋白主要出现在菌液超声后的沉淀里,以包涵体形式表达,经Ni-NTA琼脂纯化获得了高纯度的融合蛋白;Western Blot和质谱鉴定证明IPTG诱导表达蛋白和纯化的融合蛋白为PTD-Bcl-x L蛋白。纯化得到了PTD-Bc L-x L融合蛋白,推进了PTD-Bcl-x L蛋白在猪、牛等家畜精液冷冻保存的应用进程。     

小麦幼胚生长点转化的研究初报

本研究以日龄1~3 d及7 d的小麦幼胚为受体,利用携带GUS基因的农杆菌LBA4404侵染,恢复培养至3~5叶期时,取第三叶进行GUS组织化学染色分析;并做两个优化对比处理:(1)抽真空处理:在侵染过程中,0.1 MPa抽真空2 min;(2)干燥处理:在共培养阶段,将幼胚转入铺有干燥无菌滤纸的平皿中。结果表明:GUS瞬时表达率随日龄增加而降低,以2~3 d龄的幼胚为最高;抽真空和干燥处理均能显著提高GUS瞬时表达率。最终,在优化处理条件下,获得77株转化苗中,40株第三叶GUS染色显示阳性,高达57.14%。进一步提取GUS阳性小麦叶片基因组DNA,进行PCR扩增,有6株转化苗扩增出目的条带,转化率为7.79%。初步说明以小麦幼胚的生长点作为转化受体是可行的。     

罗田八个主栽板栗品种的SSR鉴别

湖北省罗田县是中国著名的板栗(Castanea mollissima BL.)之乡,栽培的板栗品种多,这些品种仅依据形态特征难于准确区分。本研究以该地8个主栽板栗品种为研究对象,分别以嫩叶、老叶及树皮为材料提取DNA,然后进行SSR标记分析,以建立品种的分子标记识别卡及鉴别体系。结果表明,嫩叶、老叶及树皮三种材料提取的DNA均可用于SSR实验;13对SSR引物对8个品种共扩增出了115条带,其中,多态性条带98条,多态性带百分率85.22%;建立了各品种的SSR标记识别卡;两两品种间的遗传相似系数在0.47～0.82之间;构建了基于遗传相似系数的品种遗传关系聚类图,在遗传相似系数0.47处,可将这8个品种分为2组;依据SSR分子标记,13对引物中,有3对引物可以单独将8个品种完全区分开,用引物S13的SSR标记编制了8个板栗品种的鉴别检索表。研究结果为这些品种的推广应用及进一步遗传育种提供了科学依据。     

芸薹属SSR标记e-PCR与云南省芥菜型油菜种质遗传多样性分析

云南芥菜型油菜种质资源丰富,为整理前人搜集的275份芥菜型油菜种质材料亲缘关系与评估电子PCR技术(e-PCR)的实用性,本研究利用搜集的17 713对公开发表的芸薹属作物SSR标记在芥菜型油菜参考基因组和cDNA序列中进行e-PCR分析后挑选引物进行群体PCR分析。e-PCR分析结果显示8 016对预期有扩增产物,共计扩增37 272个位点,平均每对引物扩增4.65个位点;其中336对引物在基因组与cDNA序列均预期扩增2个位点。从336对引物中随机挑选合成20对预期扩增位点覆盖全基因组的SSR标记组合进行群体分析,PCR电泳结果共检测出63个条带,每对引物多态性片段为2～5个,平均每对引物可扩增3.15个条带;标记PIC值变化范围0.03～0.69,平均PIC值0.45,结果符合e-PCR分析预期。群体遗传聚类分析结果表明,云南芥菜型油菜的亲缘关系并不完全与地域性相关,少数来源不同地区的材料也可聚成一类;275份材料可在遗传相似系数为0.70处被划分为八大类群,95份原始记录信息缺失的种质材料大多位于第Ⅷ大类。本研究同时从分子标记层面理清了275份芥菜型油菜种质材料亲缘关系,验证了...     

花粉管通道法转化小麦影响因素的研究

以西农1376和中13小麦品种(系)为受体,携带叶片衰老抑制基因PSAG12-IPT的pCMLA35-1质粒为转化载体,对花粉管通道转化法中的基因型、转化时间、质粒DNA 浓度进行了研究。结果表明：不同基因型、转化时间对结实率影响不显著,质粒DNA浓度对结实率影响显著。在0~700 ng/μl范围内,小麦结实率随着质粒DNA浓度的增加而降低,其中质粒DNA浓度300 ng/μl和500 ng/μl与对照相比结实率差异达到显著水平,而700 ng/μl则达到极显著差异。不同基因型的转化率因转化时间和质粒DNA浓度的不同而有所差异,其中西农1376的适宜转化时间为40~80min,适宜质粒DNA浓度为300~500ng/μl,以500ng/μl×40min处理的转化率最高,而中13小麦的适宜转化时间为80~120min,适宜质粒DNA 浓度为300ng/μl。     

草莓抗除草剂bar基因工程菌的构建及其检验

为探索草莓抗除草剂bar基因转化高效方法,试验利用三亲杂交法,将构建的真核表达载体pBI121-bar转入根癌农杆菌菌株LBA4404,对菌落PCR、质粒PCR和质粒双酶切产物进行电泳检测．用构建的工程菌转化草莓试管苗。研究结果表明,真核表达载体pBI121-bar被成功转入根癌农杆菌LBA4404;草莓试管苗工程菌侵染最佳浓度菌液OD600值为0．5,脱菌Cef适宜浓度200mg／L;已筛选出草莓抗除草剂bar基因抗性芽。     

根瘤农杆菌基因工程

根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是一类存在于土壤中的革兰氏阴性植物病原菌。根瘤农杆菌通过Ti质粒上的一系列vir基因表达毒性Vir蛋白将其自身的转移DNA(T-DNA)转移整合到植物基因组,进而达到侵染植物的目的。基于这一基因转移功能,改造后的根瘤农杆菌被广泛应用于植物基因工程。本文重点回顾了以在植物基因工程领域应用根瘤农杆菌为目的对根瘤农杆菌基因组进行的遗传改造。这些改造包括T-DNA区的卸甲,双元载体的应用,其他基因组基因的敲除等。通过回顾和展望为进一步在植物基因工程中应用根瘤农杆菌提供新的研究思路。     

半巢式RT-Realtime PCR检测马铃薯Y病毒脉坏死株系

马铃薯Y病毒脉坏死株系(Potato virus Y,PVYn)是马铃薯中一个非常重要的病毒病害.本文根据PVYn基因组中RNA依赖的RNA聚合酶基因序列保守区域,设计合成了3条巢式PCR引物和1条TaqMAN荧光探针,建立了半巢式RT-Realtime PCR检测PVYn的新方法.该方法采用E.Z.N.ATM陕速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR和TaqMAN探针检测技术.第二步半巢式RT-Realtime PCR既是对第一步信号的进一步放大,也是对第一步PCR产物的确认,因此,检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、Real time PCR等方法高.实验结果表明,该方法检测灵敏度可达4fg/μL植物总RNA.