I群禽腺病毒血清4型广东株的分离鉴定及分子特性

[目的]对广东地区疑似心包积液–肝炎综合征患病鸡进行腺病毒分离鉴定并研究其分子特征.[方法]采集的病料样品,通过鸡胚有限稀释法经SPF鸡胚传代分离纯化病毒,进行致病性试验,并对病毒的hexon、fiber-2、ORF19和ORF29基因进行PCR扩增,分析其分子特征.[结果]hexon基因序列分析显示此次分离的毒株为Ⅰ群禽腺病毒血清4型(命名为WM-XC株),SPF鸡接种分离毒株后,致死率达90%,死亡鸡只出现明显的心包积液、肝炎等变化,肝脏病理切片可观察到明显的嗜酸性包涵体,显示分离毒株具有致病性.fiber-2基因序列同经典毒株ON1和KR5相应序列的相似性达96.1%和97.0%,与2015年以来国内分离的毒株序列相似性则达到100%;ORF29序列与2013年国内分离到的毒株JSJ13和JN13的相应序列相比存在33个碱基的缺失;WM-XC分离株与2015年以来国内分离毒株序列相同,但相比经典株ON1和KR-5,缺失ORF19序列.[结论]此次从广东地区分离到的血清4型Ⅰ群腺病毒,和近年国内其他地区分离的流行毒株一样,其fiber-2、ORF19和ORF29基因序列与经典毒株差异明显.     

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定与防治

[目的]对新疆疑似肾型传染性支气管炎发病鸡病料进行病毒分离和鉴定.[方法]采用3种不同的治疗方案对发病鸡群进行治疗.[结果]经过处理的病料组织在SPF鸡胚上盲传至第3～4代后,鸡胚出现尿囊绒毛膜增厚,鸡胚卷缩变小、侏儒胚等鸡传染性支气管炎的特征性病变.将收获的病毒液进行电镜观察、病毒中和试验、病毒干扰试验、动物回归试验等证实,分离的3株病毒均属于鸡肾型传染性支气管炎病毒.[结论]电解多维+肾肿散(中药)+阿莫西林组合的治疗效果最好,治愈率达到80;～90;.     

昆仑雪菊对结肠癌细胞株体外抗肿瘤作用研究

[目的]探讨昆仑雪菊中总黄酮粗提取物、纯化物及总多糖对人结肠癌细胞株(HCT116细胞、CACO-2细胞)增殖的抑制作用.[方法]体外培养结肠癌细胞,采用不同浓度昆仑雪菊中总黄酮粗提取物、纯化物及总多糖对其进行干预,MTT法检测细胞生长抑制率,流式细胞仪测细胞凋亡率.[结果] MTT法检测昆仑雪菊中总黄酮粗提取物、纯化物及总多糖对结肠癌细胞株的抑制作用具有浓度和时间依赖性;流式细胞仪检测昆仑雪菊总黄酮纯化物能增强结肠癌细胞株的凋亡率,且剂量与凋亡率呈正相关.[结论]昆仑雪菊总黄酮纯化物抗肿瘤活性优于总黄酮粗提物及总多糖,且对结肠癌细胞株的增殖有明显抑制作用,其作用机制可能与增强细胞凋亡有关.     

虾蛄活性肽的分离与纯化及其对肿瘤细胞凋亡的影响

[目的]为海洋抗肿瘤新药的开发提供候选药物.[方法]以海洋生物虾蛄为原料,采用胰蛋白酶水解提取虾蛄软体组织中的活性多肽,采用超滤、凝胶层析、高效液相色谱等技术对其进行分离与纯化,并选择高表达肿瘤细胞株进行体外抗肿瘤活性评价.[结果]获得纯度较高的活性肽FHOS,此肽的氨基酸序列为Phe Tyr Met Asn His.采用MTT法测得FHOS对PC-3细胞和A549细胞的最高增殖抑制率达到70.1％和90.0％,呈现良好的量效和时效关系.[结论]FHOS具有一定的抑制肿瘤细胞凋亡的活性.     

大孔树脂纯化野山杏总黄酮工艺

[目的]研究优选大孔树脂分离纯化野山杏总黄酮的最佳工艺参数.[方法]采用紫外分光光度法测定野山杏总黄酮含量,利用静态吸附解吸试验分析4种不同型号大孔树脂对野山杏总黄酮的吸附及解吸能力,选出适宜的大孔树脂及其最佳分离纯化条件.[结果]D101型大孔树脂对野山杏总黄酮有较好的比吸附量和解析附能力,最佳分离纯化工艺条件为D-...     

寿光黑鸡成纤维细胞的体外培养与冷冻保存

[目的]建立鸡成纤维细胞的体外培养体系。[方法]用组织块法和消化法分别分离培养鸡皮肤成纤维细胞;比较细胞生长速率及冻存复苏率。[结果]酶消化培养的成纤维细胞原代生长较快,约5 d便可形成单层;2种方法传代细胞的生长速度相似,仅需2~3 d就可形成单层;使用酶消化法和反复贴壁法,经3~4代后,可获得纯化的成纤维细胞;成纤维细胞经冷冻复苏后有75%~80%存活;分离纯化的胚胎和皮肤成纤维细胞的生长曲线均正常,可传至12代,传代后染色体数目不变。[结论]采用组织块法及酶消化法培养鸡成纤维细胞均可获得ES细胞建系所需的饲养层细胞。该研究为ES细胞系的成功建立奠定了基础。     

猪肺血管紧张素转化酶的提取与纯化

[目的]研究猪肺血管紧张素转化酶（ACE）的提纯方法,为其生产利用提供技术支撑.[方法]以新鲜猪肺组织为试验材料,匀浆离心后经硫酸铵分级沉淀透析,然后采用离子交换-超滤离心联合法对猪肺ACE粗提物进行纯化,测定ACE的分子量、酶活力、纯化倍数及酶活力回收率.[结果]通过离子交换-超滤离心联合法分离纯化猪肺ACE,可得到相对分子量182 kDa、酶比活力1.2476 U/mg的电泳级纯品ACE,其纯化倍数达357.31倍,酶活力回收率达12.28％.ACE催化反应动力学米氏常数（Km）为0.849 mmol/L,最大反应速率（Vmax）为9.775 nmol/min.[结论]采用离子交换-超滤离心联合法纯化猪肺ACE能够极大缩短分离与纯化时间,且获得较高的纯化倍数和酶活力回收率,是猪肺ACE的高效纯化方法.     

麦玉轮作农田秸秆降解真菌的筛选与镰刀菌拮抗特性研究

[目的]为推动还田秸秆的降解及农田植物病原真菌的防治更加受到重视.[方法]采用稀释涂平板法从长期秸秆还田土壤中分离纯化具有秸秆降解能力的真菌,对这些真菌的秸秆降解能力进行初步判断,并采用PDA平板拮抗试验探究其中4株镰刀属真菌与其他非致病真菌间的拮抗作用.[结果]共分离纯化得到64种秸秆降解真菌,来自于子囊菌门的7个科...     

C型肉毒梭菌肉毒毒素的抗原性分析

[目的]通过对分离纯化的C型肉毒毒素抗原性分析,提供快速鉴定动物因C型肉毒梭菌中毒的理论基础.[方法]对分离纯化的C型肉毒梭菌的肉毒毒素灭活后通过SDS - PAGE测定浓度,确定浓度后与弗氏佐剂乳化后免疫家兔,免疫结束后采家兔血液并分离血清.[结果]将不同稀释倍数的肉毒毒素经SDS -PAGE电泳分离后,转移至HybondNC膜,家兔三免后提取的血清作为一抗,用二抗进行Western blotting检测,大约在98.0和53.0 kDa处出现特异反应带;抗原与抗体在琼脂凝胶上结合时,会形成清晰的沉淀带.[结论]分离纯化的C型肉毒毒素,经免疫后家兔可见:C型肉毒毒素具有免疫原性和反应原性,抗体的效价为1∶8.     

新生山羊肾小管上皮细胞的原代培养与鉴定

[目的]建立新生山羊肾小管上皮细胞(Renal tubular epithelial cell,RTECs)的分离培养方法.[方法]采集刚出生未哺乳健康山羊的肾脏,分别采用胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ消化法分离培养RTECs,选择孔径0.15 mm的筛网对RTECs进行纯化,观察各组RTECs的生长情况;对分离的RTECs进行免...     

鸡肠上皮原代细胞体外分离培养与鉴定

为了探讨鸡肠上皮原代细胞分离培养方法,进一步研究人源志贺菌对鸡的致病性和为相关侵袭特性提供体外模型,分别取不同日龄鸡胚,用0.1 g/mLⅠ型中性蛋白酶和300 U/mLⅪ型胶原酶联合分离纯化鸡肠上皮原代细胞,筛选其最佳培养方法,并对培养细胞进行鉴定;然后采用0.125％胰酶和0.01％ EDTA联合消化进行鸡肠上皮原代细胞传代.结果显示,应用Ⅰ型中性蛋白酶和Ⅺ型胶原酶消化15日龄鸡胚肠组织可获得满意的肠上皮细胞分离效果,细胞贴壁性良好.培养出圆形或多角形单层生长呈“铺路石样”的细胞,培养的细胞在12 h内贴壁,24 ～48 h明显增殖,72 h后细胞增殖速度减慢,生长状况不良.经透射电镜观察鉴定为肠上皮细胞.且传代后细胞贴壁生长良好.建立的鸡肠上皮原代细胞分离培养方法可获得纯度较高的鸡肠上皮原代细胞,制备的细胞可以连续传代3次.     

一例草鱼肌肉出血病的病原学分析

[目的]确定草鱼(Ctenopharyngodon idellus)中出现的以肌肉出血、脾脏肿大、肠炎、鳔出血为典型症状的疾病的病原,为该病的防治提供参考.[方法]采用病原分离纯化、生理生化试验、16S rDNA检测、系统进化分析、动物回归感染试验等方法对致病菌进行鉴定,采用纸片法确定病原的药敏特性.[结果]分离株为革...     

高温木质素分解菌的分离、筛选及鉴定

[目的]为获得在高温条件下有较强分解木质素能力的菌株.[方法]以马粪为材料,采用BM培养基,经分离、筛选和纯化获得4株高温木质素分解细菌.[结果]通过对木质素分解菌所产生的漆酶、过氧化物酶和锰过氧化物酶3种酶的活性进行测定,筛选出1株产酶活性较高的菌株M-2.采用CTAB法提取目的菌株DNA,经过PCR扩增、纯化,对16S rDNA测序进行鉴定,确定为假单胞菌属的绿脓杆菌.[结论]该研究为木质素分解菌的选育和菌剂的制备提供菌种资源.     

鸡堆型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库的免疫学筛选

[目的]寻找鸡球虫保护性抗原基因,为研究基因功能和研制抗鸡球虫疫苗奠定基础.[方法]将纯化的堆型艾美耳球虫孢子化卵囊于兔皮内多点注射,制备堆型艾美耳球虫抗血清,用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其效价,进行免疫学筛选.利用PCR对获得的阳性克隆进行初步鉴定.[结果]间接酶联免疫吸附试验结果表明堆型艾美耳球虫抗血清检测结果呈阳性,初步筛选到的疑似阳性斑经3次复筛后获得6个阳性克隆,1～3号克隆约为1 000bp,4～6号克隆约为1 500 bp.[结论]对堆型艾美耳球虫孢子化卵囊cD-NA文库获得的阳性克隆成功进行了免疫学筛选.     

育成蛋鸡大肠杆菌病的病理组织学观察

[目的]深入了解鸡大肠杆菌病的病理组织学变化.[方法]试验采用流行病学调查、临床症状观察、病理剖检观察、实验室诊断和石蜡组织切片制作等方法对昌黎县某鸡场发生的一起蛋鸡以心包炎、肝周炎为主要特征的疾病进行诊断和病理组织学观察.[结果]试验分离到的病原菌为大肠杆菌;患病蛋鸡的病理组织学变化表现为:心脏呈心肌细胞变性、炎性细胞浸润;肝脏呈纤维素性肝周炎和坏死性肝炎;脾脏呈淋巴细胞减少、炎性细胞浸润;肺脏呈充血、淤血,肺房内存在红细胞;肾小球毛细血管透明变性;小肠粘膜上皮细胞脱落.[结论]该研究为鸡大肠杆菌病的诊断和防治提供了科学依据.     

美洲锦鳚抗冻蛋白的表达与特性分析

[目的]构建美洲锦鳚抗冻蛋白低温表达体系,为探索寒冷损伤防治的新方法奠定理论基础.[方法]将含美洲锦鳚抗冻蛋白(AFP)基因的重组质粒转化E.coli BL21 (DE3),优化诱导条件,利用亲和层析对重组蛋白His-AFP进行分离纯化,对纯化的蛋白进行质谱(MALDI-TOF-TOF)鉴定.采用邻接法(Neigh-b...     

遵义小钝吻鮠体表黏液抗菌肽的分离纯化

[目的]从遵义小钝吻鮠(Leioxassis microcrassirostris Zunyiensis Xiao sp.nov.)体表黏液中获取高质量的抗菌肽,为提高其先天免疫能力及病害防治效果奠定基础.[方法]采用物理方法收集遵义小钝吻鮠的体表黏液,以5％乙酸进行浸提,采用SephadexG-50和SephadexG-25两步凝胶层析技术对抗菌粗提物进行分离纯化,结合Tricine-SDS-PAGE电泳法进行分离鉴定,并运用牛津杯法和挖孔法进行抑菌试验.[结果]遵义小钝吻鮠体表黏液经乙酸法浸提处理并冷冻干燥,其粗提物呈白色粉末,稀释液蛋白质含量为1755 μg/mL;经SephadexG-50凝胶层析分离,其纯化产物抑菌活性峰主要在峰Ⅱ和峰Ⅲ,抑菌圈直径11.66 mm;再经SephadexG-25凝胶层析分离纯化后出现单一活性峰,其产物为分子量小于4.1kD的抗菌肽,抑菌圈直径12.85mm.[结论]遵义小钝吻鮠无需诱导刺激,可直接采用物理方法收集其体表黏液,以5％乙酸浸提后经SephadexG-50和SephadexG-25两步凝胶层析便可分离出纯度较高的抗菌肽.     

乌昌地区马铃薯黄萎病菌分离与鉴定

[目的]对新疆乌鲁木齐及昌吉多个马铃薯产区范围内的马铃薯黄萎病菌进行分离和鉴定,明确其种类和分布.[方法]采用常规分离培养法分离、纯化菌株,参照Koch's法则回接验证,对确认为马铃薯黄萎病菌的菌株进行形态学鉴定和ITS序列分子鉴定.[结果]引起本地马铃薯黄萎病的病菌有两种:黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum Reinke & Berthold)和大丽轮枝菌(V.dahliae Kleb.),其中,大丽轮枝菌分布范围相对较广,是引起马铃薯黄萎病的主要病原.[结论]明确了乌昌地区马铃薯黄萎病的致病菌株的种类,并获得菌株为开展相关研究奠定基础.     

人C型溶菌酶发酵与分离纯化工艺的研究

[目的]研究毕赤酵母菌株(Pichia GS115)表达人C型溶菌酶(H-LYZ)的发酵与分离纯化的工艺.[方法]探讨酵母生长规律,研究不同菌体浓度、不同诱导时间对蛋白产量的影响,并且探讨不同pH条件对DEAE-SepharseFF和CM-Sepharose FF层析分离纯化目标蛋白的影响.[结果]毕赤酵母菌株表达H-LYZ的最佳发酵条件为:发酵24h用浓度1％甲醇诱导,以后每12 h用浓度1％甲醇诱导,共6次,在此条件下可获得高产量目标蛋白.DEAE-Sepharose FF和CM-Sepharose FF分离纯化目标蛋白的最佳pH分别为6.65和6.50.[结论]该研究可为人C型溶菌酶的工艺化生产提供理论指导.     

小鼠胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、原代培养及鉴定

目的:建立系统可靠的小鼠胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、培养、纯化及鉴定技术,为进一步研究肺纤维化及肺肿瘤等疾病的发病机制奠定基础.方法:应用低质量分数胰酶联合胶原酶的方法消化小鼠胎鼠肺组织块,经差速离心和差速贴壁的方法纯化肺泡Ⅱ型上皮,进行原代培养.用改良巴氏染色法和透射电镜观察对所分离的细胞进行鉴定.结果:每只胎鼠可获得(5±2)×106的细胞产量,细胞活力为95%±2%,纯度达到92%±2%,改良巴氏法镜下观察可见胞质内含较多深色颗粒,透射电镜观察到特征性的嗜锇小体即板层小体和细胞膜上有明显的微绒毛.结论:该方法能成功分离出小鼠胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞,且产量大、纯度高,能满足体外研究的需要.